ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΙΣ/ΠΡΟΙΟΝ/0609/17 Ανάπτυξη ανοσο- φωτοευαισθητοποιήσιμου προιόντος για στοχευμένη καταστροφή νεοαγγείωσης ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΙΣ/ΠΡΟΙΟΝ/0609/17

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ανοσο-φωτοδυναμική θεραπεία του καρκίνου αφορά τη συνδυασμένη δράση μιας ειδικής αντικαρκινικής ανοσοσφαιρίνης (αντισώματος) και μιας φωτοευαίσθητης ουσίας. Το μεν αντίσωμα έχει την ιδιότητα να κατακρατείται επιλεκτικά από τους πάσχοντες ιστούς, η δε φωτοευαίσθητη ουσία, όταν ενεργοποιηθεί, σημαίνει την έναρξη μιας σειράς φωτοχημικών αντιδράσεων, τα προϊόντα των οποίων προκαλούν σημαντικές βλάβες σε συστατικά, λειτουργίες, οργανίδια και μεμβράνες των μη υγιών κυττάρων, οδηγώντας τα τελικά σε νέκρωση.

ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Η βιβλιοθήκη του φάγου που χρησιμοποιήθηκε, περιείχε 10,000,000 διαφορετικά αντισώματα scFv σε φάγους- φορείς. Η βιβλιοθήκη συσχετίστηκε με την πρωτεΐνη στόχο που βρισκόταν ακινητοποιημένη στην επιφάνεια ενός τρυβλίου, την πρωτεΐνη EDB. Οι φάγοι που δεν δεσμεύτηκαν με την πρωτεΐνη EDB, άρα δεν περιείχαν το γονίδιο για το αντίστοιχο αντίσωμα, απομακρύνθηκαν δια πλύσεως ενώ από αυτούς που παρέμειναν δεσμευμένοι αναγνωρίστηκε η ακολουθία του πεπτιδίου και η αλληλουχία του γονιδίου που επέδρασε με την πρωτεΐνη-στόχο. Με αυτό τον τρόπο έγινε η επιλογή των αντισωμάτων που δεσμεύουν την πρωτεΐνη.

Όσον αφορά την επιλογή αντισωμάτων, η σειρά των αμινοξέων των κυριοτέρων αντισωμάτων είναι-

ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΤΕΣ Η φωτοδυναμική θεραπεία βασίζεται στην παραγωγή ελευθέρων ριζών. Η καλύτερη δυνατή σύζευξη με φωτοευαισθητοποιητές είναι αυτή που δεν επηρεάζει καθόλου την ελευθέρωση ριζών. Η αντίδραση σύζευξης με τα καλύτερα αποτελέσματα ήταν η ακόλουθη

Μελέτη σε πηγαδάκια ELISA Για τη διεξαγωγή αυτής της ΔΕ, το αντιγόνο EDB ήταν συνδεδεμένο σε πηγαδάκια μικροπλάκας πολυστερίνης κάτω από συνθήκες που το συγκρατούσαν στην φυσική του κατάσταση. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα αντισωμάτων προστήθενταν στα πηγαδάκια, επιτρέποντας τα αντι- EDB αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονταν και προστήθενταν αντι- ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επέτρεπε την σύνδεση του αντι-ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος – ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλούσε χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντι-EDB αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρινόταν με την οπτική πυκνότητα των προτύπων αναφοράς.

