ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΣΚΗΣΗ 9-10 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΙΦΑΝΕΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΩΝ ΧΩΡΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΜΕ ΒΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ (ΜΕΘΟΔΟΣ ATP)

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΙΦΑΝΕΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΩΝ ΧΩΡΩΝ Σκοπός της άσκησης είναι ο έλεγχος του αριθμού μικροοργανισμών σε επιφάνειες του εργαστηρίου.  Ο μικροβιακός έλεγχος των επιφανειών των χώρων εργασίας πραγματοποιείται συνήθως με την μέθοδο των τρυβλίων επαφής. Τα ειδικά αυτά τρυβλία περιέχουν στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο εξέχει ελαφρώς από την επιφάνεια του τρυβλίου. Αφαιρείται το καπάκι από το τρυβλίο και κρατώντας το ανάποδα με την πλευρά του θρεπτικού υποστρώματος να είναι προς τα κάτω, πιέζεται ελαφρά πάνω στην επιφάνεια που εξετάζεται. Στη συνέχεια το τρυβλίο ανασηκώνεται και το καπάκι επανατοποθετείται.

Χρησιμοποιούνται για το μικροβιολογικό έλεγχο επιφανειών των χώρων παραγωγής και αποθήκευσης τροφίμων.

Με τα τρυβλία omico επιτυγχάνεται: Η απευθείας επαφή με το σημείο ελέγχου Καλύτερη δυνατότητα ελέγχου Σταθερή διαδικασία Εύκολη χρήση Άμεσο και αξιόπιστο αποτέλεσμα

Επιφάνεια δειγματοληψίας Ομάδες Επιφάνεια δειγματοληψίας Χωρίς απολύμανση Αρ. μ/ο/100 cm2 Με απολύμανση 1 Πάγκος εργασίας 2 Πάτωμα 3 Τοίχος 4 Νεροχύτης 5 Επωαστικός κλίβανος 6 Χέρια 7 Εσωτερικό ντουλαπιού 8 Περσίδες 9 LAF (θάλαμος νηματικής ροής)

Ομάδες Χώρος δειγματοληψίας Μ.ο/m3 Επιθυμητή Καθαρότητα (ενδ.τιμές) 1 Κυρίως Εργαστήριο <500 2 Εργαστήριο 3 Ψυγείο Οινολογίας <100 4 LAF (θάλαμος νηματικής ροής) <1 5 WC <1000 6 Επωαστικός κλίβανος 7 Διάδρομος

ΜΕΘΟΔΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΜΕ ΒΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ (ΜΕΘΟΔΟΣ ATP) Βιοφωταύγεια: Η παραγωγή φωτός από τους ζωντανούς οργανισμούς. Η βιοφωταύγεια μπορεί να είναι αποτέλεσμα απορρόφησης του φωτός (φθορισμός ή φωσφορισμός, πχ. σε πολλά ψάρια του βυθού) ή χημικής αντίδρασης (χημειοφωταύγεια, πχ. στις πυγολαμπίδες).

Μέτρηση ΑΤΡ με βιοφωταύγεια Λουσιφερίνη + ΑΤΡ + Μg2+ οξυλουσιφερίνη + AMP + CO2 + φως λουσιφεράση

Αρχή της μεθόδου Η μοριακή τριφωσφωρική αδενοσίνη (ΑΤΡ) βρίσκεται σε όλα τα ζωντανά κύτταρα (πρωκαρυοτικά και ευκαρυοτικά) και επομένως η ανίχνευσή της είναι ενδεικτική της παρουσίας ζώντων οργανισμών. Η στοιχειομετρία της αντίδρασης της οξείδωσης της λουσιφεράσης, όπως περιγράφεται παραπάνω, που είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση της βιοφωταύγειας είναι ένα προς ένα (κάθε μόριο ΑΤΡ δηλαδή δίνει ένα φωτόνιο).  

Έτσι, εκμεταλλευόμενοι το γεγονός της παραγωγής φωτός και προσαρμόζοντας ένα φωτόμετρο (λουμινόμετρο) που να μετράει την ποσότητα αυτού, έχουμε μια ταχεία μέθοδο προσδιορισμού ΑΤΡ το οποίο εύκολα μπορούμε να συσχετίσουμε ποσοτικά με την παρουσία είτε μικροοργανισμών είτε υπολειμμάτων τροφίμου και συνεπώς ανεπαρκούς καθαρισμού.

