ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΙΑΤΡΟΔΙΚΑΣΤΙΚΗ Μαρία Γεωργίου Ιατρός και Μοριακή Βιολόγος Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών

DNA: το μόριο της ζωής «…η διπλή σπειροειδής έλικα που βρίσκεται στον πυρήνα των χιλιάδων δισεκατομμυρίων ανθρώπινων κυττάρων, που ζυγίζει λιγότερο από ένα εκατοστό χιλιοστό του γραμμαρίου, που όταν ξετυλιχθεί έχει μήκος ίδιο με του ανθρώπου, που είναι γραμμένη από τριγράμματες λέξεις ενός τετραγράμματου αλφαβήτου και χρειάζονται πεντακόσια βιβλία για να χωρέσουν τις αλληλουχίες της». Κarry Mullis (Νόμπελ στη Χημεία, 1993), στο μυθιστόρημα του «Η ανακάλυψη του ουρανού»,

Η αποδοχή της Mεθόδου Αποτυπώματος DNA (MADNA) από το Δικαστικό σώμα Ο δικαστής Joseph Harris υποστηρίζει ότι η σχετικά νέα αυτή τεχνολογία εξασφαλίζει όλα τα εχέγγυα στην αναζήτηση της αλήθειας, στην απαγγελία της ενοχής στον ένοχο και στην απόδοση της αθωότητας στον αθώο.

Η αποδοχή της MADNA από το Δικαστικό σώμα Ο James E. Strass, καθηγητής των Νομικών και Ιατροδικαστικών Επιστημών του Πανεπιστημίου George Washington και του National Law Centre των ΗΠΑ, πιστεύει ότι «η τεχνική της ανάλυσης του DNA θα είναι από το τέλος του 20ου αιώνα ό,τι ήταν η δακτυλοσκόπηση για τον 19ο αιώνα»

Περιεχόμενα ΜΑΘΗΜΑ 1 Η ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ DNA ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΑΘΗΜΑ 2 ΥΛΙΚΟ, ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ, ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ. ΜΕΘΟΔΟΙ –ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΑΠΟΤΥΠΩΜΑΤΟΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΤΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΣΩΜΑΤΟΣ Ψ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΤΟ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ DNA ΜΑΘΗΜΑ 3. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ DNA ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΟΔΙΚΑΣΤΙΚΗ. ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΠΑΤΡΟΤΗΤΑΣ Η/ΚΑΙ ΜΗΤΡΟΤΗΤΑ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ DNA ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΟΔΙΚΑΣΤΙΚΗ (συνέχεια) ΜΑΘΗΜΑ 4. Η ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ή Ο ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΝΟΧΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΠΤΟΥ Ο ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΤΑΥΤΟΤΗΤΟΣ ΣΕ ΠΤΩΜΑ Η ΤΕΜΑΧΙΑ ΠΤΩΜΑΤΟΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΣΕ ΣΚΕΛΕΤΙΚΑ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΑ ΜΑΘΗΜΑ 5 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΗΣ ΤΑΥΤΟΤΗΤΟΣ ΤΩΝ ΘΥΜΑΤΩΝ ΜΑΖΙΚΩΝ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΩΝ ΜΑΘΗΜΑ 6 ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΟΔΙΚΑΣΤΙΚΗΣ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΜΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΑΛΛΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟ DNA ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΠΑΝΑΚΕΙΑ ΜΑΘΗΜΑ 7 ΝΟΜΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΔΙΛΗΜΜΑΤΑ ΗΘΙΚΗΣ ΚΑΙ ΔΕΟΝΤΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΑΠΟΤΥΠΩΜΑΤΟΣ DNA. ΜΑΘΗΜΑ 8 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ-ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Η ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ DNA 4ο και 5ο π.Χ αιώνα, ο Ιπποκράτης, ο Αριστοτέλης και ο Πλάτωνας περιγράφουν στα κείμενά τους ότι ορισμένα ανθρώπινα χαρακτηριστικά γνωρίσματα φαίνεται να κυριαρχούν και να περνούν από τον γονέα στο παιδί. Το 1665 ο Robert Hook ανακαλύπτει μία δομή που την ονομάζει «κύτταρο». Κυτταρική Θεωρία Στη δεκαετία 1830-1840, ο Robert Brown εντοπίζει τον «πυρήνα». Από το 1856 μέχρι το 1863, ο Mendel ερμηνεύει τον τρόπο που τα ανθρώπινα χαρακτηριστικά μεταβιβάζονται από γενεά σε γενεά Το 1912 οι Sir William Henry Bragg και Sir William Lawrence Bragg, πατέρας και γιός, ανακαλύπτουν ότι, χρησιμοποιώντας τις ακτίνες Χ, μπορούν να «διαβάσουν» την ατομική δομή των κρυστάλλων.

