Το σύστημα ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος Μηχανισμός επιλεκτικής ενδοκυτταρικής πρωτεόλυσης εξαρτώμενος από ΑΤΡ

Κυτταρικός κύκλος (π.χ. κυκλίνες) Επιδιόρθωση DNA Μεταγραφή Απόκριση στο stress Ογκογένεση Επεξεργασία αντισωμάτων Βιογένεση ριβοσωμάτων Καταβολισμός ανώμαλων πρωτεϊνών Κυτταρική διαφοροποίηση Μεταγωγή σημάτων (π.χ. IkB) Τα υποστρώματα στοχεύονται για αποικοδόμηση με την προσθήκη πολλαπλών μονομερών ουβικουιτίνης. Ρυθμιστικός ρόλος: αποικοδόμηση πρωτεϊνών με μικρό χρόνο ημιζωής. Το μονοπάτι αποικοδόμησης ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος αρχικά εθεωρείτο ως ένας απλός μηχανισμός καταστροφής «γηρασμένων» πρωτεϊνών. Σήμερα, είναι γνωστό ότι παίζει βασικό ρόλο στην κυτταρική ρύθμιση.

Η ουβικουιτίνη - Ub 76 αμινοξέα Προεξέχων C-τελικό άκρο (γλυκίνη) Σφαιρική, συμπαγής Σταθερή κατά την επίδραση πρωτεασών σε ουδέτερο pH Εντοπίζεται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα Μετα-μεταφραστική ρύθμιση

Μηχανισμός δράσης Η πρωτεΐνη-στόχος συχνά επιλέγεται για αποικοδόμηση μέσω φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη αναγνωρίζεται και υφίσταται ουβικουιτίνωση από ένα σύμπλοκο ενζύμων στο οποίο συμμετέχουν τα ένζυμα Ε1, Ε2 και σε μερικές περιπτώσεις το Ε3.

Ενεργοποίηση της Ub E1  ubiquitin activating enzyme, Ένζυμο ενεργοποιητής της ουβικουιτίνης 115-125 kD (1000 περίπου αα) Ποικιλία ισομορφών Εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτόπλασμα και σε επαφή με τον κυτοσκελετό Στην ενεργό περιοχή υπάρχει συντηρημένη Cys Εντοπίζεται σε σύμπλοκα με Ε2 καιΕ3 ένζυμα

Δράση Ε1 ενζύμου Υδρολύει ΑΤΡ και σχηματίζει ένα σύμπλοκο Ub-AMP Δεσμεύει την ουβικουιτίνη στην κυστεϊνη της ενεργού περιοχής με θειολεστερικό δεσμό. Ε1 + ΑΤΡ + Ub ----------------> E1.Ub-AMP + PPi E1.Ub-AMP + Ub ----------------> E1-s-co-Ub.AMP-Ub Θειολεστερικός δεσμός Σχηματίζεται ανάμεσα στο C-τελικό άκρο της Ub και της ομάδας –SH του Ε1 ενζύμου. Ταυτόχρονα πραγματοποιείται αδενυλίωση ενός νέου μορίου ουβικουιτίνης.

Σύζευξη Ub και πρωτεΐνης-στόχου Η ουβικουιτίνη δεν μεταφέρεται απευθείας στην πρωτεΐνη στόχο, αλλά μεταφέρεται σε ένα ένζυμο της οικογένειας ενζύμων σύζευξης ή λιγασών Ε2. Μεταφορά Ub από Ε1  Ε2 Ε2  ubiquitin – conjugation enzyme or ligases Ποικιλία ισομορφών Περιέχουν συντηρημένη περιοχή 16kD περίπου, το UBC domain όπου εντοπίζεται συντηρημένη Cys N-τελικό άκρο: βασική περιοχή , παίζει ρόλο στη δέσμευση του Ε1. Τάξη Ι: UBC domain – συνεργασία με Ε3 Τάξη ΙΙ: C-τελικές επεκτάσεις του UBC domain Τάξη ΙΙΙ: Ν- και C- τελικές επεκτάσεις του UBC domain

E2-s-co-Ub + Protein-NH2 ------> E2-SH + Protein-NH-CO-Ub Δράση Ε2 ενζύμου Η Ub μεταφέρεται από το Ε1 στην Cys της ενεργού περιοχής του Ε2  θειολεστερικός δεσμός Η Ub μεταφέρεται από Ε2 στην πρωτεΐνη – στόχο  ισοπεπτιδικός δεσμός Ε1-s-co-Ub.AMP-Ub + E2-SH ------> E2-s-co-Ub + E1.AMP-Ub E2-s-co-Ub + Protein-NH2 ------> E2-SH + Protein-NH-CO-Ub Ισοπεπτιδικός δεσμός α-COOH ομάδα της gly76 της Ub και ε-NH2 ομάδα Lys της πλευρικής αλυσίδας της πρωτεΐνης στόχου. Στο ίδιο αα Lys μπορούν να δεσμευτούν ένα ή περισσότερα μόρια ουβικουιτίνης για τον σχηματισμό μιας πολύ- Ub αλυσίδας. Ο ισοπεπτιδικός δεσμός στην περίπτωση αυτή σχηματίζεται ανάμεσα στην α-COOH ομάδα της gly76 της Ub και ε-NH2 ομάδα της Lys-48 της πλευρικής αλυσίδας της επόμενης Ub.

