κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές ακολουθίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA Είναι τα βιολογικά «ψαλίδια» Μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται συνήθως είναι η EcoRI που απομονώνεται από το βακτήριο Εsherichia coli animation

Ακολουθία αναγνώρισης Κάποια είδη περιοριστικών ενδονουκλεασών Ακολουθία αναγνώρισης ένζυμο βακτήριο Κόψιμο DNA

Φορείς κλωνοποίησης πλασμίδια (ενσωματώνουν έως 20kb ξένου DNA) Φορείς κλωνοποίησης πλασμίδια (ενσωματώνουν έως 20kb ξένου DNA) DNA φάγων(ενσωματώνουν έως 25kb ξένου DNA) Ποια είναι τα χαρακτηριστικά που πρέπει να έχει ένα πλασμίδιο για να είναι ικανός φορέας κλωνοποίησης; (Να μπορεί να αντιγράφεται αυτόνομα μέσα στο κύτταρο ξενιστή) Να διαθέτει γονίδιο (ή γονίδια) ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Να περιέχει την ακολουθία που αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση, που θα χρησιμοποιηθεί μια μόνο φορά animation

στάδια κατασκευής μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης

2. Κόψιμο με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση 1. απομόνωση DNA E coli Γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό πλασμίδιο Θέση που κόβει η περιοριστική ενδονουκλεάση 2. Κόψιμο με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση Μονόκλωνα άκρα 3. Ανάμιξη των μορίων DNA ανασυνδυασμένο DNA 4. H DNA δεσμάση ενώνει τα διαφορετικά κομμάτια

animation 5. Το ανασυδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται σε βακτήριο ξενιστή ανασυνδυασμένο DNA 5. Το ανασυδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται σε βακτήριο ξενιστή 6. Τα βακτήρια καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει κατάλληλο αντιβιοτικό Βακτήρια που έχουν προσλάβει πλασμίδιο (λευκά) 7. Επιλέγονται τα βακτήρια που έχουν προσλάβει (ανασυνδυασμένο ή μη) πλασμίδιο. animation

Στάδια κατασκευής μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Στάδια κατασκευής μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Απομόνωση DNA ευκαρυωτικού οργανισμού και πλασμιδίων Κόψιμο τόσο του του γονιδιώματος του ευκαρυωτικού οργανισμού, όσο και του πλασμιδίου με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση Ανάμειξη των δύο DNA (αυτού του ευκαρυωτικού οργανισμού με τα πλασμίδια). Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων με τη βοήθεια του ενζύμου DNA δεσμάση. μεταφορά των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων σε βακτήρια-ξενιστές (μετασχηματισμός). καλλιέργεια των βακτηρίων σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αντιβιοτικό. Προσδιορίζονται τα βακτήρια που έχουν δεχθεί πλασμίδιο . Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA οργανισμού-δότη και αποτελεί τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη.

Μια επισήμανση Η EcoRI κόβει όποτε βρεί την ακολουθία: Μια επισήμανση Η EcoRI κόβει όποτε βρεί την ακολουθία: ……5΄ G A A T T C 3΄…… ……3΄ C T T A A G 5΄ …… Σε κάθε κόψιμο σπάει δυο φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και 8 δεσμούς υδρογόνου …5΄G-OH …3΄C T T A A- P P- A A T T C 3΄… G 5΄… HO- Κολλώδη άκρα

Μια άλλη επισήμανση

+ + πλασμίδια ξένο DNA Κόψιμο με την ίδια ενδονουκλεάση Κόψιμο με την ίδια ενδονουκλεάση + Προσθήκη δεσμάσης ανασυνδυασμένα μη ανασυνδυασμένα Μερικά πλασμίδια «κλείνουν» χωρίς να πάρουν ξένο DNA

…........…… ……….. ; Τα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια Τα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια …........…… Μετασχηματισμένα με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Μετασχηματισμένα με μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ; ……….. Μη μετασχηματισμένα (τα περισσότερα)