Από το εργαστήριο στην κλινική πράξη ΕΞΕΤΑΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Από το εργαστήριο στην κλινική πράξη Dr. ΣΚΕΠΑΣΤΙΑΝΟΣ ΠΕΤΡΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Καθηγητής Μικροβιολογίας Α.Τ.Ε.Ι.Θ.

Φυσιολογικό σπερματοζωάριο σχηματικά . . . . . . . . Χρόνος μετατροπής Σπερματογένεση Σπερμογονία 27 ημέρες Μίτωση Σπερματοκύτταρα Α’ τάξεως 23 ημέρες Μείωση Σπερματοκύτταρα Β’ τάξεως 1 ημέρα Μίτωση Σπερματίδες . . . . . . . . 23 ημέρες Διαφοροποίηση Σπερματοζωάρια Σύνολο ≈74 ημέρες

Το φυσιολογικό σπέρμα μετά την εκσπερμάτιση αποτελεί εναιώρημα σπερματοζωαρίων σε σπερματικό πλάσμα Είναι πυκνόρευστο, άχρωμο προς λευκάζων

Σπερματικό πλάσμα είναι μείγμα εκκρίσεων πολλών αδένων Α. Επιδιδυμίδας Β. Προστάτη Γ. Σπερματοδόχων κύστεων Δ. Αδένων Cooper Ε. Ουρηθρικών αδένων

Τέσσερεις φάσεις εκσπερμάτισης Α. Πρόδρομη αποβολή μίας ή δύο διαυγών σταγόνων από τους βαλανοουρηθρικούς αδένες Β. Πρώτο τμήμα εκσπερμάτισης (προστατική έκκριση με σπερματοζωάρια) Γ. Κυρίως σπέρμα που περιέχει σπερματοζωάρια Δ. Τελευταίο τμήμα. Περιέχει έκκριμα σπερματοδόχων κύστεων

Ποιοτικά χαρακτηριστικά σπέρματος Ολικός αριθμός σπερματοζωαρίων Ολικός όγκος σπέρματος

Εξετάσεις που περιλαμβάνονται στον έλεγχο του σπέρματος Μακροσκοπική εξέταση σπέρματος Μικροσκοπική εξέταση σπέρματος Μικροβιολογικός έλεγχος σπέρματος – προστατικού υγρού Βιοχημικός έλεγχος σπέρματος Ανοσολογικός έλεγχος σπέρματος Xρωμοσωματικός έλεγχος

Πρώτα 5 λεπτά μετά την εκσπερμάτιση Τοποθέτηση δοχείου συλλογής σε θερμοκρασία >200 C ή σε κλίβανο στους 37ο C.

Μεταξύ 30-60 λεπτών από την εκσπερμάτιση Αξιολόγηση ρευστοποίησης – εμφάνιση σπέρματος Μέτρηση όγκου Μέτρηση pH Παρασκευή δείγματος για μικροσκόπηση Έλεγχος κινητικότητας Μέτρηση αριθμού σπερματοζωαρίων Αξιολόγηση βιωσιμότητας Πλακάκια για αξιολόγηση μορφολογίας Αραιώσεις για αξιολόγηση –συγκέντρωση σπέρματος Αξιολόγηση αριθμού σπερματοζωαρίων Αποστολή τμήματος για καλλιέργειες Εφαρμογή του Mixed Antiglobulin Reaction (MAR test) Φυγοκέντριση για έλεγχο βιοχημικών παραμέτρων

Μετά 4 ώρες από την εκσπερμάτιση Μονιμοποίηση, χρώση, αξιολόγηση σε πλακάκια της μορφολογίας σπερματοζωαρίων Διενέργεια μοριακών εξετάσεων Μελέτη δεικτών βοηθητικών αδένων

Αποχή 2 - 7 ΗΜΕΡΕΣ ΠΡΟΤΑΣΗ W. H. O

Το δείγμα πρέπει να θεωρείται μολυσματικό Ιός έρπητα Ηπατίτιδα Β HIV Μεταδίδονται με το σπέρμα

Ρευστοποίηση 15-60΄ μετά την εκσπερμάτιση Χρόνος ρευστοποίησης Ρευστοποίηση 15-60΄ μετά την εκσπερμάτιση