Η ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ DNA 1938. Ο Warren Weaver χρησιμοποιεί τον όρο «Μοριακή Βιολογία» Το ίδρυμα Rockefeller χρηματοδοτεί την ακτίνοκρυσταλλογραφική μελέτη των βιομορίων (W. H. Bragg και W.L. Bragg). Ο Bill Asbury και η Florence Bell διαπιστώνουν ότι τα νουκλεοτίδια: 1. Σχηματίζουν δεξιόστροφη γωνία ως προς τον άξονα του μορίου 2. Η μεταξύ τους απόσταση είναι 3,4 Α, σχεδόν ίδια με την αντίστοιχη (3,3 Α) των αμινοξέων 3. Τα δύο μακρομόρια –DNA και πρωτεΐνη- αλληλοεπιδρούν και επηρεάζουν το ένα το άλλο. DNA: «παρεξηγημένο» και υποβαθμισμένο μόριο

1944: Οι Avery, Macleod και McCarty προτείνουν ότι το DNA θα μπορούσε να λειτουργεί ως φορέας της γενετικής πληροφορίας.

1953. O James Watson και o Francis Crick ανακαλύπτουν τη δομή του DNA.

Rosalind Franklin 1920- 1958 Αριθμός αλύσσεων DNA Διαχωρισμός αλύσσεων Σύνδεση σακχάρου- φωσφωρικής ομάδας στην εξωτερική επιφάνεια του μορίου Σχήμα - μέγεθος διπλής έλικας. Πώς οι βάσεις του DNA ζευγάρωναν στο εσωτερικό της έλικας ???

Η γέννηση της Γενετικής Ιατροδικαστικής

Χρονολογίες- κλειδιά στην εξέλιξη της τεχνολογίας αποτυπώματος DNA 1984. Μεγάλη Βρετανία, Πανεπιστήμιο του Leicester. O Alec Jeffreys και οι συνεργάτες του ανακαλύπτουν τη μέθοδο αποτυπώματος DNA (DNA fingerprinting). 1985. Μεγάλη Βρετανία. Η αστυνομία χρησιμοποιεί για πρώτη φορά τα αποτελέσματα της μεθόδου αποτυπώματος DNA για την αναγνώριση σκελετικών υπολειμμάτων ενός αγνοουμένου από 15ετίας κοριτσιού.

. ,

Χρονολογίες- κλειδιά στην εξέλιξη της τεχνολογίας αποτυπώματος DNA 1986. Ο Karry Mullis ανακαλύπτει τη μέθοδο της επιλεκτικής ποσοτικής ενίσχυσης περιοχής-στόχου του DNA, μέσω μιας αλυσιδωτής αντίδρασης καταλυόμενης από DNA – πολυμεράση (polymerase chain reaction). Είναι η γνωστή ως PCR. 1987. Μεγάλη Βρετανία. Ο Robert Melias καταδικάζεται για βιασμό. Είναι ο πρώτος άνθρωπος, παγκοσμίως, που καταδικάζεται, βάσει των στοιχείων που προέκυψαν από τη διερεύνηση της υπόθεσής του μέσω DNA. 1987. Επίσης στη Μεγάλη Βρετανία. Η αστυνομία χρησιμοποιεί την μέθοδο αποτυπώματος DNA στην περίφημη υπόθεση Pitchfork και αθωώνει έναν 17χρονο κατηγορούμενο για δύο φόνους. Προκειμένου να εντοπισθεί ο δράστης, ο Colin Pitchfork, μελετήθηκε το DNA 5000 περίπου ατόμων της περιοχής. 1987, ΗΠΑ. Υπόθεση Tommie Lee Andrews

