Rubisco 和 Rubisco 活化酶 的生物学特性及其分离、纯化 研 究 生 : 陈 相 辉 导 师 : 王忠教授 专 业 : 植 物 学

Rubisco （ 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶 ）是光合 碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个 方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作 用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定 性作用 。 一般认为，在阳光下，有充足水分和肥料的田间， 植物的光合生产力受其 CO 2 固定反应所限制（李立人， 1989 ）。因此若能增加空气中 CO 2 的浓度，则可使光合速 率上升；若能降低空气中 O 2 的浓度，抑制其加氧酶的反应， 也可使植物的光合速率增加。然而大气中 CO 2 和 O 2 的浓度 是一定的，分别为 0.03% 和 21% ，因此如何提高 Rubisco 酶 的活性或者提高羧化酶和加氧酶反应的相对比值，从而提 高植物的净光合速率，便成为人们研究的一个重要课题。

Rubisco 在叶片中含量很高，占可溶性蛋白的 50% 以 上，然而此酶的催化活性却很低，酶的活化成为植物光合作 用碳同化的限制因素。通常认为该酶受 CO 2 、 Mg 2+ 、光等因 素调节，但在酶活化机制的研究中仍然存在很多矛盾和无法 解释的问题。近年人们在多种植物叶绿体中发现一种调节 Rubisco 活性的酶, 称之为 Rubisco 活化酶 (Rubisco activase) 。 该酶是一种核编码的叶绿体蛋白, 其活性被 ATP 促进。 Rubisco 和 Rubisco 活化酶的特性一直是光合作用研究的热 点问题，目前，对 Rubisco 及其活化酶的研究已取得了重大进 展，不仅提纯了 Rubisco 及 Rubisco 活化酶，建立了活性测定 方法，而且鉴定了它们的氨基酸序列, 克隆了它们的 cDNA ，完 成了它们的基因表达, 人们还研究了各种磷酸糖与 Rubisco 活 化酶的相互作用，初步探讨了外界因素对两者的影响。

1. Rubisco 和 Rubisco 活化酶的 发现、结构及其活性调节

1.1 Rubisco 的发现、结构及其活性调节 Rubisco 的发现 1947 年， Wildman 和 Bonner 首先从菠菜叶片细胞中发 现了组分 1 蛋白，其后又发现组分 I 蛋白广泛存在于植物体 中，是绿色植物叶片中可溶性蛋白的主要组分。后来 Weissbach A 等在 1956 年证明了组分 I 蛋白就是催化光合作 用中 CO 2 固定的 RuBP 羧化酶， 1971 年 Orgren W L 等又发 现 RuBP 羧化酶是一个双功能酶，还能催化 RuBP 的氧化作 用。此后该酶就被称为核酮糖 -1 ， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶， 简称 Rubisco 。目前许多植物的 Rubisco 蛋白都已被结晶， 例如烟草的 Rubisco 晶体呈立方体状，油菜的 Rubisco 蛋白 除了呈立方体状外，还有呈棱台状的 。

1.1.2 Rubisco 的两种类型  类型 I Rubisco 由 8 个大亚基和 8 个小亚基组成，广泛存在 于所有真核和大多数原核的光合有机体中，大亚基一般由 475 个氨基酸残基组成，不同来源的 Rubisco 大亚基序列之 间有 80% 以上的同源性。大多数 Rubisco 小亚基由 123 个氨 基酸残基组成，不同植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大 亚基低得多 [7] ，一般在 70% 左右，然而，小亚基序列中有两 个区域非常保守，即残基 10 ～ 21 和 61 ～ 67 ，暗示这些部分 可能有什么重要功能。  类型Ⅱ Rubisco 仅由 2 个大亚基构成，存在于一种紫色非 硫光合细菌深红红螺菌（ Rhodospirillum rubtnm ）。虽然 类型Ⅱ Rubisco 不含有小亚基，但它同样像类型 I Rubisco 一 样催化 RuBP 的羧化和氧化两个反应。

