蔬菜中 有机磷和氨基甲酸酯类 农药残留量快速检测 — 酶抑制率法 ( 分光光度法 ) 陈夏琴
分光光度法的原理简介 酶抑制率法 ( 分光光度法 )
吸光光度法 : 基于物质对光的选择 性吸收而建立的分析方法, 包括比 色法和分光光度法。 不同物质由于结构不同, 所吸收光 的波长及吸收程度不同, 这就是物质 对光的选择性吸收
当一束强度为 I 0 的平行单色光通过一均匀的吸收介质时， 由于吸光物质分子与光子的作用，一部分光子被吸收， 一部分光子透过介质。设透过的光强度为 I t ，则透光率 T 定义为 T=I t /I 0 ，而－ lgT 称为吸光度 A ，即 Ａ＝－ lgT=lgI 0 /I t 入射光 I 0 透射光 I t
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（ ）为横 坐标，吸光度（ A ）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得 一曲线，此曲线即为吸收光谱。 不同浓度的同一物质，它的最大吸收波长是不变的，但吸光度 随浓度增大而增大。 在最大吸收波长处测量吸光度，其灵敏度最高。
有色溶液对某一波长光吸收的强度与有色物质的浓度 c 及吸 光溶液的液层厚度 b 成正比，称为光吸收定律或朗伯－比尔 定律，其数学表达式为 A=εbc A C A T % T 式中： b 为液层厚度，单位为 cm ； c 为浓度，单位为 mol.L-1 ； ε 为摩尔吸光系数，单位为 L.mol-1.cm-1 。
光电比色法分光光度法（紫外 - 可见分光光度法） UV-VIS Ultraviolet Visual Spectroscopy 光源单色器吸收池检测器显示 I0I0 ItIt 参比 样品 入射光 I 0 透射光 I t
原理 在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱 酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度 呈正比。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物 （乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产 生黄色物质，用分光光度计在 412nm 处测定吸光度 随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以 判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类 农药的存在。
试剂 pH8.0 缓冲溶液 分别取 11.9g 无水磷酸氢二钾与３. ２ g 磷酸二氢钾，用 1000mL 蒸馏水溶解。 显色剂 分别取 160mg 二硫代二硝基苯甲酸 （ DTNB ）和 15.6mg 碳酸氢钠，用 20mL 缓冲溶液溶 解， 4 ℃冰箱中保存。 底物：取 25.0mg 硫代乙酰胆碱，加 3.0mL 蒸馏水 溶解，摇匀后置 4 ℃冰箱中保存备用。 乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶 解， 3min 的吸光度变化 ΔA 0 值应控制在 0.3 以上。摇 匀后置 4 ℃冰箱中保存备用。 主要仪器 分光光度计, 常量天平
分析步骤 样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪 成 1cm 左右见方碎片，取样品 1g ，放入烧杯或提取瓶中，加 入 5mL 缓冲溶液，振荡 1~2min ，倒出提取液, 静置 3~5min, 待 用。 对照溶液测试： 先于试管中加入 2.5mL 缓冲溶液，再加入 0.lmL 酶液、 0.1mL 显色剂，摇匀后于 37° C 放置 15min 以上 （每批样品的控制时间应一致）。加入 0.lmL 底物摇匀，此 时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应 3 min 的吸光度变化值 ΔA 0 样品溶液测试：先于试管中加入 2.5mL 样品提取液，其它操 作与对照溶液测试相同，记录反应 3min 的吸光度变化值 ΔA t
结果计算 抑制率 (%)=[(ΔA 0 -ΔA t )/ ΔA 0 ]×100 式中： ΔA 0 对照溶液反应 3min 吸光度的变化值； ΔA t 样品溶液反应 3min 吸光度的变化值；
结果判定 结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率 ≥50% 时, 表 示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农 药存在，样品为阳性结果。 阳性结果的样品需要重复检验 2 次以上。