Κοτούλας Θεμιστοκλής Μάθημα:Βιοτεχνολογία Καθηγήτρια:Μαρία Φράγκου Διηθητικά κυτταροτοξικα Τ-λεμφοκύτταρα στοχεύουν συμπαγείς όγκους ‘συγκρατούμενα’ από υπεραντιγονική χιμαιρική πρωτείνη Κοτούλας Θεμιστοκλής Μάθημα:Βιοτεχνολογία Καθηγήτρια:Μαρία Φράγκου

Εισαγωγή Τα κύρια λεμφοκύτταρα στο αίμα είναι τα Τ Ωστόσο τα ίδια δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα του οργανισμού,σε περίπτωση που δεν αναφερόμαστε σε αυτοάνοσο,άρα και κύτταρα όγκων Πολλές προσπάθειες για επαγώμενη ανοσοανταπόκριση(κυρίως με χρήση αντισωμάτων)που δεν είχαν σαφές αποτέλεσμα καθώς οι μηχανισμοί που εμπλέκονται δεν είναι γνωστοί

Εισαγωγή Στην έρευνα αυτή έγινε χρήση χιμαιρικής υπεραντιγονικής πρωτείνης Αποτελούνταν από 2 κύριες πρωτείνες: τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα του ανθρώπου (epidermal growth factor,EGF) και την σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Α(staphylococcal enterotoxin A,SEA) με τη μετάλλαξη D227A Η πρωτείνη αυτή οδηγήθηκε στην περιοχή του όγκου και προκάλεσε ανοσολογική απόκριση στην περιοχή

Συμπαγείς (δεν περιέχουν κύστες ή περιοχές με υγρό Εισαγωγή Όγκοι Συμπαγείς (δεν περιέχουν κύστες ή περιοχές με υγρό σάρκωμα λέμφωμα καρκίνωμα «Όγκοι αίματος» λευχαιμία

Εισαγωγή Έχει παρατηρηθεί πως στα σαρκώματα υπάρχει υπερέκφραση υποδοχέων EGF (EGF-R),οι οποίοι μπορούν να φωσφορυλιωθούν απο τoν EGF σε ένα κατάλοιπο τυροσίνης στη θέση 1068 Παράλληλα η SEA οδήγησε τα Τ-λεμφοκύτταρα κοντά στον όγκο Τα Τ-λεμφοκύτταρα έκκριναν διατιτρήνες και κοκκιοένζυμα ως ανταπόκριση στην SEA αλλά αυτά στόχευσαν και καρκινικά κύτταρα που βρίσκονταν κοντά Τέλος τα ανοσοποιητικά κύτταρα έκκριναν και κυτταροκίνες που βοήθησαν σε πιο γενικευμένη ανταπόκριση

Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό…

Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό…

Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό… Β-Λεμφοκύτταρα Πλασματοκύτταρα Κύτταρα Μνήμης

Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό… Τ-λεμφοκύτταρα Βοηθητικά(CD4) Μνήμης Ρυθμιστικά Κυτταροτοξικά(CD8+)

Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό…

Υλικά και μέθοδοι Προετοιμασία πρωτείνης Δημιουργία μοντέλων σε ποντίκια Σηματοδότηση, με φθορίζουσες ουσίες, της EGF-SEA Κυτταρομετρία ροής Ανοσοιστοχημεία Μέτρηση ποσότητας κυτοκινινών Δοκιμασία TUNEL Απεικόνιση ιστών

Προετοιμασία πρωτεϊνων Χρησιμοποιήθηκε ο φορέας pET22b στον οποίο εισάγαμε 3 αλληλουχίες: Ένα συνθετικό τμήμα DNA που κωδικεύει ένα σύντομο συνδετικό πεπτίδιο (VDKLGGGGSGGGGSGGGGS) To γονίδιο για την SEA με τη μετάλλαξη D227A (μοριακό βάρος 34,6kDa) Το γονίδιο για την ΕGF (μαζί με την SEA 41,2kDa)

Προετοιμασία πρωτεϊνων Στη συνέχεια εισάγουμε το φορέα σε βακτήριο (E.Coli) και έπειτα από πολλαπλασιασμό των βακτηρίων λύσαμε τα κύτταρα και ‘καθαρίσαμε’ τις πρωτείνες με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας με ακινητοποιημένο μεταλλικό ιόν (Νi++). Οι πρωτείνες αναδιπλώθηκαν με τη μέθοδο GSSG και με διαπίδυση σε αργινίνη Τα τελικά προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE

Προετοιμασία μυών Ποντίκια (αρσενικά ICR)4-5 εβδομάδων,18-22g το καθένα Εισάγαμε σε αυτά,υποδόρια στη δεξιά ‘μασχάλη’, 2 εκκατομύρια κύτταρα S180,τα οποία είχαμε εισάγει σε αλατούχο διάλυμμα (PBS, phosphate-buffered saline) Τα χωρίσαμε σε τρία γκρουπ των 15 Έγινε έγχυση,μετά από δύο μέρες,διαλυμάτων 0,2ml 0,9% ΝαCl(control),SEA(250pmol) και EGF-SEA (250pmol),ενδοπεριτοναϊκά,δύο φορές τη μέρα Οι μετρήσεις άρχισαν την ένατη μέρα

Σηματοδότηση EGF-SEA Με φθορίζουσες ουσίες Συγκεκριμένα με Kodak X-SIGHT 670 TFP(tetrafluorophenyl=τετράφθοροφαινυλο-) εστέρα Σύζευξη χρωστικών με τις πρωτείνες μας σε ρυθμιστικό διά/μα φωσφορικού νατρίου->κατάλληλες χρωστικές για κατάλληλες πρωτείνες,ενώ ασύζευκτες χρωστικές ουδετεροποιούνται με χλωριούχο αμμώνιο Οι σηματοδοτημένες πρωτείνες με τα υπόλοιπα χρώματα υφίστανται εξαλάτωση σε στήλη Sephadex G-25 για να διαχωριστούν ενώ μετριέται η απορρόφηση φωτός (φασματοφωτομετρία) για να δούμε το βαθμό σηματοδότησης....

