Βλαστικά κύτταρα – εμβρυονικά καρκινώματα

Πολυδύναμες κυτταρικές σειρές - διαφοροποίηση

Βλαστικά κύτταρα – εμβρυονικά καρκινώματα Τα εμβρυονικά καρκινώματα μπορούν να προκύψουν αυθόρμητα από ελλατωματικά γενετικά κύτταρα ή να παραχθούν κατά την εξωμήτρια εμφύτευση πρώιμων εμβρύων. Περιέχουν πολλά είδη διαφοροποιημένων ιστών (ακόμα και μαλλιά, δόντια και άκρα.....γιαυτό ονομάζονται και τερατοκαρκινώματα) Σε αντίθεση με τις καλοήθεις μορφές, τα τερατοκαρκινώματα περιέχουν σημαντικούς πληθυσμούς αδιαφοροποίητων βλαστικών κυττάρων που μπορούν να απομονωθούν και να καλλιεργηθούν επ΄άπειρον σαν αδιαφοροποίητες κυτταρικές σειρές. Τα

Οι σειρές NTERA 2 (ATCC, CRL-1973), κυτταρική σειρά εμβρυοκαρκινώματος όρχεων (Homo sapiens) Ρ 19 (ATCC, CRL-1825 ), κυτταρική σειρά εμβρυοκαρκινώματος (Mus musculus) πολλοί κλώνοι έχουν απομονωθεί από τη πρωταρχική σειρά με διαφορετικές ιδιότητες: P19 RAC65 που δεν αποκρίνονται σε ρετινοικό οξύ ,P19C16 που διαφοροποιούνται πιο εύκολα σε καρδιακά κύτταρα επειδή έχουν καλλιεργηθεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε συνθήκες που προάγουν τη μεσοδερμική διαφοροποίηση. Επίσης, υπερέκφραση γονιδίων που μπορούν να «οδηγήσουν» τη διαφοροποίηση οδηγεί σε διαφορετικούς κλώνους F9 (Mus musculus )

Προέλευση Ρ19 Έμβρυα 7.5 ημερών που προήλθαν από διασταύρωση C3H/He θηλυκών και αρσενικών με χρωμόσωμα Χ που φέρει διάφορα αλλήλια, εμφυτεύθηκαν σε όρχεις δέκτη C3H/He. Τα αδιαφοροποίητα Ρ19 κύτταρα είναι ευπλοειδή με καρυότυπο 40:ΥΧ και μπορούν να αυξάνουν σε καλλιέργεια χωρίς τη παρουσία βοηθητικών κυττάρων. Η φύση των κυττάρων αυτών διαπιστώθηκε μετά από εισαγωγή τους σε βλαστοκύστεις και την ανίχνευσή τους σε ιστούς όλων των βλαστικών κυττάρων –ακόμα και όταν εισαχθεί ένα μόνο κύτταρο Ρ19

Διαφοροποίηση in vitro Σημαντική προυπόθεση για τη διαφοροποίηση των κυττάρων είναι η δημιουργία –μη προσκολλημένων- εμβρυοειδών σωματίων. Η έναρξη της διαφοροποίησης σημειώνεται όταν τα εξωτερικά κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται σε ενδοδερμικά κύτταρα. Η παρουσία ορμονών, ρετινοικού οξέος, επάγει τη διαφοροποίηση και ο συνδυασμός συσσωματωμάτων-ρετινοικού μπορεί να οδηγήσει σε κύτταρα όλων των βλαστικών στιβάδων. Ειδικά για τα Ρ19, η υψηλή συγκέντρωση ρετινοικού οδηγεί στο σχηματισμό νευρωνικών και γλοιακών ιστών ενώ το DMSO σε ποικιλία ενδοδερμικών κια μεσοδερμικών ιστών.

Διαφοροποίηση ΝΤ2 κυττάρων 2 x 106 ΝΤ2 κύτταρα (πολυδύναμα, εμβρυïκά) 5 εβδομάδες σε DMEM 10% FBS +10μΜ RA Έναρξη διαφοροποίησης Τελικώς διαφοροποιημένοι νευρώνες (unpolar) στην επιφάνεια μη νευρικών κυττάρων 2 ημέρες σε DMEM 10% FBS (conditioned medium) Εμπλουτισμός με τρυψινοποίηση (Replate I) Τελικώς διαφοροποιημένοι νευρώνες (unpolar), στην επιφάνεια νευρογλοιακών-αστρογλοιακών κυττάρων 2 εβδομάδες σε DMEM 5% FBS+Μιτωτικοί αναστολείς Εμπλουτισμός με τρυψινοποίηση (Replate ΙI) Τελικώς διαφοροποιημένοι νευρώνες (polar) Εμπλουτισμός με τρυψινοποίηση (Replate ΙII) In vitro differentiation DMEM 10% FBS σε poly-D-lysine / laminin (matrigel) Ώριμοι νευρώνες με άξονες και δενδρίτες