Μελέτη σε κύτταρικές γραμμές

Ανοσοϊστολογικές μελέτες σε βιοψίες ασθενών Η ανοσοϊστοχημική εξέταση των βιοψιών ασθενών για το αντιγόνο EDB, θεωρείται από μελέτες ως σημαντικός προγνωστικός παράγοντας, αφού η ύπαρξη του αντιγόνου έχει βρεθεί να σχετίζεται με την εξέλιξη νεοαγγείωσης. Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) είναι μια διαγνωστική διεργασία πολλαπλών βημάτων, η οποία αποτελείται από ειδικευμένη επιλογή του κατάλληλου αντιγόνου, επιλογή ιστού, μονιμοποίηση και επεξεργασία, παρασκευή της πλάκας IHC και ερμηνεία των αποτελεσμάτων της χρώσης. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν τα αντισώματα επιλέχθηκαν στη σε ιστούς που εκφράζουν την πρωτεΐνη EDB.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα του ασθενούς έδειχναν λιγότερη ένταση φθορισμού ή παρόμοια ένταση φθορισμού με το κυτταρικό υπόστρωμα ή σε άλλες περιπτώσεις έδειχναν διάσπαρτο φθορισμό ίδιας έντασης ή καθόλου φθορισμό . Επιπλέον, πρέπει να τονίσουμε την παρουσία σε αρκετά δείγματα αντικυτταροπλασματικού φθορισμού, που οφείλεται σε διάφορα κυτταροπλασματικά αντιγόνα, όπως μιτοχονδριακά ένζυμα, ριβοσωμικές πρωτεΐνες, λυσόσωμα, σύμπλεγμα Golgi και t-RNA συνθετάσες.

ΣΥΖΕΥΞΗ Τα κύρια χαρακτηριστικά του συζευγμένου ανοσο- φωτοευαισθητοποιητή που παρασκευάστηκε συνοψίζονται ως εξής : 1. Οι προσδένουσες ομάδες πρέπει να εξασφαλίζουν την σύζευξη μεταξύ της μη διηγερμένης καταστάσεως της χρωστικής και του αντισώματος 2. Ο οξειδωμένος φωτοευαισθητοποιητής πρέπει να είναι αρκετά σταθερός για να μην αποσυνδέεται από το αντίσωμα 3. Ο φωτοεαισθητοποιητής δεν πρέπει να εμποδίζει το αντίσωμα από το να προσδένεται στο σχετικό αντιγόνο

Το ιδανικό πρωτόκολλο σύζευξης αντισώματος-φωτοευαισθητοποιητή που δεν επηρεάζει τις λειτουργίες του ανοσο-φωτοευαισθητοποιητή είναι –

Τοξική δράση των φωτοευαισθητοποιητών Εκτός από την αναμενόμενη δράση, ορισμένα από τα φωτοευαισθητοποιήσιμα μόρια που μελετήθηκαν, εμφάνισαν τοξική δράση εναντίον των κυττάρων, είχαν δηλαδή την ικανότητα να προκαλούν βλάβη στο κυτταρικό DNA απουσία του υπεροξειδίου του υδρογόνου.

Χορήγηση ανοσο-φωτοδυναμικής θεραπείας in vivo Οι στόχοι μας σε αυτή την σειρά πειραμάτων ήταν οι ακόλουθοι – 1. Να χορηγηθούν οι ανοσο-φωτοευαίσθητες ουσίες συζευγμένες με τα αντισώματα σε ξενο-μεταμοσχευμένα ποντίκια. 2. Να επιτραπεί στους ανοσο-ευαισθητοποιητές να συγκεντρωθούν στους όγκους των ζώων και να δοκιμαστούν θεραπευτικές δόσεις ακτινοβολίας των όγκων με φώς που θα διεγείρει επιλεκτικά το φωτοευαισθητοποιητή. Στόχος ήταν να προκληθεί ικανοποιητική νέκρωση των όγκων με τις ελάχιστες δυνατές βλάβες στους παρακείμενους ιστούς. 3. Να γίνουν μετρήσεις σχετικά με την επιλεκτικότητα του συστήματος και με το μέγεθος των όγκων.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι ομάδες που θεραπεύτηκαν με 75 mW/cm2 και συνολικές δόσεις ενέργειας 100 και 150J/cm2 παρουσίασαν αύξηση όγκου μη θεραπευμένων καρκινωμάτων 69.2 και 10.3% αντίστοιχα. Και αυτή η διαφορά είναι στατιστικά σήμαντικη (p=0.001, Student’s t test). Τα καρκινώματα των ομάδων που θεραπεύτηκαν με 50 mW/cm2 παρουσίασαν αύξηση στον όγκο κατά 20.2 και 6.3% για δόσεις ενέργειας 100 και 150 J/cm2. Η διαφορά στην αύξηση του όγκου μεταξύ αυτών των δύο ομάδων είναι στατιστικά σημαντική με p=0.005 (Student’s t test).