Χρονολογίες- κλειδιά στην εξέλιξη της τεχνολογίας αποτυπώματος DNA 1989. ΗΠΑ. Ο Gary Dotson είναι ο πρώτος άνθρωπος του οποίου η σε βάρος του καταδικαστική απόφαση αναιρείται, βάσει των στοιχείων μελέτης DNA !989. Αυστραλία. Για πρώτη φορά διεκπεραιώνεται δικαστική υπόθεση, με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης του DNA. Όταν ο κατηγορούμενος για τρεις βιασμούς έρχεται αντιμέτωπος με τα αποτελέσματα αυτά, αλλάζει την κατάθεσή του από το «δεν ήμουν εκεί» στο «ό,τι έγινε, έγινε με τη συγκατάθεση της γυναίκας». 1989. Αυστραλία. Η Ομοσπονδιακή κυβέρνηση και αρκετές Πολιτείες αρχίζουν να εισαγάγουν κανονισμούς, για τον τρόπο συλλογής και χειρισμού του DNA. 1989, Αυστραλία. Υπόθεση Desmond Applebee

Χρονολογίες- κλειδιά στην εξέλιξη της τεχνολογίας αποτυπώματος DNA 1991. Δημοσιεύεται στον επιστημονικό τύπο η μεθοδολογία μελέτης των υπερπολυμορφικών περιοχών του DNA, που αποτελούνται από μικρές διαδοχικές επαναλήψεις (Short Tandem Repeats-STRs) 1992. Αυστραλία. Ανακοινώνεται η λειτουργία του Εθνικού Ινστιτούτου Ιατροδικαστικών Επιστημών. Μεταξύ των αρμοδιοτήτων και των υποχρεώσεών του, είναι η ανάπτυξη εθνικών προδιαγραφών ποιοτικού ελέγχου και διαπίστευσης όλων των εργαστηρίων Γενετικής Ιατροδικαστικής της Αυστραλίας. 1991, Καναδάς, υπόθεση Allan Legere 1993. Ελλάδα. Αρχίζει η οργάνωση του πρώτου εργαστηρίου Γενετικής Ιατροδικαστικής, στο Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. 1994, ΗΠΑ, υπόθεση O.J. Simpson 1994, Ελλάδα. Υπόθεση Chiao Li

Χρονολογίες- κλειδιά στην εξέλιξη της τεχνολογίας αποτυπώματος DNA 1994. Η πρώτη υπόθεση ανθρωποκτονίας, που διαλευκαίνεται μέσω της ανάλυσης DNA στην Ελλάδα. Η ανάλυση του DNA για την αναγνώριση του ατόμου στο οποίο ανήκαν τρία τεμάχια ανθρωπίνου σώματος, που βρέθηκαν σε αγροτική περιοχή της Αττικής, διενεργήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής Ιατροδικαστικής του Εργαστηρίου Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. 1995. Μεγάλη Βρετανία. Αρχίζει η συγκρότηση της πρώτης, σε παγκόσμιο επίπεδο, Εθνικής Τράπεζας γονοτυπικών αποτυπωμάτων 1996. ΗΠΑ. Για πρώτη φορά χρησιμοποιούνται στο δικαστήριο στοιχεία από την ανάλυση μιτοχονδριακού DNA. Ο Paul Ware καταδικάζεται για το βιασμό και τη δολοφονία ενός 4χρονου παιδιού, όταν διαπιστώνεται ότι το γενετικό προφίλ του μιτοχονδριακού του DNA ταυτίζεται με το αντίστοιχο μιας τρίχας, που βρέθηκε πάνω στο σώμα του θύματος. 1998, ΗΠΑ, υπόθεση Richard J. Schmidt 2003, Μεγάλη Βρετανία, υπόθεση Jeffrey Gafoor

Δομή του DNA Δομική μονάδα του DNA είναι το νουκλεοτίδιο, που αποτελείται από ένα σάκχαρο, μία φωσφωρική ομάδα και μία βάση (αδενίνη-Α, γουανίνη-G, κυτοσίνη -C, θυμίνη -T). Το DNA αποτελείται από δύο διπλοελικωμένες δεξιόστροφες πολυνουκλεοτιδικές αλυσσίδες, με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων, που συνδέονται μεταξύ τους, ακολουθώντας του κανόνες της συμπληρωματικότητος (Α-G, C-T)

