ΠΑΡΑΓΩΓΗ, ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Β ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Η αναπτυξιακή πορεία μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η παραγωγή των πλασματοκυττάρων και των Β κυττάρων μνήμης, διαιρείται σε τρία κύρια στάδια: 1)παραγωγή ώριμων, ανοσοδραστικών Β κυττάρων (ωρίμανση), 2)ενεργοποίηση των ώριμων Β κυττάρων όταν αλληλεπιδράσουν με ένα αντιγόνο και 3)διαφοροποίηση των ενεργοποιημένων Β κυττάρων προς πλασματοκύτταρα και Β κύτταρα μνήμης. Σε πολλά σπονδυλωτά συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου και του ποντικού, τα Β κύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών. Η διαδικασία αυτή αποτελεί φυσικό επακόλουθο των αναδιατάξεων που συμβαίνουν στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών και εξελίσσεται απουσία αντιγόνου. Η φάση αυτή αποτελεί την αντιγονο-ανεξάρτητη φάση της ανάπτυξης των Β κυττάρων.

Ένα ανώριμο Β κύτταρο, που εκφράζει μεμβρανική IgM, εγκαταλείπει το μυελό των οστών και ωριμάζει προκειμένου να εκφράσει τόσο μεμβρανική IgM, όσο και μεμβρανική IgD (mIgM, mIgD) με συγκεκριμένη αντιγονική ειδικότητα. Αυτά τα παρθένα Β κύτταρα (naive B cells), τα οποία δεν έχουν έλθει σε επαφή με κάποιο αντιγόνο, κυκλοφορούν στο αίμα και τη λέμφο και μεταφέρονται στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, με πιο σημαντικά το σπλήνα και τους λεμφαδένες

Αν ένα Β κύτταρο ενεργοποιηθεί από την αλληλεπίδραση με ένα αντιγόνο, το οποίο αναγνωρίζεται από το μεμβρανικό αντίσωμα που φέρει το Β κύτταρο, τότε το τελευταίο πολλαπλασιάζεται (κλωνική επέκταση) και διαφοροποιείται έτσι ώστε να παράγει έναν πληθυσμό πλασματοκυττάρων, τα οποία εκκρίνουν αντισώματα, και Β κυττάρων μνήμης. Λόγω αυτής της ενεργοποίησης, μερικά Β κύτταρα υφίστανται ωρίμανση συγγένειας (affinity maturation), δηλαδή μία προοδευτική αύξηση της μέσης συγγένειας των αντισωμάτων που παράγονται, καθώς η απόκριση εξελίσσεται.

Επίσης, πολλά από αυτά υφίστανται μετάπτωση τάξης (class switching), δηλαδή αλλαγή του ισοτύπου του αντισώματος που παράγεται από το Β κύτταρο, από μ σε γ, α ή ε. Από τη στιγμή που η ενεργοποίηση και η διαφοροποίηση των Β κυττάρων στην περιφέρεια, απαιτούν την παρουσία αντιγόνου, το στάδιο αυτό αποτελεί την αντιγονο-εξαρτώμενη φάση της ανάπτυξής τους. Κατά τη διάρκεια της ζωής παράγονται στο μυελό των οστών πολλά Β κύτταρα, από τα οποία, όμως, τελικά ωριμάζουν πολύ λίγα.

Ωρίμανση των Β κυττάρων Η παραγωγή ώριμων Β κυττάρων συμβαίνει αρχικά στα εμβρυϊκά στάδια και συνεχίζεται καθόλη τη διάρκεια της ζωής. Πριν τη γέννηση, οι σημαντικότερες θέσεις ωρίμανσης των Β κυττάρων εντοπίζονται στο λεκιθικό σάκο, το εμβρυϊκό ήπαρ και τον εμβρυϊκό μυελό των οστών, ενώ μετά τη γέννηση η παραγωγή ώριμων Β κυττάρων γίνεται στο μυελό των οστών.