Η ανίχνευση ΑΤΡ, όμως, ενώ είναι μία ένδειξη της υγιεινής του χώρου Δεν μας δίνει πληροφορίες για την ταυτότητα του οργανισμού που ανιχνεύτηκε Για παράδειγμα εάν ανιχνευτούν σημαντικά επίπεδα ΑΤΡ σε μία επιφάνεια αυτό μπορεί να σημαίνει ότι η διαδικασία καθαρισμού και απολύμανσης είναι ανεπαρκής και πρέπει να αναθεωρηθεί. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε ορισμένες βιομηχανίες τροφίμων, πχ βιομηχανίες γάλακτος όπου η υγιεινή χώρου είναι ιδιαίτερα σημαντική.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κατά την διεξαγωγή της δειγματοληψίας οι επιφάνειες σκουπίζονται με στυλεό βαμβακερής ίνας, ο οποίος στην συνέχεια μεταφέρεται στην κυψελίδα του οργάνου (λουμινομέτρου).  

Στην κυψελίδα υπάρχει διαλύτης ή άλλη ουσία που να έχει την δυνατότητα να προκαλεί ρήξη στα μικροβιακά κύτταρα και να εκχυλίζει το περιεχόμενο ΑΤΡ, καθώς και αυτό που προέρχεται από τα υπολείμματα των τροφίμων. Ο προσδιορισμός του ΑΤΡ επιτυγχάνεται με προσθήκη στο διάλυμα του συστήματος λουσιφεράσης/λουσιφερίνης, που προκαλεί και την έκλυση του φωτός(φωταύγειας) . Το εκλυόμενο φως μετράται στην συνέχεια από το όργανο και έτσι υπολογίζεται το περιεχόμενο στην επιφάνεια εξέτασης ποσό ΑΤΡ.

Τα αποτελέσματα ATP καταγράφονται στο λουμινόμετρο σε μονάδες βιοφωταύγειας RLU (Relative Light Units).

(RLU=μονάδες ATP όπως καταμετρώνται από το λουμινόμετρο Μετρούμενα κύτταρα.CFU/mL Μετρούμενα κύτταρα.CFU/ mL Καθαρά Βρώμικα RLU>1000 και CFU υψηλό: Τα σημεία αυτά είναι βρώμικα. Παρουσία τόσο μικροοργανισμών όσο και υπολειμμάτων τροφίμων RLU>1000 και CFU υψηλό: Τα σημεία αυτά είναι βρώμικα. Παρουσία τόσο μικροοργανισμών όσο και υπολειμμάτων τροφίμων RLU>1000 και CFU χαμηλό:Τα σημεία αυτά θεωρούνται βρώμικα.Οι μικροοργανισμοί υπάρχουν σε χαμηλά επίπεδα αλλά υπάρχουν πολλά υπολείμματα τροφών. Ο πληθυσμός των μικροβίων θα αυξηθεί καταναλώνοντας τα υπολείμματα. RLU>1000 και CFU χαμηλό:Τα σημεία αυτά θεωρούνται βρώμικα.Οι μικροοργανισμοί υπάρχουν σε χαμηλά επίπεδα αλλά υπάρχουν πολλά υπολείμματα τροφών. Ο πληθυσμός των μικροβίων θα αυξηθεί καταναλώνοντας τα υπολείμματα. RLU>100 και CFU=0: Τα σημεία αυτά είναι βρώμικα. Μικροοργανισμοί δεν ανιχνεύονται ωστόσο εξαιτίας των υπολειμμάτων που υπάρχουν ο αριθμός τους αναμένεται να αυξηθεί. RLU<100 και CFU =0: Τα σημεία αυτά είναι καθαρά. Ούτε μικροοργανισμοί αλλά ούτε υπολείμματα ανιχνεύονται. Διάγραμμα 1.Σχέση μεταξύ αποτελεσμάτων που βρέθηκαν με την μέθοδο του ΑΤΡ και αποτελεσμάτων που βρέθηκαν με καλλιεργητικές μεθόδους σε μία επιφάνεια παραγωγικού χώρου (RLU=μονάδες ATP όπως καταμετρώνται από το λουμινόμετρο και CFU=Colony Forming Units, αριθμός σχηματιζόμενων αποικιών).

Επιφάνεια δειγματοληψίας Αποτελέσματα Επιφάνεια δειγματοληψίας Χωρίς απολύμανση Μονάδες RLU Με απολύμανση (Μονάδες RLU) 1 Πάγκος εργασίας 2 Πάτωμα 3 Τοίχος 4 Νεροχύτης 5 Επωαστικός κλίβανος 6 Χέρια 7 Εσωτερικό ντουλαπιού 8 Υλικό συσκευασίας 9 Χερούλι Πόρτας Εργαστηρίου 10 LAF (θάλαμος νηματικής ροής)

Αποτελέσματα Μονάδες RLU Κριτήρια <50 Καθαρή επιφάνεια 50-200 Υπάρχει χαμηλή συγκέντρωση οργανικού υλικού. Δεν ευνοείται ιδιαίτερα η ανάπτυξη βακτηρίων 200-500 Ελαφρά ακάθαρτο. Πιθανή εμφάνιση επιμόλυνσης-Περιβάλλον πιθανώς ευνοϊκό για την ανάπτυξη βακτηρίων. >500 Ακάθαρτο/ Επιμόλυνση