Ομόλογα χρωματοσώματα Γονιδιακή θέση Ετεροζυγωτία Ομοζυγωτία Παράδειγμα, μεσογειακή αναιμία

Ημισυντηρητική αντιγραφή του DNA

Μεταλλάξεις Κάθε κληρονομήσιμη μεταβολή της αλληλουχίας των βάσεων ενός γονιδίου, εκτός από αυτές που οφείλονται σε ανασυνδυασμό του DNA, αντιπροσωπεύει μία μετάλλαξη (mutation). Οι μεταβολές αυτές μπορεί να επισυμβούν αυθόρμητα (σε συχνότητα 10_-6_) ή να προκληθούν από την επίδραση διαφόρων εξωγενών παραγόντων όπως των ακτίνων Χ, της ραδιενέργειας, της υπεριώδους ακτινοβολίας και των χημικών μεταλλαξιογόνων. Οι τροποποιήσεις αυτές προκύπτουν από αντικαταστάσεις (replacements), απαλείψεις (deletions) ή προσθήκες (insertions) νουκλεοτιδίων στην πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα, διαταράσσοντας την αλληλουχία των βάσεων του γονιδίου Οι μεταλλάξεις αποτελούν την εισαγωγή στην εξελικτική πορεία των ειδών και τη βάση των γενετικών νοσημάτων.

Η έννοια του πολυμορφισμού Μια γονιδιακή θέση (genetic locus) χαρακτηρίζεται ως πολυμορφική όταν το γονίδιο που αντιστοιχεί στη θέση αυτή εμφανίζεται διαφορετικό στα διάφορα μέλη μιας πληθυσμιακής μονάδας. Οι διαφορετικές αυτές μορφές του ιδίου γονιδίου της ιδίας γονιδιακής θέσης στα διαφορετικά μέλη μιας πληθυσμιακής ομάδας ονομάζονται αλληλόμορφα. Τα αλλήλόμορφα όλων των γενετικών θέσεων που ανήκουν σε όλα τα άτομα ενός πληθυσμού αποτελούν τη γονιδιακή δεξαμένή (genetic pool) αυτού του πληθυσμού. Στο μοριακό επίπεδο ο πολυμορφισμός κυμαίνεται από την αλλαγή μιας μόνο βάσης ενός νουκλεοτιδίου μέχρι την αλλαγή ενός αριθμού τυχαία επαναλαμβανόμενων μονάδων πάνω στο DNA (δορυφόροι).

Πολυμορφισμοί Μεγέθους κλάσματος, μετά από τη δράση απαγορευτικών ενδονουκλεασών (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLPs) Μία απαγορευτική ενδονουκλεάση αναγνωρίζει πάνω στο DNA τη συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων που αποτελεί τη θέση δράσης της και τέμνει στο σημείο εκείνο το DNA, δημιουργώντας δύο κλάσματα συγκεκριμένου μεγέθους. Εάν όμως η θέση αυτή αναγνώρισης λείπει ή έχει τροποποιηθεί, π.χ. έχει μεθυλιωθεί, τότε θα προκύψουν κλάσματα DNA διαφορετικού μεγέθους από το αναμενόμενο. Τα κλάσματα αυτά διαχωρίζονται κατά την ηλεκτροφόρηση.

Απαγορευτικές ή περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ενζυμα που μπορούν να αποικοδομούν με ταχύ ρυθμό DNA, εκτός από το DNA του βακτηριδίου από το οποίο απομονώθηκε το ένζυμο. Η διασπαστική δράση των απαγορευτικών ενδονουκλεασών περιορίζεται αποκλειστικά και μόνο σε περιοχή του DNA με καθορισμένη αλληλουχία βάσεων. Για πολλές από αυτές έχει βρεθεί η αλληλουχία βάσεων της ευαίσθητης περιοχής του DNA. Οι περιοχές αυτές διαθέτουν χαρακτηριστικά συμμετρικές αλληλουχίες βάσεων

Παραδείγματα ενδονουκλεασών και αλληλουχίες βάσεων που αναγνωρίζονται από αυτές

2. Πολυμορφισμοί γενετικής θέσης Σποραδικά επαναλαμβανόμενη αλληλουχία βάσεων (μικροδορυφόρο DNA,minisatellite ), που ποικίλλει τόσο μέσα σε μια γονιδιακή θέση όσο και μεταξύ των διαφόρων γονιδιακών θέσεων . -«σποραδικές επαναλήψεις ποικίλου αριθμού βάσεων» (VNTRs) -«σποραδικές επαναλήψεις μικρού αριθμού βάσεων» (STRs) - «σποραδικές επαναλήψεις ενός νουκλεοτιδίου (SNP’s-mt-DNA)