Τα προγονικά Β κύτταρα πολλαπλασιάζονται στο μυελό των οστών στελεχιαία κύτταρα διαφοροποιούνται προς την ανοσολογικά διακριτή κυτταρική σειρά, των προγονικών Β κυττάρων (progenitor B-cells, pro-B cells) ). Ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των προγονικών Β κυττάρων προς πρόδρομα Β ή προ-Β κύτταρα (precursor B cells, pre-B cells), απαιτεί την ύπαρξη ενός μικροπεριβάλλοντος που παρέχουν τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών. Αν τα προγονικά Β κύτταρα αφαιρεθούν από το μυελό των οστών και καλλιεργηθούν in vitro, δεν καταφέρνουν να εξελιχθούν σε ωριμότερα Β κυτταρικά στάδια παρά μόνον παρουσία στρωματικών κυττάρων. Τα στρωματικά κύτταρα παίζουν δύο σημαντικούς ρόλους: αλληλεπιδρούν άμεσα με τα προγονικά Β και τα προ-Β κύτταρα και εκκρίνουν διάφορες κυτταροκίνες, με πιο σημαντική την IL-7, οι οποίες υποστηρίζουν την αναπτυξιακή διαδικασία

Η πλήρης ωρίμανση Η πλήρης ωρίμανση σηματοδοτείται από τη συνέκφραση μορίων IgD και IgM στη μεμβράνη. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει μία αλλαγή στην επεξεργασία του RNA του πρωτογενούς μεταγράφου της βαριάς αλυσίδας, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η κωδικοποίηση δύο μορίων mRNAs, από τα οποία το πρώτο κωδικοποιεί τη μεμβρανική μορφή της μ αλυσίδας και το δεύτερο τη μεμβρανική μορφή της δ αλυσίδας. Παρόλο που η IgD είναι ένας χαρακτηριστικός επιφανειακός δείκτης των ώριμων παρθένων Β κυττάρων, δεν είναι πλήρως γνωστή η λειτουργία της. Όμως, από τη στιγμή που τα ποντίκια με τεχνητή εξάλειψη (knockout) του γονιδίου για τις ανοσοσφαιρίνες δ, παρουσιάζουν φυσιολογικά επίπεδα πλήρως λειτουργικών Β κυττάρων, η IgD δεν θεωρείται απαραίτητη ούτε για την ανάπτυξη των Β κυττάρων, ούτε για την αντιγονική τους απόκριση

Ο υποδοχέας των προ-Β κυττάρων είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των Β κυττάρων Μόνο τα προ-Β κύτταρα, που εκφράζουν μεμβρανικές βαριές αλυσίδες μ σε συνδυασμό με τις επικουρικές ελαφριές αλυσίδες, είναι ικανά να συνεχίσουν την ωρίμανσή τους

Δείκτες της κυτταρικής επιφάνειας ταυτοποιούν τα αναπτυξιακά στάδια Δείκτες της κυτταρικής επιφάνειας ταυτοποιούν τα αναπτυξιακά στάδια Η αναπτυξιακή πορεία, μέσω της οποίας εξελίσσονται τα προγονικά σε ώριμα Β κύτταρα χαρακτηρίζεται από μία σειρά αλλαγών στο πρότυπο έκφρασης επιφανειακών δεικτών Στο στάδιο του προγονικού Β κυττάρου, τα κύτταρα δεν εκφράζουν στην επιφάνειά τους βαριές ή ελαφριές αλυσίδες ανοσοσφαιρινών, αλλά αντίθετα, εκφράζουν το μόριο CD45R, μία πρωτεϊνική φωσφατάση τυροσίνης που συναντάται στα λευκοκύτταρα. Τα προγονικά Β κύτταρα εκφράζουν, επίσης, στην επιφάνειά τους το μόριο CD19 (τμήμα του Β κυτταρικού συνυποδοχέα), το CD43 (λευκοσιαλίνη) και το CD24, που είναι γνωστό και ως θερμο-σταθερό αντιγόνο (Heat Stable Antigen, HSΑ).

Καθώς τα κύτταρα οδεύουν από το στάδιο του προγονικού Β κυττάρου προς το στάδιο του προ-Β κυττάρου, εκφράζουν πολλούς από τους δείκτες που εξέφραζαν και κατά τη διάρκεια του προγονικού σταδίου και αρχίζουν να εκφράζουν το μόριο CD25,. Τo σημαντικότερο χαρακτηριστικό του προ-Β σταδίου αποτελεί η εμφάνιση του προ-Β κυτταρικού υποδοχέα, (προ-BCR) (pre-B Cell Receptor). Μετά την αναδιάταξη της ελαφριάς αλυσίδας, εμφανίζονται μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες που περιέχουν τόσο τις βαριές όσο και ελαφριές αλυσίδες και τα κύτταρα, που πλέον κατατάσσονται στα ανώριμα Β, χάνουν τον προ-BCR και παύουν να εκφράζουν το μόριο CD25. Η ταυτοποίηση και η απομόνωση των διαφόρων σταδίων ανάπτυξης των Β κυττάρων, καθίστανται δυνατές με τη βοήθεια των τεχνικών της ανοσοϊστοχημείας και της κυτταρομετρίας ροής, και στηρίζονται στη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων τα οποία αναγνωρίζουν όλους αυτούς τους αντιγονικούς δείκτες.