Κυτταρομετρία ροής Πιο συγκεκριμένα ανάλυση FACS(fluorescence-activated cell sorter) Μέτρηση ικανότητας της σηματοδοτημένης EGF-SEA να προσδένει κύτταρα σαρκώματος Κύτταρα σαρκώματος συλλέχθηκαν,φυγοκεντρήθηκαν,εισάχθηκαν σε δ/μα PBS και επωάστηκαν με διάφορες ποσότητες EGF-SEA και στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS

Ανοσοϊστοχημεία Ιστοί από 8 ποντίκια από κάθε γκρουπ επεξεργάστηκε σε φορμαλίνη,παραφίνη,ξυλινη,αιθανολη,τα κύτταρα επωάστηκαν σε:1) δ/μα Η2Ο2 για να εμποδιστούν οι ενδογενείς υπεροξειδάσες,2)δ/μα μπλοκαρίσματος πρωτεϊνών που περιείχε ανοσοποιημένο ορό κουνελιού,3)δ/μα αντισωμάτων:ειδικών για CD4 πολυκλωνικών από κουνέλι,ειδικών για CD8 πολυκλωνικών από κουνέλι,πολυκλωνικών για ιντερφερόνη-γ,παράγοντα νέκρωσης όγκου-α,Fas,διατιτρηνών,κοκκιοενζύμων-Β,όπως επίσης και ειδικών για φωσφορυλιωμένους EGFRs από ποντίκια Για αυτα χρησιμοποιήθηκαν anti-rabbit και anti-mouse αντισώματα

Ανοσοϊστοχημεία Παράλληλα δημιουργήθηκαν και αντισώματα για την ανίχνευση της SEA Τέλος οι ιστοί ξεπλύθηκαν με PBS και χρώστηκαν με αιματοξυλίνη για μελέτη

Απελευθέρωση κυτταροκινών Αρκετά υψηλά επίπεδα ιντερφερόνης-γ,interferon-γ (IFN-γ) και παράγοντα νέκρωσης όγκου-α,tumor necrosis factor-α(TNF-α) Χρήση ELISA (μάλλον διπλής) για ανίχνευση και της ύπαρξης και της ποσότητας

Απελευθέρωση κυτταροκινών Το ίδιο το γεγονός απελευθέρωσης τους όμως σημαίνει πως ο οργανισμός έχει αρχίσει την ανταπόκριση του στα ξένα αντιγόνα.Επίσης παρατηρούνται και ‘σημεία’ φλεγμονής που προκαλούν οι κυτταροκίνες μας…

Δοκιμασία TUNEL Αξιολόγηση των ποσοτήτων κατακερματισμένου DNA Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling Σε εγκοπή στο DNA,η τρανσφεράση θα προσθέσει dUTP Χρήση In Situ Τα νουκλεοτίδια είναι σεσημασμένα

Απεικόνιση ιστών Αφότου ενέθηκαν τα προαναφερθέντα διαλύματα στα ποντίκια,αυτά αναισθητοποιήθηκαν για να παρακολουθηθεί η πορεία της EGF-SEA στους όγκους.Η παρακολούθηση διήρκησε 62 ώρες ενώ χρησιμοποιήθηκε απεικόνιση ‘In Situ’ φθορισμού IVIS Kinetic με ειδικό φίλτρο για συλλογή εκπομπών φωτονίων μήκους κύματος 810-855nm

Συμπεράσματα-Παρατηρήσεις Η EGF-SEA ‘προσδέθηκε’ στα κύτταρα του όγκου Η EGF φωσφορυλίωσε τους EGF υποδοχείς που υπερεκφράζονται στα σαρκώματα Η SEA προκάλεσε ανοσολογική απάντηση κοντά στους όγκους Τα κύτταρα των όγκων περιήλθαν σε απόπτωση

Συμπεράσματα-Παρατηρήσεις Τα κυτταροτοξικά Τα-λεμφοκύτταρα παρήγαγαν διατρητίνες και κοκκιοένζυμα-Β και οδήγησαν τα κύτταρα των όγκων σε απόπτωση Παράλληλα επάγεται και απόπτωση των κυττάρων μέσω του μονοπατιού της Fas που ενεργοποιείται Τα καρκινικά κύτταρα εμφάνισαν αυξημένη έκφραση Fas

Συμπεράσματα-Παρατηρήσεις Αξίζει να αναφερθεί όμως πως τα ποντίκια με την SEA απλώς δεν εμφάνισαν την ίδια απάντηση Ενώ στα ποντίκια με τη χιμαιρική πρωτείνη παρατηρήσαμε ανοσολογική ανταπόκριση στην περιοχή του όγκου, στα ποντίκια με την SEA αρκετά T-λεμφοκύτταρα γύρισαν στον σπλήνα ενώ ήταν αυξημένες οι κυτταροκίνες στο αίμα αλλά και στο σπλήνα

Ευχαριστώ πολύ

Βιβλιογραφία Pubmed Wikipedia Βιοχημεία Berg,Tymoczko,Stryer πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης Arousing the fury of the immune system Immunology,David Male Ανοσοβιολογία,Χατζηπέτρου Immunology,Hood,Weissman,Wood,Wilson