Ras Stabilization Through Aberrant Activation of Wnt/β-Catenin Signaling Promotes Intestinal Tumorigenesis Ομιλητής : Παναγιώτης Χριστοφόρου Υπεύθυνη Καθηγήτρια: Κα Μαρία Φράγκου

Εισαγωγικά (1/2)  Ογκογονίδιο Ras – Ενεργοποιεί το μονοπάτι της MAPK Eλέγχει διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης των κυττάρων – H-Ras, K-Ras, N-Ras – Μικρές γουανοσινικές τριφωσφατάσες (GTPases) – Ελέγχονται από ένα διακόπτη GDP/GTP – Μεταγωγή σήματος στο κύττ. – Μηχανισμοί που ενδέχεται να επηρεάζουν την ρύθμιση της ενεργότητας της Ras είναι η ουβικιτινυλίωση

Εισαγωγικά (2/2)  Πιο ειδικά θα αναφερθούμε στην H-Ras -Μετασχηματιστική πρωτεϊνη p21 -Eμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης σε απάντηση της διέγερσης του κυττάρου σε παράγοντα ανάπτυξης  Δύο κλειδιά γενετικά γεγονότα για την ανάπτυξη Καρκίνου του Παχέος εντέρου είναι η παράπλευρη ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης Ras-MAPK (ERK) και Wnt/β-catenin

Wnt/β-catenin signalling pathway (1/4)

Wnt/β-catenin signalling pathway (2/4) Τα Wnt’s είναι μια μεγάλη οικογένεια πολύ υδρόφοβων εκκρινόμενων πρωτεϊνών οι οποίες σηματοδοτούν από τους συγγενείς τους υποδοχείς Ενεργοποίηση αυτών των υποδοχέων έχει ως αποτέλεσμα την κυτταροπλασματική και πυρηνική σταθεροποίηση της β-catenin, με την παρεμπόδιση της αποικοδόμησης της Η ελεύθερη β-catenin σταθεροποιείται και συγκεντρώνεται στον πυρήνα όπου μαζί με τον ΤCF (T cell factor), διενεργοποιούν γονίδια στόχους όπως η cyclin D1 και η Myc Σε απουσία ενεργοποίησης του υποδοχέα από την Wnt, η β- catenin τιτλοφορείτε για αποικοδόμηση με την διεργασία της ουβικιτινυλίωσης από ένα σύμπλεγμα πρωτεϊνών που αποτελείται από την ΑPC (adenomatous polyposis coli), την Axin και την GSK-3β (glycogen synthase kinase – 3β)

Wnt/β-catenin signalling pathway (3/4) Axin : Αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδοτικής οδού της Wnt GSK-3β : Φωσφορυλίωση της β-catenin και τιτλοφόρηση για αποικοδόμηση ΑPC : Ογκοκατασταλτικό γονίδιο Β-TrCP [Transducin(g) repeat – containing protein] : Αναγνωρίζει πρωτεϊνες που προηγουμένως έχουν φωσφορυλιωθεί, για να τις ουβικιτινυλιώση (με την Ε3 Λιγάση) και να την οδηγήση σε αποικοδόμηση

Wnt/β-catenin signalling pathway (4/4)

Τεχνικές Ανοσοκατακρήμνιση (Ιmmunoprecipitation) – Co-Immunoprecipitation Υγρή χρωματογραφία ταυτόχρονα με φασματομετρία μαζών (Liquid chromatography tandem mass spectroscopy) Ανοσοαποτύπωση ή αποτύπωση κατά Western (Immunoblotting)

Ανοσοκατακρήμνιση [1/2] Ορισμός : Είναι η τεχνική της κατακρήμνισης ενός αντιγόνου (της πρωτεϊνης της προτίμησης μας) έξω από το διάλυμα με την χρήση ενός αντισώματος, το οποίο θα προσδένεται ειδικά σε αυτή την συγκεκριμένη πρωτεϊνη Χρησιμοποιείται για απομόνωση και ποσοτικοποίηση μιας συγκεκριμένης πρωτεϊνης από ένα δείγμα που περιέχει πολλές άλλες

Ανοσοκατακρήμνιση [2/2]

Υγρή χρωματογραφία ταυτόχρονα με φασματομετρία μαζών (1/3) Ορισμός : Είναι μια αναλυτική βιοχημική τεχνική που συνδυάζει τις φυσικές δυνατότητες διαχωρισμού της Υγρής χρωματογραφίας (HPLC) με την ικανότητα για ανάλυση μαζών της τεχνικής της φασματομετρίας μαζών HPLCMS

Υγρή χρωματογραφία ταυτόχρονα με φασματομετρία μαζών (2/3)  Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) - Ενισχύουμε τεχνικές όπως η Χρωματογραφεία συγγένειας κ.α -Στηρίζεται σε διαχωρισμό στήλης Υλικό στήλης πολύ λεπτό, άρα πολλές θέσεις αλληλεπίδρασης, άρα και μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα Επειδή το υλικό είναι λεπτόκοκκο, πρέπει να εφαρμοστεί πίεση προκειμένου να επιτευχθεί ικανοποιητική ροή

Υγρή χρωματογραφία ταυτόχρονα με φασματομετρία μαζών (3/3)  Φασματομετρία μαζών (ΜS) -Μετράει το λόγο μάζας/φορτίο των φορτισμένων σωματιδίων Ιονίζουμαι χημικές ενώσεις με αποτέλεσμα την δημιοργία ιονισμένων μορίων Επιταχύνονται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο  Τα ιόντα αυτά, ταξιδεύουν σε ένα σωλήνα επιτάχυνσης, όπου τα μικρά ιόντα ταξιδεύουν γρηγορότερα και φθάνουν πρώτα στον ανιχνευτή

Ανοσοαποτύπωση ή αποτύπωση κατά Western (Immunoblotting)  Τεχνική ανοσομέτρησης, η οποία καθιστά δυνατή την ανεύρεση μιας πρωτεϊνης σε ένα δείγμα ‘πολύπλοκο’ - Ένα δείγμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου - Οι πρωτεϊνες που διαχωρίζονται στην πηκτή, μεταφέρονται (με αποτύπωση, συνήθως ηλεκτροαποτύπωση) σε μια επιφάνεια που τις κάνει να αντιδρούν πιο εύκολα με το αντίσωμα που προστίθεται μετά και έιναι ειδικό για την πρωτεϊνη που μας ενδιαφέρει Το σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος στην επιφάνεια μπορεί να ανιχνευθεί με την προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος ειδικού για το πρώτο [ μια ραδιενεργός σήμανση του δευτέρου αντισώματος δημιουργεί μια σκοτεινή γραμμή σε φιλμ ακτίνων Χ - αυτοραδιογράφημα ]

Η πρωτεϊνη Axin ενισχύει την αποικοδόμηση που μεσολαβείται από την GSK-3β και την πολυουβικιτινυλίωση της H-Ras

Φωσφορυλίωση της H-Ras στα Thr144 και Thr148 σχετίζεται με την πολυουβικιτινυλίωση και αποικοδόμηση

Αποτελέσματα από την ρύθμιση της σταθερότητας της H-Ras στο μονοπάτι της ERK όσον αφορά την ενεργοποίηση της, τον κυτταρικό πολ/σμό και τον μετασχηματισμό

Απομάκρυνση του Apc αυξάνει την συγκέντρωση του Ras σε δείγματα παχέος εντέρου ασθενών με FAP και ποντικιών

Η συγκέντρωση της Ras αυξάνεται σε διάφορους καρκινικούς ιστούς και σε διάφορα στάδια καρκίνου του Παχέος εντέρου

Συνοπτικά (1/2) Η GSK-3β, ένας αρνητικός ρυθμιστής της οδού Wnt/β- catenin, φωσφορυλιώνει την H-Ras στα Thr144 και Thr148 Το γεγονός αυτό προσδένει την β-TrCP στην Ras παρόλο που η Ras δεν διαθέτει συντηρημένο μοτίβο πρόσδεσης για την β-TrCP H φωσφορυλίωση της Ras από την GSK-3β συνδέει την ρύθμιση για την σταθερότητα της Ras με το σηματοδοτικό μονοπάτι της Wnt/β-catenin Τα δεδομένα δέιχνουν ότι η ενεργότητα της Ε3 λιγάσης που μεσολαβείται από την β-TrCP μέσω της αναγνώρισης της p- H-Ras, οδειγούν στην πολυουβικιτινιλίωση της H-Ras και στην συνέχεια την αποδόμηση της

Μοντέλο για την ρύθμιση της σταθερότητας της Ras ΠρωτεΙνη συνδέτης με την Ε3 Λιγάση

Συνοπτικά (2/2) Τονίστηκε η σημαντικότητα της GSK-3β και η φωσφορυλίωση της Ras στην μείωση της ενεργότητας της ογκογόνου Ras και στην αναστολή του κυτταρικού πολ/σμού και μετασχηματισμού που επάγονται από αυτήν Παρατηρήσαμε ότι η ενεργότητα του μονοπατιού ERK ήταν μειωμένη σε κύτταρα όπου είχαμε υπερέκφραση της GSK-3β και έτσι συσχετίσθηκε με την σταθερότητα της Ras Μελέτες με μικροσυστοιχίες ιστών από διάφορα στάδια καρκινικού ιστού Παχέος εντέρου έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση και η σταθερότητα της ρύθμισης της Ras παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεση In vivo Συγκρινόμενα με τους φυσιολογικούς ιστούς Παχέος εντέρου, οι όγκοι σε κάθε στάδιο έδειξαν δυνατή συσχέτιση μεταξύ συγκέντρωσης β-catenin και Ras και μια μείωση στην p-Ras

Συμπεράσματα και Προκλήσεις Παρουσίαση ενός προηγουμένως άγνωστου μηχανισμού για την αποσταθεροποίηση της Ras που περιλαμβάνει την φωσφορυλίωση της που μεσολαβείται από την GSK-3β και που αναστέλλεται από την οδό σηματοδότησης της Wnt/β- catenin Η σταθεροποίηση της Ras από την Wnt/β-catenin διεγείρει την οδό σηματοδότησης της ERK και τον κυτταρικό πολ/σμό που τελικά οδηγεί στην δημιουργία όγκων Συσχετίσθηκε ο ρόλος του μονοπατιού σταθεροποίησης της Ras με την καρκινογένεση στο Παχύ έντερο Αυτή η αποσταθεροποίηση των Ras πρωτεϊνών από το σύμπλεγμα καταστροφής της β-catenin παρουσιάζεται ως ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων που θα ρυθμίζουν την Ras

Ευχαριστώ για την παρακολούθηση … Eπιπλέον Βιβλιογραφία : 1.Bιοχημεία. Jeremy M.Berg, John L.Tymoczko, Lubert Stryer 2.GENES VIII. Lewin 3.Ιστολογία. Gartner, Hiat 4.Βασικές αρχές κυτταρικής βιολογίας. Αlberts