Διαφοροποίηση Ρ19 κυττάρων (aggregates) 4 ημέρες σε a-MEM 10% FBS + 0,5μΜ RA σε bacter. grade dishes (aggregates) 7 ημέρες σε a-MEM + 5 μg/ml Ara-C 4 x 105 P19 κύτταρα (πολυδύναμα, εμβρυïκά) Έναρξη διαφοροποίησης Aggregates νευρικών / μη νευρικών κυττάρων σε culture grade dishes Τελικώς διαφοροποιημένοι νευρώνες με άξονες και δενδρίτες Καταστολή ανάπτυξης μη νευρικών κυττάρων

Παράγοντες διαφοροποίησης κυττάρων Ρ19

Δείκτες διαφοροποίησης

Δείκτες διαφοροποίησης

Δείκτες διαφοροποίησης

Μορφολογία των διαφοροποιημένων καρδιακών

Φυσιολογία των καρδιακών μυοκυττάρων L-type calcium and transient outward channels are expressed from very early on, while sodium and delayed and inward rectifier channels are upregulated at somewhat later stages during differentiation, which mirrors the in vivo murine cardiomyocyte differentiation during embryogenesis. Spontaneous cardiomyocyte action potentials exhibit a low upstroke velocity, which often can be enhanced by hyperpolarizing the cells, hence activating thus far dormant ion channels to contribute to the action potential upstroke.

Action potential duration decreases considerably during the differentiation of spontaneously beating cells. In late stages, non-beating myocytes can be found which only generate action potentials upon electrical stimulation. Their shape is comparable to neonatal / juvenile ventricular mouse myocytes in culture. During cardiomyocyte differentiation, the lipid composition of the plasma membrane changes, which could be important for tuning the electrical excitability of the cell.

διαφοροποίηση σε νευρικά κύτταρα Διαφοροποίηση παρουσία ρετινοϊκού οξέος (RA) και μιτωτικών αναστολέων (10μM 5-fluoro-2-deoxyuridine, 10μM Uridine, 1μM Cytosine-b-D-arabinoside) σε, πλήρως διαφοροποιημένους, μετα-μιτωτικούς νευρώνες, οι οποίοι εκφράζουν λειτουργικούς GABAΑ και NMDA υποδοχείς.

Ανοσοκυτταροχημεία σε NT2 και P19 κύτταρα ΝΤ2 Ρ19 Syn / Tuj1 (1:10) (1:200)

Ανοσοκυτταροχημεία σε ΝΤ2-Ν κύτταρα Synaptophysin Tuj1 (b-III tubulin) Syn/Tuj1 (1:10) (1:200)

ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ 2 - Ν Επομένως... ΝΤ 2 - Ν ΝΤ2 ΝΤ2-N Ρ19 Ρ19-N P19-N ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ2-Ν Ρ19-Ν ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ2-Ν Ρ19-Ν ΝΤ2 ΝΤ2-Ν Ρ19 Ρ19-Ν ΝΤ2-Ν Ρ19-Ν

ΝΤ2 Δείκτες: Map2, Tau (8 εβδομάδες)

exposure to differentiating agent RA triggers an apoptotic commitment in a subset of postmitotic hNT neurons.

exposure to differentiating agent RA triggers an apoptotic commitment in a subset of postmitotic hNT neurons.

ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΙΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΥΠΟΘΑΛΑΜΟΥ

Μεταγραφικοί παράγοντες Involvement of bone morphogenetic proteins (BMPs) in cardiac differentiation was strongly suggested by the observation that BMP soaked beads elicit ectopic expression of Nkx2.5 and GATA-4 in chick embryos Application of noggin, a natural inhibitor of BMPs, antagonized cardiac differentiation. Overexpression of noggin in P19Cl6 cells (P19Cl6[noggin]) prevented DMSO-induced cardiac differentiation as determined by absence of spontaneously beating cells, cardiac transcription factor and contractile protein gene expression GATA-4, Nkx2.5 and MEF2c most likely form a self amplifying genetic system leading to cardiac commitment and differentiation.

Σηματοδοτικοί μηχανισμοί

βιβλιογραφία Andrews PW. Teratocarcinomas and human embryology: pluripotent human EC cell lines. APMIS 1998;1:158–167. Masters JR. HeLa cells 50 years on: the good, the bad and the ugly. Nature Rev Cancer 2002;2:315–319. Skerjanc IS. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med 1999;9:139–143.