Επιβραδυνόμενη ρευστοποίηση πάνω από 60΄

Αντιμετώπιση επιβραδυνόμενης ρευστοποίησης Αραίωση Μηχανική ανάδευση Ενζυμική διάσπαση

Συμβατός με δυσλειτουργία προστάτου όσον αφορά έκκριση ρευστοποιητικών ενζύμων Χρόνος ρευστοποίησης > 60΄

Γλοιότητα Αυξημένη γλοιότητα: είναι πρόβλημα στην κινητικότητα και την γονιμοποίηση (δεν αποσπώνται τα σπερματοζωάρια από την βλέννη). Τεχνικά παραμένουν στο ίδιο σημείο Ελαττωμένη γλοιότητα: σημαίνει προστατική ανεπάρκεια. Σε αζωοσπερμικούς άμεση ρευστοποίηση

Φυσιολογικά ΟΠΑΛΙΟΧΡΟΥΣ Χροιά σπέρματος Φυσιολογικά ΟΠΑΛΙΟΧΡΟΥΣ Ερυθρόχρους Κίτρινη Ύπαρξη ερυθρών αιμοσφαιρίων Ύπαρξη πυοσφαιρίων Λήψη βιταμινών τύπου Β2 Λήψη φαρμάκων Ασθενής με ίκτερο

ΟΓΚΟΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Οφείλεται κυρίως σε εκκρίσεις από: Σπερματοδόχους κύστεως Προστάτου Βολβοουρηθρικών αδένων επιδιδυμίδων

Κατώτερο φυσιολογικό 1.5ml Όγκος σπέρματος Φυσιολογικά 2 – 6 ml Άνω των 50 ετών Κατώτερο φυσιολογικό 1.5ml

Μικρός όγκος: Μεγάλος όγκος 7-8ml: Πρόβλημα σαν αριθμός Τεχνικό πρόβλημα στη συλλογή Ύπαρξη φλεγμονής προστάτου, σπερματοδόχων κύστεων Απλασία σπερματοδόχων κύστεων Απόφραξη εκσπερματικών πόρων Παλίνδρομος εκσπερμάτιση Υπογοναδισμός Μεγάλος όγκος 7-8ml: Πρόβλημα αραίωσης Πρόβλημα στον προστάτη πρόβλημα στους επικουρικούς αδένες ΑΖΩΟΣΠΕΡΜΑΤΙΚΑ ΑΤΟΜΑ Μακροχρόνια αποχή

Φυσιολογικό ελαφρά αλκαλικό (7,2 – 7,7) pH ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Φυσιολογικό ελαφρά αλκαλικό (7,2 – 7,7) pH < 7 σημαίνει: pH > 8 σημαίνει: Απόφραξη εκφορητικών οδών Ανάμειξη με ούρα Μεγάλος αριθμός σπερματοζωαρίων Οξεία φλεγμονή επικουρικών αδένων

Αρχική Μικροσκόπηση Υγρό παρασκεύασμα, παρατηρούμε σχηματισμό βλεννωδών λωρίδων Ύπαρξη συγκολλήσεων σπερματοζωαρίων Παρουσία άλλων κυττάρων Επιθηλιακά κύτταρα Λευκά αιμοσφαίρια Κεφαλές ή ουρές σπερματοζωαρίων

Πρόσφυση σπερματοζωαρίων

Συγκολλήσεις σπερματοζωαρίων Κινητά σπερματοζωάρια που κολλάνε μεταξύ τους κεφαλή με κεφαλή, ουρά με ουρά ή ανάκατα

Διαβάθμιση συγκολλήσεων Βαθμός 1 μεμονωμένη < 10 σπερματοζωάρια ανά συγκόλληση, αρκετά ελεύθερα Βαθμός 2 μερική 10-15 σπερματοζωάρια ανά συγκόλληση Βαθμός 3 Μεγάλη συγκόλληση >50 σπερματοζωαρίων, ορισμένα ακόμη ελεύθερα Βαθμός 4 γιγάντια, όλα συγκολλημένα μεταξύ τους και συγκολλημένες μάζες μεταξύ τους

Α. κεφαλή με κεφαλή Β. ουρά με ουρά Γ. άκρες με ουρά Δ. μικτή μεμονωμένη μερική μεγάλη γιγαντιαία Α. κεφαλή με κεφαλή Β. ουρά με ουρά Γ. άκρες με ουρά Δ. μικτή Ε. μπερδεμένη

