ΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διάλεξη: «ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ» Παρουσίαση: Δρ. Μ.Χ. Αντωνέλου, 07/05/08 http://kyttariki.biol.uoa.gr, http://multimedia.biol.uoa.gr Ιστοσελίδες μαθημάτων ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΕΡΥΘΡΟΕΙΔΗ ΚΥΤΤΑΡΑ RBC (XVII) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΟ 90μm3 -140μm2 (98μm2) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ (Μαργαρίτης & Παπασιδέρη, 1979; Materia Medica Greca, 1:47) (Margaritis et al., 1977; J.Cell Biology, 72:47) X62.000 6-9nm Ψυκτοεξάχνωση/Μονόπλευρη σκίαση Ψυκτοεξάχνωση/Κυκλική σκίαση Επανασυγκροτημένα λιπιδικά κυστίδια 30Α 90Α X230.000 1960-’70 D. Branton H. Moore ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Μία από τις καλύτερα μελετημένες X100.000 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ Tυπικοί και «ιδιαίτεροι» Μεταφορά υλικών και πληροφορίας, ηλεκτροχημικό δυναμικό, επικοινωνία, ανοσολογική αναγνώριση, μεταγωγή σήματος κλπ Ικανότητα ελαστικής παραμόρφωσης RBC (cellular deformability) γεωμετρία ιξώδες κυτταροπλάσματος μηχανικές ιδιότητες μεμβράνης membrane deformability membrane stability ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ ελαστική/εκτατή/συμπιέσιμη-ανθεκτική ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΛΙΠΙΔΙΑΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ 95% Sp 4.1 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΛΙΠΙΔΙΑΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ 25 50 Total phospholipid (%) Total SM PC PE PS PA 25 50 Total phospholipid (%) Total SM PC PE PS PA PIPn SM, sphingomyelin PC, phosphatidylcholine PE, phosphatidylethanolamine PS, phosphatidylserine PA, phosphatidic acid PIPn, phosphatidylinositol-(n)-phosphate (Daleke DL, Curr.Opin.Hematol., 15:191, 2008) Outer leaflet Inner leaflet ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ Απομόνωση: Υποτονική αιμόλυση (20mOsm) Dodge et al., 1963; Arch. Biochem. Biophys., 100:119 Steck et al., 1971; Biochemistry 10:2617 Steck T.L., 1974; J. Cell Biol., 62:1 “White ghosts” ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ghosts σπεκτρίνες (1, 2) (280kd) αSp βSp 4.1R 4.2 (παλλιδίνη) (72kd) αγκυρίνες (2.1, 2.2, 2.3 κλπ) 4.9 (δεματίνη) 5 (β-ακτίνη) (45kd) 6 (G3PD) 7 (7.2b στοματίνη) (32kd) 8 (?) (21kd) αιμοσφαιρίνη (12-16kd) (Laemmli U.K., 1970) αSp βSp ank 2.1 2.2 2.3 3 4.1 4.2 4.9 5 7 8 (Fairbanks et al., 1971) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ γλυκοφορίνες Αντιγόνα ομάδων αίματος ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ Οι πρωτεΐνες της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης έχουν μεγάλο βαθμό συγκρότησης/ολιγομερισμού

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ > 500 spots (Bruschi et al., 2005; J Proteome Res., 4:1304)

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ (Kakhniashvili et al., 2004; Mol Cell Proteomics, 3:501)

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ 2C GpA, CD59 CD44 G3PD BCAM aldolase Glutathione transferase RAP1A, RalA (Kakhniashvili et al., 2004; Mol Cell Proteomics, 3:501) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ 340 proteins in membrane (252 soluble) (30% Membr.prot=B3) (Goodman et al., Exp.Biol.Med 232:1391, 2007 751 RBC membrane proteins) (20) (SA) (Pasini et al., Blood 2006) Binding (115), catalytic activity (98), transporters (47), signal transducer (29), structural activity (24) (small GTPases the most numerous intracellular signaling proteins in RBCs)

4 ΔΕΚΑΕΤΙΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ αφθονία, προσβασιμότητα νέες πρωτεϊνες, συμπλέγματα, δομές καθαρότητα μη-ερυθροειδή κύτταρα κληρονομικές μεμβρανοπάθειες μη-αιματολογικοί κλινικοί φαινότυποι ωρίμανση, γήρανση, κυτταρική απόσυρση κοινές αιματολογικές (και μη-) νόσοι εξωκυττάρια κυστιδιοποίηση αρχετυπικό σύστημα μελέτης αποτελεσματικότητα μεταγγίσεων DRM’s/rafts ΠΚΘ, απουσία πυρήνα, μιτοχονδρίων ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (Low) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ Band 3 macrocomplex 4.2 CD47, RhAG glycozyl. (Delaunay J., Blood Reviews, 2006) 4.2 CD47, RhAG glycozyl. B3-mut 4.2, CD47, Rh, RhAG Άμεση αλληλεπίδρ. και CD47/4.2 (gas-channels: ammonium transport function) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ

LIPID RAFTS Lipid rafts (Λιπιδικές μικροδομές ή «σχεδίες» ή «κανώ» DRM) Σχηματίζουν απομονωμένες πλατφόρμες (μικροδιαμερισματοποίηση) στη μεμβράνη λειτουργικά σημαντικές για τη δημιουργία συμπλόκων σηματοδότησης, διαλογή μεμβρανικών πρωτεϊνών Εκτεταμένες/πακεταρισμένες αλκυλοαλυσίδες λιπιδίων Ενσωμάτωση/αποκλεισμός Πρωτεΐνη-πρωτεΐνη Πρωτεΐνη-λιπίδια

LIPID RAFTS Lipid rafts ΕΜ: πλούσια σε σφιγγολιπίδια, χοληστερόλη και πρωτεΐνες (0.1%-3% of total EM proteins) όπως GPI-anchored proteins (AChE), stomatin (Δ, 7.2b), flotillins (Δ), Β3, peroxiredoxin-2, Hb, synexin, sorcin T Μερική συσχέτιση ορισμένων κατηγοριών RBC-LR με το σκελετό μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ή δεν περιέχουν καθόλου σκελετικές πρωτεΐνες? Gαs, Sp, actin, 4.1, 4.2 (εν μέρει σχετίζονται) (Salzer and Prohaska, 2001; Blood, 97:1141)

LIPID RAFTS 5 κύριες και πολλές δευτερεύουσες πρωτεΐνες (Murphy et al, 2004; Blood, 103:1920) Πολλαπλοί πληθυσμοί Lipid Rafts (stomatin/flotillin/synexin) ΜΔΕ-2008-Μεμβρανοπάθειες-Αντωνέλου

ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ Ανταλλαγή αερίων αναπνοής Ανταλλαγή ανιόντων

ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ Carbonic anhydrase II (metabolon with B3) Η ζώνη-3 είναι ο κύριος συνδέτης της μεμβράνης με το σκελετό

ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ 911αα / 90-100 kDa 52 kDa 43 kDa Πολυλειτουργική 33αα Πολυλειτουργική Γλυκοζυλιωμένη Φωσφορυλιώνεται Αντιγόνα Diego Ρύθμιση μεταβολισμού Γήρανση RBC Υποδοχέας παρασίτου ελονοσ. Νεφροί (pH) και εγκέφαλος (μίτ.) 911αα / 90-100 kDa ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ TEΤΡΑΜΕΡΗ H συσσωμάτωση της ζώνης-3 αυξάνει με την ηλικία/οξείδωση/μόλυνση Mutations: HS, SAO, HSt, oξέωση νεφρικών σωληναρίων. ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ ΚΥΡΙΕΣ ΔΕΥΤΕΡΕΥΟΥΣΕΣ ΕΡΥΘΡΟΕΙΔΙΚΕΣ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ GpA Ρυθμιστική πρωτεΐνη του συμπληρώματος Αντιγόνα ομάδων αίματος MN, Wright (Β=Ss) Φωσφορυλιώνεται Υποδοχείς παρασίτου ελονοσίας και Sendai Cell recognition/erythrophagocytosis Λειτουργεί αντισταθμιστικά με band 3 (-)GpA, (-) GpB  Φυσιολ. Μηχανική RBC Με πρόσδεση IgGs  Sk,  Deform., B3 Band 3, 4.1, 4.2 (?) CDA I, II, ΡΝΗ RBC-specific ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ Διμερισμός GpA στην ερυθροκυτταρική μεμβράνη ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ H GpA είναι πρωτεΐνη-συνοδός της B3 κατά τη βιοσύνθεση/trafficking (Williamson & Toye, BCMD, 2008, in press) 106 copies/RBC Anti-GpA  decrease in the rotational mobility of B3 Most dRTA mutations of B3 do not cause RBC phenotype due to GpA ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ Γλυκοφορίνη C I II Δευτερεύουσες γλυκοφορίνες Μη-ερυθροειδικές (πνεύμ., ήπαρ, νεφροί) Gerbich (Ge), Lsa, Webb, Dha 3 domains III ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ Γλυκοφορίνη C GpC-----4.1R*-----p55 Ρύθμιση κυτταρικού σχήματος Ρύθμιση μηχανικών ιδιοτήτων GpC-----4.1R*-----p55 (ΜcMulin, 1999) Hereditary elliptocysosis + variations ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΤΟΜΑΤΙΝΗ 31kDa, 7.2b Εφράζεται σε διαφορετικούς Ιστούς Υδρόφοβο domain (NH2, COOH* cyt) Membrane-associated (integral) Oligomeric (9-12 monomers) Κύριο συστατικό των RBC LR Σύνδεση με Sk $ in folds and protrusions Ρύθμιση διαπερατότητας ιοντ. Καναλ Ανοσοκατακρημνίζεται με μεταφ. Γλυκόζης Hereditary stomatocytosis (mutations?) 7.2b (Wang &Morrow, 2000) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΥΔΑΤΟΠΟΡΙΝΗ Channel-forming integral protein (CHIP28) Κύριος πρωτεϊνικός δίαυλος νερού Αρχετυπικό μέλος υδατοπορινών Οσμωτικός-υδατοεπιλεκτικός πόρος Ομοτετραμερές (4 πόροι) (γλυκοζυλιωμένος) NH2, COOH in cytoplasm Άφθονη σε νεφρούς, επιθήλια (-/-)  όχι κλινική συμπτωματολογία ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

Ετερογενώς γλυκοζυλιωμένη  σακχ.καταλοίπων  ενεργότητα μεταφ. ΜΕΤΑΦΟΡΕΑΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ GLUT1 Μη-ερυθροειδική 55 kDa, 700.000 12TM, NH2, COOH Part of 4.5b Ετερογενώς γλυκοζυλιωμένη  σακχ.καταλοίπων  ενεργότητα μεταφ. Επιταχύνει παθητική διάχυση γλυκόζης Dimers/tetramers ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

Εξαρτώμενη από ATP αποβολή Ca++ Ανταλλαγή Ca++/H+ 140 kDa Εξαρτώμενη από ATP αποβολή Ca++ Ανταλλαγή Ca++/H+ Ενεργοποιείται από το σύμπλεγμα calmodulin/Ca++ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

CD47 ΙΑΡ, Integrin-associated protein Σύμπλοκο Rhesus (Delaunay J., Blood Reviews, 2006) Σύμπλοκο Rhesus Surface glycoprotein, 50kd, storage lesion Σε nl RBC, η CD47 προσδένεται και ενεργοποιεί τη ρυθμιστική πρωτείνη α (SIRPa) των μακροφάγων, οδηγώντας σε παρεμπόδιση της ενεργοποίησής τους & της ερυθροφαγοκυττάρωσης (CD47-SIRPa signalling)

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Εκχύλιση κυττάρου με Triton X-100 3D structure βιμεντίνη δεσμίνη 3D structure ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ σκελετοί Sp’s 2D-structure 4.1 actin ίχνη Hb σκελετοί Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης (33-37 nm) 2D-structure ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Iδιαίτερα ανεπτυγμένος (65%)  εξασφαλίζει μηχανικές ιδιότητες ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Αυτό το μοντέλο βρίσκει εφαρμογή και σε άλλους ιστούς/κύτταρα/ οργανίδια με διαφορετική όμως οργάνωση και λειτουργία ΣΗΜΕΙΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ: Sp-ank (band 3) (***) Sp-4.1R-actin-p55-GpC Rh, RhAG-ank Sp, 4.1R  PS ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Πυκνό και νηματώδες δίκτυο, αλλά με έκταση και αρνητική χρώση… (Liu et al., 1987; J.Cell Biol., 104:527-536) (Palek & Sahr,1992) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

ΣΚΕΛΕΤΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ: Τα κομβικά σημεία διασταύρωσης των SpT μεταξύ τους και με τα πρωτονημάτια ακτίνης Οριζόντιες διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις σε επίπεδο SK 240-360 ΣΖ/μm2 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Eκτεταμένο, γραμμικό, εύκαμπτο, αρθρωτό, πολυλειτουργικό μόριο α, β υπομονάδες, ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΟΥΜΕΝΕΣ σε διμερή, τετραμερή Πλευρική και αντιπαράλληλη σύνδεση (αβ) Head-to-head of 2 (αβ)  tetramer α2β2 3-6 nm, 200-260 nm ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αρχαίες πρωτεΐνες, αλλά στην εξελιγμένη τους μορφή υπάρχουν μόνο στα μετάζωα 2 γονίδια α (chr1), 4 β-, 1 γονίδιο β-Η (chr14) (human) Συνδυασμοί ετεροτετραμερή  λειτουργίες Σκελετικός μυς, Golgi  homo-Τ-β Eπιθήλια, νευρικό σύστημα αρχετυπικό μέλος υπεροικογένειας Sp και δικτύων Sp σε άλλα κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια και ιστούς ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Μοριακό ελατήριο Διμερή: 29-37 nm in situ, 100 nm σε έκταση ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ * Επαναλήψεις δομής τριπλής έλικας 22 domains 19 domains Οι τριπλές έλικες σταθεροποιούνται από αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε υδρόφοβα κατάλοιπα που βρίσκονται σε συγκεκριμένες αποστάσεις μεταξύ τους ακολουθώντας ένα επαναλαμβανόμενο πρότυπο Ελατήρια προασαρμοζόμενου μήκους Δομική ομολογία, αλλά εν μέρει διαφορετικά λειτουργικά μόρια (αποικ) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ 1D-SDS-PAGE 2D-electrophoresis Υπο-domains κάθε υπομονάδας ανθεκτικά στη θρυψίνη (HE) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Oι σπεκτρίνες είναι μόρια αυτοσυγκροτούμενα, υψηλή συγγένεια αλληλεπ. Η αυτοσυγκρότηση in vitro είναι ανάλογη ΤoC και [Sp] In vivo (37oC) ευνοούνται τα ΤSp λόγω πολύ υψηλής [Sp] Tα TSp είναι η φυσιολογική μορφή συγκρότησης της Sp στο Sk (HE)

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Πυρήνωση ετεροδιμερούς α19-α22 β1-β4 Αρχικά αναπτύσσονται ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε α και β-υπομονάδες στη θέση πυρήνωσης οι οποίες εξασφαλίζουν το ζευγάρωμα στη σωστή φάση των τριπλετών κατά μήκος του διμερούς. Μετά την αρχική διασύνδεση, το διμερές σταθεροποιείται από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις έλικες (ασθενείς, αλλά πολλές), και περιελίσσεται η μία υπομονάδα γύρω από την άλλη σα σχοινί. ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς α1 α2 β17 υβριδική τριπλέτα Mη-ομοιοπολική διασύνδεση, ενδογενής ιδιότητα (Hb) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς pH Ιοντική ισχύ Θερμοκρασία Συγκέντρωση Sp Υψηλής-συγγένειας Sp-Ank  τοπικές  [Sp] υπομεμβρανικά που ευνοούν τον ολιγομερισμό Αντίθετα, η διασύνδεση Sp-actin είναι χαμηλής συγγένειας (μη-αυτοσυγκροτούμενη) και χρειάζεται την 4.1R Συνδέσεις Sp: διαμεμβρανικές πρωτεΐνες απευθείας διαμέσου ank με φωσφολιπίδια ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΚΤΙΝΗ Μόνο β-ισομορφή (βγ) Κοντά πρωτονημάτια 33-37 nm (δευτεροταγής δομή, αλληλεπιδράσεις) Μονομερής ακτίνη (G) ΔΕΝ συμμετέχει στο Sk Aπαντάται στα σύμπλοκα ζεύξης μαζί με 4.1R και Sp Mετά την πρόσδεση ενός μορίου 4.1R προκαλούνται δομικές αλλαγές στο πρωτονημάτιο που ευνοούν την πρόσδεση extra 4.1R, Sp ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

