ΔΙΑΛΕΞΗ 14 Τεχνικές Ανάλυσης – Πειραματικά εργαλεία για την εξερεύνηση των γονιδίων

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η δυνατότητα να πειραματιζόμαστε με το DNA περιλαμβάνει τις τεχνικές του ‘ανασυνδυασμένου DNA’, της ‘συρραφής γονιδίων’ και της ‘γενετικής μηχανικής’ Οι εξελίξεις είχαν σημαντικές επιπτώσεις σε όλους τους τομείς Αστυνομία, ταυτοποίηση υπόπτων στην ιατροδικαστική Ανίχνευση μεταλλάξεων σε κληρονομικά νοσήματα Παραγωγή φαρμάκων Απορρυπαντικά πλυντηρίων!! (θερμοανθεκτικές πρωτεάσες που διασπούν λεκέδες και αίμα)

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι βιολόγοι ανέπτυξαν μεθόδους απόσπασης κυττάρων από τους ιστούς και διαχωρισμού των διαφόρων κυτταρικών τύπων Αυτά μπορούν να αναπτυχθούν στο εργαστήριο ως καλλιέργειες Για το διαχωρισμό χρησιμοποιούνται πρωτεολυτικά ένζυμα που διαταράσσουν τους δεσμούς μεταξύ των κυττάρων

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα περισσότερα κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε τρυβλίο καλλιέργειας Όμως παύουν να διαιρούνται μετά από ένα ορισμένο αριθμό διαιρέσεων Τα περισσότερα κύτταρα δεν εκφράζουν το ένζυμο της τελομεράσης που ανανεώνει τα άκρα των χρωμοσωμάτων και συντηρεί την κυτταρική διαίρεση Έτσι, αυτά σε κάποιο σημείο σταματούν να διαιρούνται Εάν τροποποιηθούν γενετικά μπορούν να διαιρούνται απεριόριστα (αθανατοποιημένα) και να διατηρηθούν σε καλλιέργεια ως κυτταρική σειρά

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΟΥ DNA Προέρχονται κυρίως από βακτήρια Τα κλάσματα του DNA μπορούν να διαχωριστούν σε πήκτη αγαρόζης Τα κλάσματα τοποθετούνται στο ένα άκρο, εφαρμόζεται ένα ηλεκτρικό πεδίο και επειδή το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο ακολουθεί μια πορεία προς τον θετικό πόλο Τα μικρότερα κλάσματα κινούνται σε μεγαλύτερη απόσταση και αντιθέτως τα μεγαλύτερα Για να γίνουν ορατά, εκτίθενται σε χρωστικές που προσδένονται στο DNA και φθορίζουν στο υπεριώδες φώς

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA

ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΝΟΥΚΛΕÏΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Εφόσον ένας κλώνος DNA μπορεί να ζευγαρώσει με ένα συμπληρωματικό κλώνο η ιδιότητα αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην τεχνική του υβριδισμού Οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των κλώνων μπορούν να διασπαστούν με θέρμανση ή αλλαγή του pH Αν η διαδικασία αναστραφεί, οι συμπληρωματικοί κλώνοι ξανασχηματίζουν διπλές έλικες Αυτή η αναδιάταξη ονομάζεται υβριδισμός

ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΩΝ ΤΟΥ DNA Με τον καθορισμό της αλληλουχίας των βάσεων του DNA, έχει καθοριστεί πλήρως το γενετικό υλικό του ανθρώπου (human genome project)

ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Η αναζήτηση μιας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας ένα ανιχνευτή Είναι ένα μικρό μονόκλωνο κομμάτι DNA που χρησιμοποιείται σε αντιδράσεις υβριδισμού για ανίχνευση εξειδικευμένου γονιδίου Παράδειγμα – δρεπανοκυτταρική αναιμία Στο γονίδιο της β αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης, η αλληλουχία GAG αλλάζει σε GTG Για την προγεννητική διάγνωση, απομονώνονται κύτταρα από το έμβρυο, παρασκευάζεται DNA και χρησιμοποιείται η τεχνική του υβριδισμού

ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ IN SITU Για τον εντοπισμό ειδικών αλληλουχιών DNA ενώ αυτό βρίσκεται ακόμη στη φυσιολογική του θέση στα κύτταρα ή τα χρωμοσώματα, διεξάγεται η τεχνική του υβριδισμού in situ Οι ανιχνευτές, σημασμένοι με φθορίζουσες χρωστικές υβριδίζονται σε ολόκληρα χρωμοσώματα για να αποκαλύψουν τη θέση ενός γονιδίου πάνω στο χρωμόσωμα