Η παρουσία συγκολλήσεων επηρεάζει την παρακολούθηση της κινητικότητας και τον καθορισμό συγκέντρωσης των σπερματοζωαρίων

ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑ Εξετάζεται μετά την ρευστοποίηση: 30 λεπτά μετά την εκσπερμάτιση 1 ώρα μετά την εκσπερμάτιση 2 ώρες μετά την εκσπερμάτιση Επανεξέταση: 4 ώρες μετά την εκσπερμάτιση

Από τα πιο σημαντικά στοιχεία και δύσκολα στην εκτίμηση Κινητικότητα Από τα πιο σημαντικά στοιχεία και δύσκολα στην εκτίμηση Αναλυτές: Βιντεομικρογραφία Μικροφωτογραφία πολλαπλής έκθεσης Ακτίνες Laser Απλές τεχνικές: Εξέταση σε κοινή αντικειμενοφόρο πλάκα Εξέταση σε πλάκα NEW BAUER Εξέταση σε πλάκα MAKLER

Κάθετη διατομή της πλάκας MAKLER

Εκτίμηση κινητικότητας Ποιότητα κίνησης Ποσοστό κινουμένων σπερματοζωαρίων Ρυθμός έκπτωσης κινητικότητας

Εκτίμηση ποιότητας κίνησης προωθητική κίνηση (PR): Σπερματοζωάρια ενεργά κινητά σε ευθεία ή σε μεγάλους κύκλους, ανεξαρτήτως ταχύτητας Μη προωθητική κίνηση (NP): Όλες οι άλλες μορφές κίνησης με απουσία προώθησης, μικροί κυκλοι, σπάνια μετατόπιση κεφαλής, μόνο κίνηση ουράς Ακίνητα (ΙΜ): Καμία κίνηση

αναφοράς κινητικότητας Χαμηλότερες τιμές αναφοράς κινητικότητας Ολική κινητικότητα (προωθητική + Μη προωθητική) 40% Προωθητική κίνηση 32% Ρυθμός έκπτωσης κινητικότητας όχι >20% στις 4 ώρες μετά την εκσπερμάτιση

Ζωτικότητα σπερματοζωαρίων (βιοσιμότητα) Ελέγχεται μια ώρα μετά την εκσπερμάτιση. Καθορίζεται από την συνοχή της κυτταρικής μεμβράνης

Μέθοδοι προσδιορισμού βιοσιμότητας Χρώση ηωσίνης νιγροσίνης Υποτονικό φούσκωμα (swelling)

Προσδιορισμός βιωσιμότητας ΧΡΩΣΗ ΗΩΣΙΝΗΣ – ΝΙΓΡΟΣΙΝΗΣ ΖΩΝΤΑΝΑ ΦΑΙΝΟΝΤΑΙ ΛΕΥΚΑ ΝΕΚΡΑ ΦΑΙΝΟΝΤΑΙ ΚΟΚΚΙΝΑ

Χαμηλότερη τιμή αναφοράς για ζωτικότητα με το test ηωσίνης-νιγροσίνη το 58%

Υποωσμοτικό (υποτονικό) swelling όταν τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν για ICSI και δεν πρέπει να βαφούν.

Χαμηλότερη τιμή αναφοράς για βιωσιμότητα με μέθοδο υποτονικό swelling 58%

Ότι ακίνητο δεν νεκρό Φυσιολογικά ακίνητα ζωντανά 10-20% Ότι ακίνητο δεν νεκρό Φυσιολογικά ακίνητα ζωντανά 10-20% Αν. περισσότερα: α) ανωμαλία ουράς εγγενής ή λόγω επίδρασης μικροβιακού παράγοντα β) αναστολή κινητικότητας λόγω αντισπερματικών αντισωμάτων

Αριθμός σπερματοζωαρίων Αδρός προσδιορισμός Μέτρηση με εξελιγμένη πλάκα NEW BAUER Μέτρηση με πλάκα MAKLER

Χαμηλότερη τιμή αναφοράς για συγκέντρωση σπερματοζωαρίων 15x106/ml

ΟΛΙΚΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΝΡΙΩΝ ΑΝΑ ΕΚΣΠΕΡΜΑΤΙΣΗ Συγκέντρωση σπερματοζωαρίων /ml X όγκος εκσπερμάτισης Χαμηλότερη τιμή αναφοράς ολικού αριθμού σπερματοζωαρίων ανά εκσπερμάτιση 39x106/ml