ΥΛΙΚΟ, ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ, ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ-ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ. ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΑΠΟΤΥΠΩΜΑΤΟΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΤΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΣΩΜΑΤΟΣ Ψ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΤΟ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ DNA

Περιγραφή της μεθόδου

ΥΛΙΚΑ Ολικό περιφερειακό αίμα Επιθηλιακά κύτταρα στοματικού βλεννογόνου, σίελος Σπέρμα Θύλακες των τριχών Κύτταρα του αμνιακού υγρού και των χοριακών λαχνών του πλακούντα, Kαλλιέργειες ινοβλαστών Nεκροτομικό υλικό που λαμβάνεται κατά την ιατροδικαστική διερεύνηση της αιτίας του θανάτου.

ΥΛΙΚΑ -συνέχεια Αποξηραμένες κηλίδες αίματος και σπέρματος Νεκροτομικό υλικό εκταφής Ιστοτεμάχια συντηρημένα σε φορμόλη ή σε εγκιβωτισμένα σε παραφίνης ο πολφός των οδόντων ο μυελός των οστών και το οστούν

ΥΛΙΚΑ -συνέχεια κάθε βιολογικό υλικό-πειστήριο όπως π.χ. υπολείμματα σιέλου σε αποτσίγαρα, ή σε φακέλους αλληλογραφίας κλπ

Προβλήματα και Περιορισμοί Τα ιατροδικαστικά δείγματα: είναι διαθέσιμα σε πολύ μικρή ποσότητα δεν υπάρχει δυνατότητα επανάληψης της δειγματοληψίας το DNA που απομονώνεται από παλαιά δείγματα και κυρίως το «αρχαίο DNA», είναι πολλές φορές ποσοτικά και ποιοτικά ανεπαρκές για την πλήρη διερεύνηση ενός ζητήματος

Χειρισμός των δειγμάτων -Ο οποιοσδήποτε χειρισμός των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται με γάντια πλαστικά μιας χρήσεως. Ιδιαίτερα όταν πρόκειται Ιατροδικαστικά δείγματα, τα γάντια πρέπει να αλλάζονται από δείγμα σε δείγμα του ίδιου σκηνικού. Η προφύλαξη αυτή, εκτός από την προστασία του ίδιου του χειριστού από το ενδεχόμενο προσβολής του από βακτηρίδια, που ενδέχεται να εμπεριέχονται στα βιολογικά υλικά, αποσκοπεί κυρίως στην προστασία του DNA του κάθε δείγματος από ρύπανσή του με DNA άλλου δείγματος ή ακόμη και του χειριστού. Το δείγμα, αμέσως μετά τη συλλογή, τοποθετείται σε καθαρό περιέκτη και σφραγίζεται. Η συντήρησή του σε ξηρό και ψυχρό περιβάλλον κρίνεται ως άμεση προτεραιότητα. -Η μεταφορά των δειγμάτων στο αρμόδιο Ιατροδικαστικό Εργαστήριο θα πρέπει να γίνεται όσο το δυνατόν γρηγορότερα και κατά προτίμηση με ξηρό πάγο

Μέθοδοι

Μέθοδοι Προεργασία του δείγματος (διαφορετική για την κάθε κατηγορία δειγμάτων) Απομόνωση DNA Έλεγχος ποιότητος και ποσότητος του εκχειλισθέντος DNA (φωτομετρικά) Αναζήτηση πολυμορφισμών 1. Μεγέθους κλάσματος μετά από τη δράση ακπαγορευτικών ενδονουκλεασών 2. Γενετικής θέσης (STRs, VNTRs)

1.Μεγέθους κλάσματος μετά από δράση απαγορευτικών ενδονουκλεασών 1.Μεγέθους κλάσματος μετά από δράση απαγορευτικών ενδονουκλεασών Ενζυμική διάσπαση DNA σε κλάσματα Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των κλασμάτων DNA Μεταφορά των κλασμάτων σε μεμβράνη (Southern blotting) Επισήμανση του ανιχνευτού Υβριδοποίηση Τοποθέτηση της μεμβράνης σε επαφή με ακτινογραφική πλάκα Εμφάνιση της ακτινογραφικής πλάκας Συγκριτική μελέτη του ηλεκτροφορήματος Αξιολόγηση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Συμπεράσματα