4.1R * Βοηθητική Sp-actin, GpC-p55 Σύμπλοκα ζεύξης 200.000 αντίγραφα/RBC Aρχετυπικό μέλος 4.1 family Eγκέφαλος, ήπαρ, έντερο, πάγκρεας, μετασυναπτικές μεμβράνες, πυρήνας, κυτταρικοί σύνδεσμοι Σχηματίζει πολυμοριακά σύμπλοκα με διαμεμβρανικές & άλλες πρωτεΐνες με ρόλο στη δομική σταθερότητα και μεταγωγή σήματος (Han et al., Nat.Struct.Biol., 7:871, 2000) ΑΝΚ * ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

4.1R Οι αλληλεπιδράσεις της 4.1R ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση και από το σύστημα calmodulin/Ca++ (αναστολή σύνδεσης σε μεμβράνη & Sp/actin). H πρόσδεση Ca++ στην calmodulin αυξάνει (20x) την πρόσδεση της calmodulin στην εξαρτώμενη από ασβέστιο θέση πρόσδεσης calmodulin της 4.1. Αυτό προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση της 4.1 που επιφέρει εξασθένιση των αλληλεπιδράσεών της με τις p55, GpC, B3

4.1R Aρθρωτή πρωτεΐνη-3 domains: Ι. Πρόσδεσης σε μεμβράνη (PS, B3, p55, calmodulin) ΙΙ. Πρόσδεσης σε Sp/actin (σπονδυλόζωα, ΗΕ) III. COOH domain (απόλυτα συντηρημένο στα μετάζωα) Brain Θηλαστικά (εκτεταμένα γεγονότα εναλλακτικού ματίσματος και θέσεων έναρξης ΜΦΡ mRNA) RBC General Neuron ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

Ghosts (Laemmli-linear 5-15%) Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του RBC SDS-PAGE: 4.1α/β, 80 & 78 kDa Μετα-ΜΦΡ τροποποίηση της Asn502 που συμβαίνει σταδιακά και αργά και προκαλεί β α. 4.1β/α: περιφερική αιμόλυση, αυξημένα ΔΕΚ Πρόκειται για κοινό μηχανισμό σε πολλά είδη θηλαστικών αλλά η τιμή του λόγου διαφέρει από είδος σε είδος. 4.1(-)  ΗΕ Ghosts (Laemmli-linear 5-15%) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΔΟΥΣΙΝΗ Sp/actin Phosphor. calmodulin Προάγει σχηματισμό ολιγομερών Sp/actin Phosphor. calmodulin Αλληλεπιδρά με άλλες υπομονάδες αδουσίνης Βοηθητική πρωτεΐνη του συμπλόκου Sp-actin (τριαδικό σύμπλοκο) Υπάρχει μόνο στα μετάζωα Άνθρωπο: 3 υπομονάδες/γονίδια (α, β, γ) RBC: ετεροδιμερή αβ, 15.000 μόρια/RBC (διμερή και τετραμερή)

ΑΔΟΥΣΙΝΗ Πρωτεΐνη κάλυψης των νηματίων ακτίνης (παρεμποδίζει μεταβολή μήκους τους και προάγει πρόσδεση Sp). Συνδέεται απευθείας σε ακτίνη αλλά με μεγαλύτερη συγγένεια σε Sp/actin ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

