生物化学实验之五枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定食品与生物工程学院王章存.

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生物化学实验之五枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定食品与生物工程学院王章存

一、实验目的 1. 加深了解酶活力的概念。 2. 学习和掌握测定蛋白酶活力的方法。要重点掌握测定酶活的程序：将酶液稀释到一定程度；最适条件下进行酶促水解反应；测定反应量；根据酶活单位定义计算酶活力。

二、实验原理酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

三、实验仪器和试剂仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂 1. 0.2mol/L 盐酸溶液 2. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液 3. 0.55mol/L 碳酸钠溶液 4. 10%三氯乙酸溶液 5. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。 6. 酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。

7. 02mol/LpH7. 5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H2O)7 7. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。 8. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

四、操作步骤 (一) 酪氨酸标准曲线的制作取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00mL，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(二) 酶活力测定 1.酶反应：取一支试管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。以上两过程，应各做一次平行实验。

2. 滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入1. 0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5. 0 mL 0 2.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入1.0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。

实验过程示意图酪蛋白酪氨酸磷钼蓝磷钨蓝比色测定计算酶活力调pH值、温度，加入蛋白酶，反应一定时间加入Folin-酚试剂显色 680nm比色比色测定计算酶活力

五、结果处理 1.酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。 2.计算其中： A 样品—样品液的吸光度值 A 对照—对照液的吸光度值 K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数 V—酶促反应液的体积(本实验为5mL) T—酶促反应时间(本实验为10min) N—酶溶液稀释倍数

六、注意事项 1.实验中所用试管必须干净、干燥； 2.各种试剂的取用量要准确，用吸量管量取； 3.过滤时用干滤纸 4.Folin-酚试剂的显色条件为碱性。

七、思考题 1、实验中加入碳酸钠的目的是什么？ 2、蛋白质与Folin-酚试剂也可显色，实验中如何排除为水解蛋白对测定结果的干扰？ 3. 实验中哪些因素可能引起误差，如何操作避免这些误差。