Πολυμορφισμοί γενετικής θέσης PCR ειδικά σχεδιασμένη, ανάλογα με το πολυμορφικό σύστημα που θα αναπτυχθεί Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR Συγκριτική μελέτη του ηλεκτροφορήματος Αξιολόγηση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Συμπεράσματα

Αξιολόγηση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων

Ταυτοποίηση βιολογικών υλικών-πειστηρίων με τα άτομα Παράδειγμα Έστω ότι στον τόπο ενός αδικήματος, βρέθηκε μία κηλίδα αίματος (πειστήριο), η οποία πιθανολογείται ότι ανήκει στο ύποπτο για το αδίκημα άτομο. Από το πειστήριο και από δείγμα αίματος του υπόπτου απομονώνεται DNA, το οποίο μελετάται συγκριτικά σε 4 πολυμορφικές περιοχές. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης συνοψίζονται στον πίνακα Ι. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν το μέγεθος των αλληλομόρφων σε ζεύγη βάσεων (bp).

Αποτελέσματα της ανάλυσης Αποτελέσματα της ανάλυσης. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν το μέγεθος των αλληλομόρφων σε ζεύγη βάσεων (bp). Πολυμορφικό σύστημα Αλληλ. υπόπτου πειστηρίου Συχνότητα Αλληλομ. γονοτύπου D17S5 240** 380** 109/432 ή0,25 (p1) 134/432 ή0,31(p2 ) 0,155 (2 p1 p2 ) 0,0441(p12) TPOX 114** 229/432ή 0,53(p1 ) 229/432 ή0,53(p1 ) 0,2809 (p12) THO1 154** 166** 102/428 ή0,24(p1 ) 64/428 ή0,15(p2 ) 0,072 (2 p1 p2 ) vWA 147** 91/428 ή 0,21 (p1 ) 0,0441(p1 p1)

Η πιθανότητα του γενετικού αποτυπώματος, . υπολογίζεται, πολλαπλασιάζοντας τη συχνότητα εμφάνισης των γονοτύπων του κάθε πολυμορφικού συστήματος που μελετήθηκε: m m=το πλήθος των μελετηθέντων P= Pk (1) πολυμορφικών συστημάτων k K=ένα τυχαίο πολυμορφικόσύστημα P= 0,155 Χ0,0441 Χ 0,2809Χ 0,072 Χ0,0441=0,000138 ή ένας στους 7234 ανθρώπους

Ταυτοποίηση τριών τεμαχίων ανθρωπίνου πτώματος M. Georgiou, A. Hatzaki, A. Koutselinis 2000. Identification of an alleged offender of murder by VNTR analysis: a case report. Am.J.of Forensic Sci. 21(2):162-165 Ταυτοποίηση τριών τεμαχίων ανθρωπίνου πτώματος Υπό διερεύνηση ερωτήματα 1. Αν και τα τρία τεμάχια ανήκαν στο ίδιο πτώμα 2. Ποία η ταυτότητα του πτώματος 3. Ποία η ταυτότητα του δράστη

Υλικό Μυικός ιστός(από τα ανευρεθέντα τεμάχια) Δείγμα αίματος των φερομένων ως βιολογικοί γονείς ενός εξαφανισθέντος ατόμου κιτρίνης φυλής

Μέθοδοι Απομόνωση DNA PCR για την αναζήτηση πολυμορφισμών θέσης σε 5 πολυμορφικές περιοχές Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR Συγκριτική μελέτη των ηλεκτροφορημάτων των τριών ιστοτεμαχίων Συγκριτική μελέτη των ηλεκτροφορημάτων των τριών ιστοτεμαχίων και των φερομένων ως βιολογικοί γονείς Αξιολόγηση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων

Πολυμορφικά συστήματα D1S80 & Apo B

Αποτελέσματα Πολυμορφικό Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Πολυμορφικό Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Σύστημα τεμαχίου 1 τεμαχίου 2 τεμαχίου 3 HV1ApoB 690-690 690-690 690-690 D17 310-380 310-380 310-380 TPOX 114-131 114-131 114-131 F13 191-195 191-195 191-195 vWII 151-151 151-151 151-151 Διαπιστώνεται ότι σε όλα τα μελετηθέντα πολυμορφικά συστήματα, το γενετικό υλικό και των τριών αγνώστου ταυτότητος υπολειμμάτων φέρει τα ίδια αλληλόμορφα

Αποτελέσματα Πολυμορφικό Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Πολυμορφικό Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Αλληλόμορφα Σύστημα φερομένης υπολειμμάτων φερομένου ως μητέρα αγνώστου ως πατέρας HV1ApoB 690-720 690-690 600-690 D17 170-380 310-380 310-310 TPOX 114-131 114-131 131-135 F13 195-199 191-195 187-191 vWII 162-151 151-151 151-154 Διαπιστώνεται ότι σε όλα τα μελετηθέντα πολυμορφικά συστήματα, το γενετικό υλικό των αγνώστου ταυτότητος υπολειμμάτων φέρει αλληλόμορφα κοινά με τους φερόμενους ως βιολογικοί γονείς του

Συμπεράσματα 1. Η υπόθεση τα ανευρεθέντα τεμάχια να μην ανήκουν στον ίδιο άτομο απορρίπτεται. Η πιθανότητα να ανήκουν τα τεμάχια σε άλλο άτομο που φέρει τα ίδια αλληλόμορφα είναι 1/10.000.000. Ο λόγος αυτός αντιστοιχεί σε απόρριψη της υπόθεσης της μη ταύτισης κατά 99,999999%. 2. Η υπόθεση τα ανευρεθέντα τεμάχια να μην ανήκουν στον φερόμενο ως βιολογικό τέκνο των ως άνω ατόμων απορρίπτεται. Η πιθανότητα να ανήκουν τα τεμάχια σε άλλο άτομο που φέρει τα ίδια αλληλόμορφα είναι 1/10.000. Ο λόγος αυτός αντιστοιχεί σε απόρριψη της υπόθεσης της μη ταύτισης κατά 99,999%. Μετά την αναγνώριση της ταυτότητος των ανευρεθέντων τεμαχίων και κατά συνέπεια της ταυτότητος του θύματος κατέστη δυνατόν να στοιχειοθετηθεί κατηγορία εις βάρος ενός υπόπτου δράστη, ο οποίος και παραπέμφθηκε στη δικαιοσύνη

Συμβολή της Μοριακής Ιατροδικαστικής στην κλινική πρακτική Παιδί ηλικίας 3 ετών παρουσιάζει, σύμφωνα με ισχυρισμούς της μητέρας του, αιμόρροια, η οποία μάλιστα ακολουθεί τον καταμηνιαίο κύκλο της μητέρας Ο σχετικός κλινικός και ο εργαστηριακός έλεγχος του παιδιού αποβαίνει αρνητικός Οι θεράποντες ιατροί σκέφτονται για τη μητέρα το ενδεχόμενο συνδρόμου Munchausen's Προσκομίζονται στο εργαστήριο ένα παιδικό εσώρουχο με καφεκόκκινη κηλίδα αγνώστου ταυτότητος και δείγματα αίματος του παιδιού και της μητέρας Από τα ως άνω βιολογικά υλικά-πειστήρια απομονώνεται DNA και αναζητώνται ομοιότητες ή διαφορές σε έξι πολυμορφικές θέσεις

Πολυμορφικό σύστημα F13

Συμπεράσματα Από την ανάλυση των μελετηθεισών πολυμορφικών θέσεων συμπεραίνεται: 1. Η υπόθεση η κηλίδα αίματος να προέρχεται από τη μητέρα αποκλείεται κατά 100% 2. Η υπόθεση η κηλίδα αίματος να ανήκει στο παιδί δεν απορρίπτεται 3. Η πιθανότητα η κηλίδα αίματος να μην ανήκει στο παιδί αλλά να προέρχεται από άλλο άτομο που να φέρει τα ίδια αλληλόμορφα με αυτό είναι της τάξεως του 1/10.000.000. Ο λόγος αυτός αντιστοιχεί σε απόρριψη της υπόθεσης της αλλότριας προέλευσης της κηλίδας αίματος κατά 99,99999%