Το ένζυμο λιγκάση συγκολά τις εγκοπές στο σκελετό του DNA Όταν απομονωθεί μια αλληλουχία DNA, μπορεί να επανασυνδεθεί με άλλα κομμάτια DNA για να δημιουργήσει νέους συνδυασμούς Το ένζυμο λιγκάση συγκολά τις εγκοπές στο σκελετό του DNA Αυτό το ανασυνδυασμένο DNA μπορεί να εισαχθεί σε κύτταρα σαν τα βακτήρια και να μείνει σαν ανεξάρτητη οντότητα (πλασμίδιο)

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ Το πλασμίδιο είναι ένα μικρό κυκλικό μόριο DNA που αντιγράφεται μέσα στα βακτήρια και παραμένει σαν ανεξάρτητη οντότητα μέσα στο ξενιστή Συνήθως, περιλαμβάνει και ένα γονίδιο για κάποια επιλέξιμη ιδιότητα, όπως η αντοχή στα αντιβιοτικά, που επιτρέπει την ταυτοποίηση των βακτηρίων που έχουν προσλάβει το πλασμίδιο

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ Για να κατασκευάσει κάποιος πολλά αντίγραφα από ένα πλασμίδιο, καλλιεργεί τα βακτήρια στην παρουσία του αντιβιοτικού Εκατομμύρια αντίγραφα του πλασμιδίου παράγονται Στη συνέχεια τα βακτήρια υφίστανται λύση, απομακρύνεται το βακτηριακό DNA και απομονώνεται το DNA από το πλασμίδιο

ΓΕΝΩΜΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Όταν κατακερματιστεί το ανθρώπινο DNA και κλωνοποιηθεί σε πλασμίδια-φορείς, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μπορούν να καλλιεργηθούν σε βακτήρια και να πολλαπλασιαστούν Η συλλογή των ανασυνδυασμένων κλασμάτων DNA ονομάζεται γενωμική βιβλιοθήκη

cDNA ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Η διαφορά της γενωμικής βιβλιοθήκης από τη βιβλιοθήκη cDNA, είναι ότι στη δεύτερη το DNA δεν είναι χρωμοσωματικό Είναι DNA που έχει αντιγραφεί από τα μόρια των mRNA που υπάρχουν σε ένα κύτταρο ή ιστό Απομονώνεται mRNA Χρησιμοποιείται το ένζυμο αντίστροφη μεταφραφάση για παρασκευή cDNA Το cDNA κλωνοποιείται σε πλασμίδια για να δημιουργηθεί η βιβλιοθήκη Τα πλασμίδια πολλαπλασιάζονται σε βακτήρια

ΔΙΑΦΟΡΕΣ Η γενωμική βιβλιοθήκη περιέχει την ίδια αλληλουχία βάσεων του DNA, όπως τον πυρήνα του κυττάρου από τον οποίο προήλθε, ενώ η cDNA βιβλιοθήκη περιέχει τις αλληλουχίες του εκφρασμένου mRNA από το κυτταρόπλασμα Η cDNA βιβλιοθήκη περιέχει κλώνους που δεν διακόπτονται από ιντρόνια, ρυθμιστικές περιοχές ή διαστηματικό DNA, αλλά μόνο κωδικοποιητικές αλληλουχίες Ανάλογα με τα κύτταρα από τα οποία δημιουργήθηκε η cDNA βιβλιοθήκη θα προκύψουν και οι ανάλογοι κλώνοι

PCR Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πολλαπλασιάζει επιλεγμένες αλληλουχίες DNA χωρίς να χρειάζονται κύτταρα Ένα εκμαγείο DNA χρησιμοποιείται για να σχεδιαστούν συγκεκριμένοι εκκινητές Οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA που μας ενδιαφέρει Το ένζυμο DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA σε πολλά αντίγραφα χρησιμοποιώντας νουκλεοτίδια

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Πώς κατασκευάζονται εντελώς νέα μόρια DNA; Πώς μελετούνται πρωτεΐνες που δεν βρίσκονται σε αφθονία στα κύτταρα; Πώς παράγονται πρωτεΐνες σε μεγάλες ποσότητες για φαρμακευτική χρήση; Χρησιμοποιείται ανασυνδυασμένο DNA κλωνοποιημένο σε πλασμίδια που περιέχουν τους απαραίτητους υποκινητές για μεταγράφη μιας αλληλουχίας DNA