Συμμετοχή του Ε3 ενζύμου Ε3  recognin enzyme Ταξη Ι: δέσμευση Ε3 με πρωτεΐνη-στόχο Το Ε3 αναγνωρίζει δομικό μοτίβο του Ν-τελικού άκρου της πρωτεΐνης (Ν-end rule). Δημιουργείται σύμπλοκο Ε3- πρωτεΐνη με Ε2-Ub και μεταφέρεται η Ub στην πρωτεΐνη. Τάξη ΙΙ: δέσμευση Ε3 με ουβικουιτίνη Το Ε3 παραλαμβάνει τη Ub από το σύμπλοκο Ε2-Ub και τη δεσμεύει στην Cys της ενεργού περιοχής μέσω θειολεστερικού δεσμού. Στη συνέχεια, μεταφέρει τη Ub στην πρωτεΐνη-στόχο.

Απο-ουβικουιτίνωση Ισοπεπτιδάσες απο-ουβικουιτίνωσης Υποστρώματα: πολυ-Ub αλυσίδες Ε1-s-Ub, E2-s-Ub σύμπλοκα πρόδρομες μορφές Ub Διασπούν τα υποστρώματα και επαναφέρουν τηνUb σε μονομερή μορφή Ανακύκλωση Ub και διατήρηση κυτταρικού αποθέματος Ορισμένες ισοπεπτιδάσες απαντώνται στο πρωτεάσωμα  αφαίρεση πολυ-Ub αλυσίδας πριν την αποικοδόμηση

Το πρωτεάσωμα Το 26S πρωτεάσωμα είναι το κύριο ενζυμικό σύμπλοκο του μονοπατιού αποικοδόμησης μέσω Ub. 20S πρωτεάσωμα Πρωτεολυτικός πυρήνας σχήμα κυλίνδρου 4 δακτυλίδια – καθένα περιλαμβάνει 7 υπομονάδες (άλφα7-βήτα7-βήτα7-άλφα7) 2 x 19S σύμπλοκα περιλαμβάνει ποικιλία ενζύμων (ΑΤΡάσες, ισοπεπτιδάσες, ένζυμα για αποδιάταξη πρωτεϊνών) καθορίζει εξειδίκευση υποστρώματος

Φωτογραφία πρωτεασώματος από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Φωτογραφία πρωτεασώματος από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Δομή του πρωτεασώματος Το ολοένζυμο του πρωτεασώματος, γνωστό και ως 26ς πρωτεάσωμα, είναι ένα σύμπλεγμα που αποτελείται από 2 ομοδιμερή, καθένα από τα οποία αποτελείται από τουλάχιστον 32 υπομονάδες που είναι συντηρημένες σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η δομή του 26ς μπορεί να διαχωρισθεί σε 2 κύρια πρωτεϊνικά συμπλέγματα, το πυρηνικό τμήμα 20ς και το ρυθμιστικό τμήμα 19ς, που ρυθμίζει τη λειτουργία του 20ς. Το 20ς έχει δομή βαρελιού που αποτελείται από 4 δακτυλίους, από τους οποίους ο καθένας έχει 7 υπομονάδες. Οι 2 εσωτερικοί δακτύλιοι ονομάζονται β-δακτύλιοι και περιέχουν το ενεργό κέντρο του ενζύμου που είναι υπεύθυνο για την πρωτεόλυση. Οι 3 από τις 7 υπομονάδες έχουν ενεργά κέντρα με δράση ανάλογη της χυμοτρυψίνης (προκαλεί διάσπαση μετά από μεγάλα υδρόφοβα τμήματα), της τρυψίνης (προκαλεί διάσπαση μετά από βασικές περιοχές), και δράση μετα-γλυταμυλικής υδρολάσης ( προκαλεί διάσπαση μετά από όξινες περιοχές). Συνεπώς κάθε πρωτεάσωμα έχει 6 πρωτεολυτικές θέσεις. Τα ενεργά κέντρα των πρωτεασών προσανατολίζονται προς το εσωτερικό των β-δακτυλίων, σχηματίζοντας τον πρωτεολυτικό θάλαμο. Η πρωτεΐνη που πρόκειται να καταστραφεί προσεγγίζει αυτές τις θέσεις μέσω ενός στενού καναλιού , αφού περάσει από τους εξωτερικούς α-δακτυλίους του 20ς. Τα αμινοτελικά άκρα των α-δακτυλίων αλληλεπιδρούν και ελέγχουν την είσοδο των πρωτεϊνών.