Μερικά από αυτά τα ζώα παρουσίασαν και κάποια όχι σοβαρά εγκαύματα στην ακτινοβολημένη περιοχή 2-3 ημέρες μετά τη θεραπεία. Τα εγκαύματα αυτά όμως επουλώθηκαν 7-10 ημέρες αργότερα χωρίς κάποια επιπλέον φροντίδα ή θεραπεία. Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται ότι ο καλύτερος συνδυασμός θεραπευτικών παραμέτρων είναι διάρκεια επάλειψης 1 h, ακτινοβόληση 75 mW/cm2 και συνολική δόση ενέργειας 150 J/cm2.

ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ Μελετήσαμε μακροσκοπικά τα τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, δηλαδή τη συμπύκνωση της χρωματίνης σε λεπτοκοκκιώδεις μάζες ομογενούς υφής, που συγκεντρώνονται στην εσωτερική επιφάνεια της πυρηνικής μεμβράνης, και τη συμπύκνωση του κυτταροπλάσματος με συγκέντρωση των οργανιδίων και κυτταροπλασματικές προεκβολές. Τα κύτταρα φάνηκαν να διασπώνται και να σχηματίζονται τα αποπτωτικά σωμάτια, τα οποία εκφυλίζονταν τελικά με νέκρωση, σε διάστημα 12–15 ωρών.

Τελικό πρωτόκολλο ανοσο-φωτοδυναμικής θεραπείας σε ζώα Τελικό πρωτόκολλο ανοσο-φωτοδυναμικής θεραπείας σε ζώα 1. Πρωτοπαθείς όγκοι παράγονται μετά από 15 εβδομαδιαίες ενέσεις ενώ οι λήπτες αναπτύξουν οζίδια μεγέθους τουλάχιστον 5 x 5 mm. 2. Η δοσιμετρία του φωτοευαισθητοποιητή αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της Laser δοσιμετρίας στην φωτοδυναμική θεραπεία καθώς, εάν η κατανομή του χορηγούμενου φωτοευαισθητοποιητή σε διάφορους ιστούς (ακόμα και αν αποτελούν ιστούς στόχους) διαφέρει για την ίδια χορηγούμενη δόση, θα διαφέρει και το βιολογικό αποτέλεσμα για την ίδια δόση φωτός. Πρακτικά, η δοσιμετρία του φωτοευαισθητοποιητή θα γίνεται με μη επεμβατικές μεθόδους όπως μέτρηση του φάσματος φθορισμού του φωτοευαισθητοποιητή ή μετρήσεις ανάκλασης.

3. Κατά το πρώτο στάδιο γίνεται δεκάλεπτη ενδοφλέβια έγχυση του αντισώματος σεδόση 6 m g / m 2 επιφανείας σώματος διαλυμένου σε 3 0 m l διαλύματος για έγχυση. Κατά το δεύτερο στάδιο γίνεται ενεργοποίηση του φωτοευαισθητοποιητή με φως 1 5 λεπτά μετά την έναρξη της έγχυσης. 4. Η ακτινοβολία θα καθορίζεται με βάση τους πιο κάτω παράγοντες. • Η ακτινοβολούμενη ισχύς [P(W)] - • Ο ρυθμός ροής ακτινοβολούμενης ενέργειας [ψ (Wm-2)] • Η ακτινοβολούμενη ένταση [I (Wsr-1)] • Η ακτινοβολία [L (Wsr-1m-2)] • Η ακτινοβόληση [E (Wm-2)] σημείου επιφάνειας