水溶液中酶含量的分析测定 曾平

为什么要测定酶的含量？ 酶的应用十分广泛：作为分析试剂（检 测血糖或尿糖浓度， ELISA 体系中作为指 示剂）；多种有机化合物的实验室和商 业合成 ( 如从葡萄糖产生果糖 ) ，生物大分 子的降解（如淀粉生成葡萄糖，基因图 谱中 DNA 的特异剪切，低相对分子质量 化合物的降解），特定生物大分子的合 成（如 PCR 反应中合成 DNA ）等。因此 ，很有必要对酶的含量进行测定。

酶含量的主要测定方法 双缩脲法双缩脲法双缩脲法 Folin- 酚试剂法 Folin- 酚试剂法 紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直接 测量法 紫外吸收的直接 测量法 结束语

该方法基于碱性溶液中 Cu2 + 与蛋白质中 两个邻近肽键的专一性反应。因此，不 同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会显 著影响测定结果。

1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液（通常为 1~20mg/mL 之间）。 2. 取 1mL 各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。 [ 用 1mL 蒸馏水或合适的溶液作空白对照。 ] 3. 取 1mL 各待测溶液分别加到不同的试管中。 4. 取 1mL 双缩脲试剂（ 1.5gCuSO4·5H2O ， 6.0g 酒石 酸钾钠溶解于 300mL 100 mg·mL-1 的 NaOH 中）分别 加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。 5. 试管在 37 ℃保温 15min 。 nm 波长处用空白试剂调零，测出各种溶液的吸 光值。 [ 溶液的颜色可保持几小时不变。 ] 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低，因而不适用 于蛋白质浓度小于 1mg/mL 的溶液测定。酶含量的主 要测定方法酶含量的主 要测定方法

实验实验材料、主要仪器： ①、 Folin- 酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白 质与铜作用生成蛋白质 - 铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸 - 磷钨酸试剂（ Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混 合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度 比双缩脲法高 100 倍，定量范围为 5 ～ 100μg 蛋白质。 Folin 试剂显 色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚 类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪 氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。②、实验材料、 主要仪器：绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）、 722 型（或 721 型）分光光度计、 4 000r/min 的离心机、分析天平、容量瓶（ 50mL ）、量筒、移液管（ 0.5mL 、 1mL 、 5mL ）。 ③、试剂 ( 纯度均为分析纯 ) (1)0. 5mol/L NaOH (2) 试剂甲：

(A) 称取 10g Na2CO3 ， 2g NaOH 和 0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸 馏水定容至 500mL 。 (B) 称取 0.5g CuSO4·5H2O ，溶解后用蒸馏水定容至 100mL 。 每次使用前将 (A) 液 50 份与 (B) 液 1 份，即为试剂甲，其有效期为 1d ，过期失效。 （ 3 ）试剂乙： 在 1.5L 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠 (Na2WO4·2H2O) 和 700mL 蒸馏水，再加 50mL 85 ％磷酸和 100mL 浓盐酸充分混匀， 接上回流冷凝管，以小火回流 10h 。回流结束后，加入 150g 硫酸锂 和 50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15min ，驱除过量的 溴，冷却后溶液呈黄色 ( 倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续 沸腾 15min) 。然后稀释至 1L ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存 ，使用前大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1mol/L 。

实验操作： 1 ．标准曲线的制作 （ 1 ）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确 称取 g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少 量蒸馏水溶解后转入 100mL 容量瓶中，烧杯内的残液 用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中， 用蒸馏水定容至 100mL ，则配成 250μg/mL 的牛血清白 蛋白溶液。 （ 2 ）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取 6 支普通 试管，按表 1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏 水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后 各加试剂甲 5mL ，混合后在室温下放置 10min ，再各加 0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会 使显色程度减弱）。 30min 后，以不含蛋白质的 1 号试 管为对照，用 722 型分光光度计于 650nm 波长下测定各 试管中溶液的光密度并记录结果。

标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量 （ μg ）为横坐标，以光密度为纵坐标绘 制标准曲线。

样品的提取及测定 （ 1 ）准确称取绿豆芽下胚轴 1g ，放入研钵中 ，加蒸馏水 2mL ，研磨匀浆。将匀浆转入离心 管，并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入 离心管，离心 4 000r/min 、 20min 。将上清液转 入 50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作 为待测液备用。 （ 2 ）取普通试管 2 支，各加入待测溶液 1mL ， 分别加入试剂甲 5mL ，混匀后放置 10min ，再 各加试剂乙 0.5mL ，迅速混匀，室温放置 30min ，于 650nm 波长下测定光密度，并记录结果。

计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查 出相对应的蛋白质含量 X （ μg ），再按下列公式计算样 品中蛋白质的百分含量。 样品中蛋白质含量（％） = （ X （ μg ） × 稀释倍数／样 品重（ g ） ×106 ） *100 另外：进行测定时，加 Folin 试剂要特别小心，因为 Folin 试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但此实验的反应只 是在 pH10 的情况下发生，所以当加试剂乙（ Folin 试剂 ）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破 坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。 酶含量的主要测定方法 酶含量的主要测定方法

用于粗略估算的紫外吸收的直接测量法 蛋白质对电磁辐射的最大吸收峰在 280nm 处， 这一特性是直接测量紫外吸收法的基础。该方 法的主要优点是简便非破坏性。核酸是本方法 中最常见的干扰物质，可以通过测定 260nm 处 的吸收值加以校正（ 260nm 处，核酸的吸收值 大，而蛋白质的吸收值小） : 蛋白质纯溶液的 A280/A260 值约为 1.8 ，该值会随着核酸含量的 增加而减小。也要注意溶液中任何游离的芳香 族氨基酸在 280nm 处都有吸收，使蛋白质含量 的测定值偏高。含有少量核酸的蛋白质溶液的 最简单的校正步骤如下（要用石英制比色杯） ：

测定溶液在 280nm 处的吸收值（ A280 ） : 若吸收值大于 1 ，适当稀释后重测。 测定 260nm 处的吸收值（ A260 ）。 用关系式：［蛋白质］（ mg/mL ） =1.45 A 280 － 0.74 A 260 。酶含量的主要测定方法酶含量的主要测定方法

主要参考文献： １. 董慧茹等著《复杂物质剖析技术》 ２.Allan Jones,Rob Reed and Jonathan Weyers 著 李玲等译《生物学实验技术》 ３.Kent K.Stewart Richard E. Ebel 著上官 棣华等译《生物体系中的化学测量》 4. 何锡文等著《分析化学》 《生 物体相关物质的分子识别分析》

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