Χαμηλοί αριθμοί σπερματοζωαρίων συνιστούν ύπαρξη κρυπτοζωοσπερμίας Υποψιαζόμενη αζωοσπερμία Αζωοσπερμία Παντελής έλλειψη σπερματοζωαρίων στο ίζημα φυγοκεντρημένου δείγματος

Προσδιορισμός κυτταρικών στοιχείων Ανώριμα κύτταρα σπερματικής σειράς, π.χ. σπερματίδες Λευκά αιμοσφαίρια

Προσδιορισμός κυτταρικών στοιχείων Κεχρωσμένα παρασκευάσματα Ποσοτικός προσδιορισμός βάση τύπου N x S C = 100 C= Κυτταρικό στοιχείο εκατομμύρια/ml N= Αριθμός κυττ. στοιχείων που βρέθηκαν σε οπτικά πεδία που αντιστοιχούν σε 100 σπερματοζωάρια S= Σπερματοζωάρια σε εκατομμύρια/ml

Μορφολογία σπερματοζωαρίων Από τις πλέον σημαντικές παραμέτρους εξέτασης σπέρματος Μελετάται η μορφολογία ολόκληρου του σπερματοζωαρίου, δηλαδή κεφαλής, αυχένα, ουράς

Χρώση κατά Παπανικολάου Χρώση κατά Shor Χρώση κατά Diff Quik

Κυτταροπλασματικό υπόλλειμα Κεφαλή Περιοχή ακροσωματίου απαλό μπλε Περιοχή μετά το ακροσωμάτιο σκούρο μπλε Αυχένας Κόκκινος Ουρά Μπλε ή κοκκινωπή Κυτταροπλασματικό υπόλλειμα Ροζ ή κόκκινο (κατά Παπανικολάου) Κοκκινοπορτοκαλί (Shor)

Φυσιολογικό σπερματοζωάριο σχηματικά

Ανώμαλη σπερματογένεση και ορισμένες παθολογίες της επιδιδυμίδας συνήθως σχετίζονται με αυξημένο ποσοστό ανώμαλων σπερματοζωαρίων

Ανώμαλα σπερματοζωάρια έχουν χαμηλό δυναμικό γονιμοποίησης. Μπορεί να έχουν ανώμαλο DNA

Μορφολογικές ανωμαλίες σπερματοζωαρίων σχετίζονται με: Α) αυξημένη πιθανότητα ύπαρξης τεμαχισμένου DNA Β) Αυξημένη πιθανότητα δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών Γ) Ανώριμη χρωματίνη Δ) Ανευπλοϊδία

Επιμηκυσμένη κεφαλή παρατηρείται σε κιρσοκήλη. Απιοειδής κεφαλή σχετίζεται με υπογονιμότητα. Ανωμαλίες αυχένα παρατηρούνται σε κιρσοκήλη. Ανωμαλίες ουράς σχετίζονται με την πυκνότητα του ελεύθερου ψευδαργύρου στο σπερματικό υγρό.

Ενδείξεις για βιοχημικό έλεγχο σπερματικού πλάσματος Α) Κλινική συμπτωματολογία φλεγμονής ή πολλά πυοσφαίρια στο δείγμα Β) Ταχεία έκπτωση κινητικότητας Γ) Αζωοσπερμία Δ) Ανεξήγητη υπογονιμότητα

Βιοχημικός έλεγχος σπερματοδόχων κύστεων Άμεση ρευστοποίηση Χαμηλό pH Μικρός όγκος Ενδείξεις μείωσης εκκριτ. ικανότητας σπερματοδόχων κύστεων Δείκτες Φρουκτόζη Προσταγλανδίνες

Φρουκτόζη σε αζωοσπερμία Φρουκτόζη φυσιολογική απόφραξη εκσπερματικού πόρου Φρουκτόζη χαμηλή συγγενής αγενεσία σπερματικών πόρων και σπερματοδόχων κύστεων

Βιοχημικός έλεγχος προστάτου Παράταση ρευστοποίησης Υψηλό pH Ενδείξεις μείωμένης εκκριτικής λειτουργίας προστάτου Όξινος φωσφατάση Κιτρικό οξύ Μαγνήσιο Ψευδάργυρος Δείκτες εκκριτικής λειτουργίας προστάτου