Το 19S βρίσκεται πάνω από το 20S , αλλά μερικές φορές υπάρχουν 2 19S εκατέρωθεν του 20S. Το 19S μπορεί να χωρισθεί σε 2 επιμέρους συμπλέγματα, την καλύπτρα και τη βάση. Στη βάση υπάρχουν 6 ΑΤΡασες (Rpt 1-6) μαζι με 3 υπομονάδες που δεν έχουν δράση ΑΤΡασης (Rpn 1,2,10). Ανάμεσα στις ΑΤΡασες και στις α-υπομονάδες του 20S υπάρχουν αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στο ξεδίπλωμα των πρωτεϊνών και την μετατόπιση τους στο εσωτερικό του πρωτεασώματος. Η καλύπτρα αποτελείται από τις υπόλοιπες υπομονάδες που δεν έχουν δράση ΑΤΡασης (Rpn 3,4,5,6,7,8,9,11,12, 13) και μπορεί να απελευθερωθεί από το πρωτεάσωμα και να ξανασυνδεθεί κάτω από ορισμένες συνθήκες. Είναι απαραίτητη για την σωστή αποικοδόμηση αλλά ο ρόλος της δεν είναι ξεκάθαρος.

Λειτουργία του πρωτεασώματος 1. Αναγνώριση ουβικουϊτίνης: Πρωτεΐνη με τουλάχιστον 4 μόρια ουβικουϊτίνης αναγνωρίζεται από την καλύπτρα και τη βάση του 19S τμήματος του πρωτεασώματος. 2. Απομάκρυνση ουβικουϊτίνης: αποουβικουϊτίνωση του υποστρώματος από το 19S. (υδρολάσες ουβικουϊτίνης) 3. Σύνδεση υποστρώματος: ΟιRpn 1 και Rpn 2 μαζι με τις 6 ΑΤΡασες, που αποτελούν τη βάση του 19S, δημιουργούν αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με τα υποστρώματα του πρωτεασώματος. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις βοηθούν στην σωστή εισαγωγή του υποστρώματος στον πρωτεολυτικό πυρήνα. 4. Ξεδίπλωμα και μετατόπιση: Στη συνέχεια οι ΑΤΡασες του 19S έχουν τριπλή δράση. Πρώτον ανοίγουν την πύλη του καναλιού που είναι κλειστή από τις αμινοτελικές ομάδες του α-δακτυλίου, δεύτερον, ξεδιπλώνουν την πρωτεΐνη, και τρίτον, μεταφέρουν την πρωτεΐνη μέσα στον πρωτεολυτικό θάλαμο του 20S. 5. Πρωτεόλυση: Ακολουθεί πρωτεόλυση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο του 20S. Το υπόστρωμα διασπάται σε μικρά πεπτίδια μήκους 3-23 αμινοξέα. Για να εισέλθει στο πρωτεάσωμα καινούργιο υπόστρωμα, θα πρέπει πρώτα να εξέλθουν από το πρωτεάσωμα τα τελικά προϊόντα από την προηγούμενη πρωτεΐνη. Το πρότυπο των πεπτιδίων που παράγεται από την ίδια πρωτεΐνη είναι το ίδιο κάθε φορά.

Ο παράγοντας ΝF-kB (Nuclear Factor k-chain in B-cells) Το μονοπάτι ενεργοποίησής του

Ο ρόλος του ΝF-kB Μεταγραφικός παράγοντας που επάγεται από ιϊκή μόλυνση Μεταγραφή των γονιδίων του ιού ΗIV τύπου 1 Ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών Μεταγωγή παθογονικών σημάτων από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα Συμμετοχή στο μονοπάτι απόκρισης στο stress, παραγωγή β-ιντερφερόνης

Γονίδια στόχοι ΙgK TNFa IFN-β IL-2 IL-2 receptor HIV ΙκΒ

Δομή του ΝF-kB Ετεροδιμερές σύμπλοκο της μορφής p50/p65 ή p105/p65. Οι υπομονάδες ανήκουν στην οικογένεια των Rel μεταγραφικών παραγόντων. Η μορφή p105/p65 είναι ανενεργός και μεταπίπτει στη μορφή p50/p65 μέσω του μονοπατιού ουβικουιτίνης – πρωτεασώματος. Η μορφή p50/p65 είναι ενεργός.

Ανενεργές μορφές του NF-kB Η μορφή p50/p65 όταν είναι δεσμευμένη με παράγοντα της οικογένειας των ΙκΒ αναστολέων Η μορφή p105/p65 (αδέσμευτη)

Moνοπάτι ενεργοποίησης του NF-kB Επάγεται από εξωκυττάριο σήμα π.χ. IL-2, TNFα Συντελείται μέσω του μονοπατιού ουβικουιτίνης – πρωτεασώματος Απαιτεί την παρουσία κατάλληλων διαμεμβρανικών υποδοχέων π.χ. IL-2R

Μετατροπή της p105 υπομονάδας στην p50 Στάδιο 1 Στάδιο 1 Φωσφορυλίωση p105 Στάδιο 2 Στάδιο 2 Σύνδεση Ub Στάδιο 3 Στάδιο 3 Σύνδεση με πρωτεάσωμα Στάδιο 4 Επεξεργασία p105 Στάδιο 4 p50