p55 Μέλος οικογένειας MAGUKs (Membrane-associated Guanylate kinase homologues) Οργάνωση Sk στοιχείων, κυτταρική σήμανση, cell proliferation, καταστολή όγκων RBC: SDS-PAGE band 4.9 4.1-GpC (δένει και στις δύο, αλλά δεν επιδρά στη συγγένεια αλληλεπίδρασης) (-)4.1R, (-)GpC  ολοκληρωτική απώλεια p55 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΔΕΜΑΤΙΝΗ Zώνη 4.9 Τριμερή (48, 52 kDa), 43.000/RBC Σφαιρική δομή Πακετάρισμα ακτίνης σε δέσμες Σύμπλοκο ζεύξης Με φωσφορυλίωση αναστέλλεται η λειτουργικότητά της ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΡΟΠΟΜΥΟΣΙΝΗ (ΤΜ) Actin-binding protein 2 μονομερή που αυτοσυγκροτούνται κεφαλή με ουρά κατά μήκος των αυλάκων της διπλής έλικας ακτίνης Καθορίζουν μήκος 33-37nm Έμμεσα ρυθμίζουν SpT 4 γονίδια (α, β, γ και δ) RBC: 29/27 kDa, 70-80.000 copies/RBC Σύμπλοκα ζεύξης: ΤΜ5 (γ) και TM5b (α) σε ομο- ή ετεροδιμερή 1) Αλληλεπιδρούν με 6 μόρια ακτίνης, 2)  συγγένεια για ΤD/actin ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΡΟΠΟΜΟΝΤΟΥΛΙΝΗ (TD) Πρωτεΐνη κάλυψης ΤΜ Σφαιρική 40.6 kda (πρώτα σε RBC) Iσομοριακή με ΤΜ. Αναστέλλει: 1)Συνεργατικότητα ΤΜ 2) Επιμήκυνση / αποπολυμερισμό ακτίνης ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΜΟΝΤΕΛΟ SUNG et al., 2000 Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk Στην πτυχωτή επιφάνεια της ΤΜ5 δημιουργείται μία θέση πρόσδεσης ΤD Η ΤΜ5 έχει 6 θέσεις πρόσδεσης ακτίνης Το σύμπλοκο ΤΜ5/TD καθορίζει ως χάρακας το μήκος ακτίνης 33-37 nm Tα πρωτονημάτια ακτίνης ευνοούν την πρόσδεση 6 SpT Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ Sp (T) 10x Πρωτεΐνη-συνδέτης (215 kDa), φωσφορυλίωση Αρθρωτή (4 domains) Domain πρόσδεσης σε μεμβράνη (24 αντίγραφα αλληλουχίας 33αα Επαναλήψεις ΑΝΚ) Nεκρικό domain Sp (T) 10x COOH-domain ρύθμισης (εναλλακτ.μάτισμα) 2.2* ank (186 kDa), ανθρώπινη αγκυρίνη ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ (-) ank  band 3 dimers Μεταγραφικοί παράγοντες, σκελετικές πρωτεΐνες, τοξίνες Μηχανισμοί αναγνώρισης και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ Μεταγωγή σήματος, Ενδοκυττάρωση, Πολωμένη κατανομή πρωτεϊνών στη μεμβρ. (Restricted, Broadly, Giant) (2.400αα) Μακροφάγα Πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΑΛΛΙΔΙΝΗ (4.2) 72 kDa, 200.000 copies/RBC Περιφερική με υδρόφοβες ιδιότητες Φωσφορυλιωμένη Ν-myristylated (myristic acid) Παλμιτιλιωμένη (palmitic acid) (b3,p55) Το πρόσθετο υδρόφοβο τμήμα  αλληλεπιδράσεις με μεμβράνη (-) ΙΙΙ exon  επιθηλιακά κύτταρα Εγκέφαλος, Νεφροί, Λεμφοκύτταρα, PLT Tετραμερή-Hereditary spherocytosis-like (hemolytic anemia, εύθρ.RBC) Band 3 (* ενίσχυση σύνδεσης Β3-Sk, εκχύλιση), ank, 4.1R(?), ΑΤΡ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Oργάνωση αντιστρεπτά μεταβλητή –Πυκνός-Ελαστικός-Εκτατός Σύμφωνα με ένα μοντέλο, η διαφορετικού βαθμού συμπίεση συγκεκριμένων μορίων Sp προκαλεί αλλαγές στο γεωμετρικό σχήμα του Sk και αντιστρ.παραμόρφωση της μεμβράνης αλλά όχι αλλαγή στη συνολική επιφανειακή έκταση (ΣΖ, θραύση) ΣΖ 2.8x 8x

μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση ακυλίωση λιπαρών οξέων ΣΚΕΛΕΤΟΣ  Αλληλεπιδράσεων   deformability (HE)  Αλληλεπιδράσεων σε ΣΖ   membrane stability (HS) AYTOΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥ: Βοηθητικές πρωτεΐνες Ca++/calmodulin/calpain Phosphorylation Μετα-ΜΦΡ τροποποιήσεις: ΔΟΜΙΚΕΣ Ή ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ Μη-αντιστρεπτές μυριστιλίωση 4.2 οξείδωση μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση πρωτεόλυση Αντιστρεπτές φωσφορυλίωση ακυλίωση λιπαρών οξέων ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Ο Σκελετός ως μηχανισμός διαλογής πρωτεϊνών στο ερυθροκύτταρο Η εξωκυστιδιοποίηση ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις του Sk με τη μεμβράνη Σκελετοί Sp-ANK εκτός της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Δομική υποστήριξη κυτταρικής μεμβράνης Ρύθμιση κατανομής/λειτουργίας διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και μεμβρ. ενζύμων σε πολωμένα κύτταρα Διαλογή πρωτεϊνών Αρχιτεκτονική πυρήνα κατά τη μίτωση Ρύθμιση μονοπατιών μεταγωγής σήματος

ΣΚΕΛΕΤΟΙ Sp-Ank RBC Πυκνοί Εκτεταμένοι Ομοιογενείς Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης ΕΚΤΟΣ RBC Σποραδικοί Μακρύτερα νημάτια ακτίνης Μικροσωληνίσκοι (δυνείνη, δυνακτίνη) υποδοχείς/ microdomains/πρωτεΐνες μη-RBC Επιθήλια, Νευρικό, Golgi ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

GOLGI Διατήρηση δομής, δυναμικής φύσης, διαμερισματοποίησης Διαλογέας πρωτεϊνών ανάλογος της κλαθρίνης στα καλυμμένα βοθρία Προσδένει ποικιλία πρωτεϊνών Επιλεκτική συγγένεια 2D-ολιγομερείς δομές Κατάσταση δυναμικής συγκρότησης Ρυθμίζει συγκράτηση πρωτεϊνών στις μεμβράνες Golgi εμποδίζοντας την είσοδό τους σε εκκριτικά κυστίδια μεταφοράς ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ Στα τελικά στάδια της ωρίμανσης ερυθροβλαστών σε ΔΕΚ, RBC σημειώνονται ριζικές αλλαγές (nucl., TfR, microtub, membr, Sk, S/V) Διαφοροποίηση δομικών συστατικών ερυθροβλάστεςRBC Οι Sk πρωτεΐνες συντίθενται/συγκροτούνται σε Sk σε διαφορετικές φάσεις κατά την ερυθροποίηση και σε ποικίλοντα ποσά Με την ωρίμανση αλλάζουν οι μηχανικές ιδιότητες κυττάρων (στα ΔΕΚ η διασύνδεση Sk  μεμβράνης είναι ακόμα ασθενής) (?) Ο Sk αυτοσυγκροτείται (Μετα-ΜΦΡ) αλλά ή αυτοσυγκρότηση πρέπει να γίνεται υπομεμβρανικά. επιλεκτική/ταχεία αποικοδόμηση β-σπεκτρίνης μεμβρανικοί υποδοχείς (akn) 3. «βοηθητικές πρωτεΐνες» (4.1R, TM5-TD) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ Η βιογένεση είναι μία σπάταλη διαδικασία (2-3x αSp/β) Η σύναψη συμπλόκων σταθεροποιεί τα μόρια και τα προστατεύει από τον καταβολισμό. Sp, ank  ασταθές/παροδικό προ-συγκροτούμενο κυτταροσκελετικό δίκτυο (ανακύκλωση, 10% παροδική συγκρότηση) Band 3, 4.1  ευσταθές membrane-associated system  σύνθεση Sp, actin, ank,  ανακύκλωση,  συγκρότηση σε Sk  σύνθεση Band 3, 4.1 (isoforms) Ανθρώπινοι προερυθροβλάστες in situ σύγχρονη σύνθεση b3/Sp/ank. (-/-)ΑΕ1 mouse  φυσιολογική συγκρότηση Sk κατά τη διαφοροποίηση ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΕΛΟΣ Α’ ΜΕΡΟΥΣ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου