ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4ο ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Ανασυνδυασμένο μόριο DNA Απομόνωση περιοριστικών ενδονουκλεασών (ένζυμα) Απομόνωση ειδικών φορέων που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA ο άνθρωπος ερευνά, επεμβαίνει και τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών Ανασυνδυασμένο μόριο DNA τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια από 2 ή και περισσότερους οργανισμούς μεταφέρεται σε βακτήριο ή ευκαρυωτικό κύτταρο (κύτταρο-ξενιστής) οι απόγονοι κληρονομούν τις νέες ιδιότητες Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA: Γενετική Μηχανική Οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό συνέβαλαν: στην κατανόηση της ζωής και της εξέλιξης στη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του ανθρώπου Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA: περιλαμβάνει τις τεχνικές που οδηγούν σε μεταφορά του γενετικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο Στάδια: Κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA όλο το DNA του οργανισμού δότη απομονώνεται κόβεται με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες ενώνεται με το φορέα κλωνοποίησης Ανασυνδυασμένο DNA Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Μεταφορά του ανασυνδυασμένου DNA σε κύτταρο-ξενιστή Φορέας κλωνοποίησης: μόριο DNA π.χ. πλασμίδιο ή DNA φάγων που αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο-ξενιστή Μεταφορά του ανασυνδυασμένου DNA σε κύτταρο-ξενιστή Μετασχηματισμός: η εισαγωγή του ανασυνδυασμένου DNA σε βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή Επιλογή και απομόνωση των κυττάρων-ξενιστών Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ένα μόριο DNA → πολλαπλασιάζεται → αποικία που αποτελεί βακτηριακό κλώνο (κάθε κλώνος διαφορετικός από τους υπόλοιπους) Κλώνος: ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών Κλωνοποίηση: διαδικασία κατασκευής μεγάλου αριθμού κλώνων Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια Ρόλος: EcoRI: απομονώθηκε από το E. coli και αναγνωρίζει την αλληλουχία δημιουργούνται μονόκλωνα άκρα το κάθε άκρο έχει 2Α και 2Τ τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση 1.προστατεύουν τα βακτήρια από την εισβολή "ξένου" DNA 2.αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ "κόβει" μεταξύ G και A Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Χαρακτηριστικοί τύποι φορέα Προϋποθέσεις που πρέπει να πληρούν τα πλασμίδια: να έχουν τη συγκεκριμένη αλληλουχία μόνο μια φορά να έχουν τουλάχιστον 1 γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό DNA φάγων (πχ βακτηριοφάγος λ): Χρησιμοποιείται για την ενσωμάτωση μεγαλύτερων κομματιών "ξένου" DNA Πλασμίδια DNA φάγων Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ cDNA ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ Περιέχει αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων του ίδιου κυτταρικού τύπου Απομονώνεται από αλληλουχίες των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή από εξώνια Στάδια κατασκευής cDNA Βιβλιοθήκης: Απομόνωση ώριμου mRNA συγκεκριμένου γονιδίου Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA) Παραγωγή υβριδικών μορίων mRNA-cDNA Διάσπαση mRNA με χημικές ουσίες ή αποδιάταξη με θέρμανση Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Ένζυμα που συμμετέχουν στην κατασκευή μιας cDNA Βιβλιοθήκης: Το cDNA αποτελεί το καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA Δημιουργία δίκλωνου DNA Εισαγωγή σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους Κλωνοποίηση Ένζυμα που συμμετέχουν στην κατασκευή μιας cDNA Βιβλιοθήκης: DNA πολυμεράση DNA δεσμάση Αντίστροφη μεταγραφάση Περιοριστική ενδονουκλεάση Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Αποδιάταξη: επίδραση στο DNA με χημικές ουσίες ή αύξηση θερμοκρασίας → σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου → οι αλυσίδες αποχωρίζονται η μία από την άλλη Υβριδοποίηση: σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή συμπληρωματικών DNA-RNA Εντοπισμός συγκεκριμένου τμήματος γονιδιωματικής βιβλιοθήκης: Το DNA της βιβλιοθήκης αποδιατάσσεται Χρήση ιχνηθετημένων ανιχνευτών μορίων DNA ή RNA που περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το κλωνοποιημένο DNA οι ανιχνευτές αναμιγνύονται με το DNA της βιβλιοθήκης και υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους τμήμα Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Επιτρέπει, εκατομμύρια φορές, την επιλεκτική αντιγραφή ειδικών αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου Εφαρμόζεται από το 1985 Συμβάλλει στην Ιατρική (διάγνωση ασθενειών π.χ. AIDS) Εγκληματολογία (διαλεύκανση υποθέσεων) Μελέτη απολιθωμάτων Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©

Ευχαριστώ για την προσοχή σας Επιμέλεια: Δ.Κωστανίκος-Βιολόγος ©