指导老师：郭祥群作者：吴晓斌NO

层析法是目前广泛应用的一种分离技术。是利用不 同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 按照不同的标准层析法有不的分类。根据层析峰的 位置及峰高或峰面积, 可以定性及定量。层析法与光 学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组 份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩 短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、 选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含 量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离 分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用 的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、 石油化工等方面也得到了广泛的应用。 在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析法、 高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法；

（一）聚焦层析法 聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的 原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过 程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一 等特点。 聚焦层析所用的凝胶首先用高 pH 溶液平衡，然后 用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液 pH 呈梯度下 降。 聚焦层析所用凝胶主要有两种： MONOP 和多元缓 冲液交换剂（ PBE ）。其中 MONOP 是带孔小珠， 孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。 多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚 焦层析的介质。各种凝胶性质见表。各种凝胶性质见表。

表 聚焦层析技术数据凝胶名称 pH 范围 洗脱MONOP11-8 Pharmalyte PBE11-8 MONOP9-6 多元缓冲液 96 PBE 多元缓冲液 74 PBE947-4

NONOP 可制成两种高效液相柱： MONOP HR5/5(1ml) ，和 MONOP HR5/20(5ml) 。使用时根据样 品复杂性选择相应的柱。 HR5/5 分辨率为 pI>0.2 ， HR5/20 pI>0.02 。 多元缓冲液交换剂 PBE ，属珠状交换剂凝胶，有 PBE 118 （ pH11-8 ）和 PBE （ pH9-4 ）。在聚焦层析时，通 过使用不同的洗脱液，可使交换容量发生改变，并且使 pH 达到更广的范围。

（二）离子交换层析法 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动 相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 ⒈离子交换剂预处理和装柱 ⒈离子交换剂预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀 的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则 不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处 理，使之成为带 H+ 或 OH- 的交换剂型。阴离子交换剂常用 “ 碱 - 酸 - 碱 ” 处理，使最终转为 -OH- 型或盐型交换剂；对于阳 离子交换剂则用 “ 酸 - 碱 - 酸 ” 处理，使最终转为 -H- 型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH 和离子强度。 已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒 大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱， 同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱 子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使 用。

⒉加样与洗脱 加样 ： 层析所用的样品应与起 始缓冲液有相同的 pH 和离子强 度，所选定的 pH 值应落在交换 剂与被结合物有相反电荷的范 围，同时要注意离子强度应低， 可用透析、凝胶过滤或稀释法 达此目的。样品中的不溶物应 在透析后或凝胶过滤前，以离 心法除去。为了达到满意的分 离效果，上样量要适当，不要 超过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算，通 常上样量为交换剂交换总量的 1 ％ -5 ％。 加样 ： 层析所用的样品应与起 始缓冲液有相同的 pH 和离子强 度，所选定的 pH 值应落在交换 剂与被结合物有相反电荷的范 围，同时要注意离子强度应低， 可用透析、凝胶过滤或稀释法 达此目的。样品中的不溶物应 在透析后或凝胶过滤前，以离 心法除去。为了达到满意的分 离效果，上样量要适当，不要 超过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算，通 常上样量为交换剂交换总量的 1 ％ -5 ％。 洗脱 ：已结合样品的离子交换前，可 通过改变溶液的 pH 或改变离子强度的 方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH 与离子强度。为了使复杂的组份分离完 全，往往需要逐步改变 pH 或离子强度， 其中最简单的方法是阶段 洗脱法 ，即 分次将不同 pH 与离子强度的溶液加入， 使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH 与离子强度的变化大，使许多洗脱 体积相近的成分同时洗脱，纯度较差， 不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是 连续梯度洗脱 。 洗脱时应满足 以下要求：①洗脱液体积应足够大，一 般要几十倍于床体积，从而使分离的各 峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够 高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 ③梯度不要上升太快，要恰好使移动的 区带在快到柱末端时达到解吸状态。目 的物的过早解吸，会引起区带扩散；而 目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

( 三 ) 亲和层析法 ( 三 ) 亲和层析法 亲 和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力， 从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、 DNA 与互补 DNA 或 RNA 、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维 生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对 分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混 合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才 能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改 变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质， 与基质共价连接的化合物称配基。 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的 活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求 层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。 亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏； 从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配 体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。

应用实例： 2- 胰凝乳蛋白酶的提纯 ⒈亲和吸附剂（ Σ- 氨基 -N- 乙酰 - Ｄ - 色氨酸）的制备 取一定体 积的 Sepharose4B 加 100mgCNBr 。搅拌混合物，滴加 2- 8mol/L NaOH ，使溶液 pH 维持在 11.0 。 20 ℃左右， 8-12 分钟 完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用 20 倍体 积冷的 0.1mol/L NaHCO3 （ pH9.0 ）溶液洗涤。将上述活化 的 Sepharose4B 与等体积 0.1mol/L NaHCO3 （ pH9.0 并在冰 箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入 α- 胰蛋白酶抑制剂（ Σ- 氨基 -N- 乙酰 - 色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升 Sepharose 4B 65μmol/L 。 4 ℃缓慢搅拌约 24 小时，而后再用 水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和 吸附剂在 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（ pH8.0 ）中保存备用。 ⒉分离 亲和吸附剂装柱后用 50mmol/L Tris-HCl （ pH8.0 ）缓 冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用 同样缓冲液淋洗柱子。流速为 30-60ml/ 小时，直至 280nm 无 光吸收时停止洗涤，然后改用 0.2mol/L 醋酸缓冲液（ pH3.0 ） 洗脱。

【参考文献】 【参考文献】 1. 王昌华. 曹维笑. 化学通报， 王昌华. 曹维笑. 化学通报， Derossi D, Kajiwara K, Osada Y, et al.Polymer Gels. New York:Plenum, Derossi D, Kajiwara K, Osada Y, et al.Polymer Gels. New York:Plenum, Osada Y,Gong J P.Prog Polym Sci, Osada Y,Gong J P.Prog Polym Sci, 高等学校化学学报， 高等学校化学学报， 1994 新年快乐！！ ~~~~