Βιοχημικός έλεγχος επιδιδυμίδων Πτώση κινητικότητας, μικρός αριθμός Ενδείξεις μείωμένης εκκριτικής λειτουργίας επιδιδυμίδων Ελεύθερη L-καρνιτίνη Γλυκερυλφωσφορυλχολίνη Ουδέτερη α-γλυκοσιδάση Δείκτες

Βιοχημικός έλεγχος σπερματοζωαρίων Προσδιορισμό Α.Τ.Ρ. σπερματοζωαρίων Προσδιορισμό Ακροσίνης

Μικροβιολογικός έλεγχος Καλλιέργεια σπέρματος αερόβιος Καλλιέργεια προστατικού υγρού Καλλιέργεια για μυκόπλασμα Καλλιέργεια για ουρεόπλασμα Καλλιέργεια για B.Koch Εξέταση για χλαμύδια

Καλλιέργεια προστατικού υγρού Αξιολόγηση των καλλιεργειών των κλασματικών δειγμάτων κατά Meares και Stamey

Είδη και εκατοστιαία αναλογία παθογόνων και δυνητικά παθογόνων μικροβίων στις βακτηριακές προστατίτιδες

Αντιγονικός έλεγχος Ενδείξεις αντιγονικού ελέγχου Αντιγονικός έλεγχος Ενδείξεις αντιγονικού ελέγχου Συγκολλήσεις σπερματοζωαρίων Μεγάλη διαφορά στα ποσοστά ζωντανών των κινητών σπερματοζωαρίων >20% Ανεξήγητη υπογονιμότητα

Η παραγωγή αντισωμάτων προκαλείται όταν τα σπερματοζωάρια αυτούσια ή αντιγονικά τους στοιχεία περάσουν από τον αυλό στο διάμεσο ιστό των επιδιδυμίδων

Αντισώματα κατά σπερματοζωαρίων σε άντρες με Διατομή σπερματικών πόρων Λοιμώξεις επικουρικών αδένων Ασθενείς με τραύματα όρχεων Κρυψορχία Ανασπώμενους όρχεις Ιστορικό ορχίτιδας

Αναζήτηση αντισπερματικών αντισωμάτων Α. Στον ορό αίματος Β. Σπερματικό πλάσμα Γ. Σπερματοζωάρια

Μέθοδοι ανίχνευσης αντισωμάτων στα σπερματοζωάρια Direct tests MAR test (Mixed Antiglobulin Reaction) IB test (Immunobead test)

MAR test σε φρέσκο δείγμα σπέρματος ΙΒ τεστ χρησιμοποιεί εκπλυθέντα σπερματοζωάρια

ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΕΙΣ ΜΕ ΚΙΝΟΥΜΕΝΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΑ MAR test Σπερματοζωάρια + ερυθρά προβάτου ή σωμ. Lattex με ανθρώπειο IgG + ανθρ. αντιορό αντί - IgG ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΕΙΣ ΜΕ ΚΙΝΟΥΜΕΝΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΑ

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΥΓΡΑ ΕΛΕΥΘΕΡΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ π.χ. Α. Σπερματικό πλάσμα Β. Ορός αίματος Γ. Διαλελυμμένη τραχηλική βλέννη Επωάζεται το δείγμα σε σπερματοζωάρια control χωρίς αντισώματα. Αν συγκολληθούν σε αυτά αντισώματα ελέγχονται με direct test

Δοκιμασία διείσδυσης σπερματοζωαρίων στην τραχηλική βλέννη Ανάμιξη προσφάτου σπέρματος + οιστρο-γονοποιμένης προωρρηκτικής τραχηλικής βλέννης Παρατηρώ μετά 30΄ Αρνητικό :0-25% σπερματοζωάρια με τρομώδη κίν. Ασθ. θετικό :26 – 50% Θετικό: :51-75% Έντονα θετικό:76-100%

Μέθοδοι προετοιμασίας σπέρματος Α. Απλή έκπλυση Β. Direct swim up Γ. Διαχωρισμός με φυγοκέντρηση και στοιβαδοποίηση διαφορετικής πυκνότητας

ΕΥΘΡΑΣΤΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ Υ ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΣ

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