O 2 磷酸乙醇酸 光呼吸 RuBP PGA 光合 碳还原 CO 2 Rubisco Rubisco 的作用机制

1.2 Rubisco 活化酶的发现、结构及其特性 Rubisco 活化酶的发现 Rubisco 体内外活化机制的矛盾，引起了人们对 Rubisco 活化机理研究的极大兴趣。 1982 年 Somerville 等 发现拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）的突变株（ rca ）必 须生长在高浓度 CO 2 条件下，虽然它的 Rubisco 与野生型 的相同，但在光下却不能被激活。 Salvucci 等（ 1985 ） 进一步研究了 rca 与野生型之间叶绿体蛋白的差异，指出 突变株中丢失了 与 两个小肽。实验证明， 光下 Rubisco 的活化依赖于这两个肽段，现在人们把这两 个肽段合称为 Rubisco 活化酶（ Rubisco activase ）。迄 今，人们已利用免疫测定法（即 Rubisco 活化酶的抗体） 发现在许多高等植物、绿藻、蓝细菌都有 Rubisco 活化酶 的存在（ Salvucci 等， 1987 ）。

1.2.2 Rubisco 活化酶的分子特性 Rubisco 活化酶是一种核编码的叶绿体蛋白， 通常含有两种亚基（ 和 ）。但在不 同种中，亚基的种类与含量因植物种类的不同有 很大变化，如在烟草和玉米中仅含有一种亚基 41KD （唐如航等， 1997 ）；水稻、菠菜有 41KD 、 45KD 两条多肽（ To K Y ， 1999 ）。

1.2.3 Rubisco 活化酶的作用机制

1.2.4 Rubisco 活化酶和 ATP 在体外，活化酶对 Rubisco 的活化依赖于 ATP ，而被 ADP 抑制。 Robinson ， Portis （ 1998b ）和 Salvucci （ 1993 ） 指出纯化的活化酶对催化 ATP 水解具有较高活性，可以达 到 1.5μmolATP · mg -1 pro · min -1 。同时，水解反应要求 Mg 2+ 参 与，有一个较宽的 pH 范围，活性最高时， pH 为 8.0 ～ 8.5 。 测定 Rubisco 活化酶活性，发现缺乏 ATP 时， ATP 水解活性 和 Rubisco 活化活性均丧失。这表明 ATP 的水解是 Rubisco 活化酶的一个重要性质，是整个反应过程不可分割的部分。 Portis,1992 年报道了完整叶片内的活化酶活性同时受到 ATP 和 ADP 浓度的影响，即叶片内的 ATP/ADP 比值的变化 与 Rubisco 活性的变化密切相关。

2. Rubisco 和 Rubisco 活化酶的 分离、提纯

2 、材料与方法 2.1 材料 植物材料 植物材料 扬麦 5 号 2.2 试剂与仪器 高速冷冻离心机 液相层析收集系统 垂直板电泳系统 ……

2.3 Rubisco 的纯化

Rubisco 的纯化

2.4 Rubisco 活 化酶的分离纯化 2.4 Rubisco 活 化酶的分离纯化

3.2 Rubisco 活化酶的纯化

2.5 蛋白质的纯度鉴定 利用非解离聚丙烯酰胺 凝胶电泳和 SDS- 聚丙烯 酰胺凝胶电泳 Rubisco 纯 度鉴定。

Rubisco 的纯度鉴定结果 Rubisco 的非解离聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 Rubisco 的 SDS- 聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 大亚基 小亚基 Rubisco 标准蛋白 分子量 （ ×1000 ）

Rubisco 活化酶的 SDS-PAGE 图 谱 A 为 Rubisco 活化酶 ;B 为标准蛋白 Rubisco 活化酶纯度鉴定 活化酶 标准蛋白

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