Τα Β-1 Β κύτταρα αποτελούν έναν υποπληθυσμό Β κυττάρων που διαθέτει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης Ένας υποπληθυσμός Β κυττάρων, που είναι γνωστός ως Β-1, παράγεται πριν από την κύρια ομάδα Β κυττάρων (μερικές φορές καλούνται Β-2 κύτταρα, λόγω της μεταγενέστερης εμφάνισής τους) στον άνθρωπο και το ποντίκι. Στον άνθρωπο και το ποντίκι τα Β-1 κύτταρα αποτελούν μόλις το 5% περίπου του συνολικού αριθμού των Β κυττάρων. (Σε μερικά είδη όπως στα κουνέλια και στα βοοειδή, κύτταρα που διαθέτουν πολλά από τα χαρακτηριστικά των Β-1 Β κυττάρων, αποτελούν τον κύριο υποπληθυσμό Β κυττάρων). Τα Β-1 Β κύτταρα προέρχονται από αρχέγονα κύτταρα κατά την εμβρυϊκή ζωή και εκφράζουν επιφανειακή Ig, η οποία αποτελεί το χαρακτηριστικό δείκτη των Β κυττάρων. Παρόλα αυτά, τα περισσότερα Β-1 Β κύτταρα εμφανίζουν επιφανειακή IgM αντί IgG και διαθέτουν ελάχιστη ή και καθόλου IgD. ο πληθυσμός των Β-1 Β κυττάρων διαθέτει ικανότητα αυτο-ανανέωσης και μπορεί να παράγει παρθένα Β-1 κύτταρα

τα αντισώματα που παράγονται από τα Β-1 Β κύτταρα, γενικά, δεσμεύουν αντιγόνα με χαμηλότερη συγγένεια, σε σχέση με τα αντίστοιχα που παράγονται από τον πληθυσμό των Β-2 κυττάρων. Μελέτες του πληθυσμού των Β-1 κυττάρων έχουν δείξει ότι αυτά είναι πιθανότερο να ενεργοποιηθούν από αντιγόνα που ανήκουν στην κατηγορία των υδατανθράκων, παρά από πρωτεΐνες. Επίσης, δεν απαιτούν βοήθεια από Τ κύτταρα και παρουσιάζουν μικρή τάση διαφοροποίησης προς κύτταρα μνήμης. Η μετάπτωση τάξης δεν είναι συνηθισμένη και, όπως προαναφέρθηκε, τα περισσότερα Β-1 κύτταρα εκφράζουν IgM

Τα δραστικά έναντι του εαυτού (αυτοδραστικά) Β κύτταρα επιλέγονται αρνητικά στο μυελό των οστών Υπολογίζεται περίπου 10% στρατολογούνται τελικά στον πληθυσμό των κυκλοφορούντων Β κυττάρων. Αυτό σημαίνει ότι το 90% των Β κυττάρων που παράγονται καθημερινά πεθαίνουν, πριν καν απομακρυνθούν από το μυελό των οστών. Ένα ποσοστό αυτής της απώλειας αποδίδεται στην αρνητική επιλογή (negative selection) και την επακόλουθη κλωνική εξάλειψη (clonal deletion) των ανώριμων Β κυττάρων, που εκφράζουν αυτο-αντισώματα εναντίον εαυτών αντιγόνων, στο μυελό των οστών.

πραγματοποιείται αρνητική επιλογή των ανώριμων Β κυττάρων, που εκφράζουν αυτο-αντισώματα στις μεμβράνες τους, εξαιτίας του γεγονότος ότι αυτά τα αντισώματα αντιδρούν με εαυτά αντιγόνα που υπάρχουν στα στρωματικά κύτταρα, οδηγώντας τα ανώριμα Β κύτταρα σε θάνατο.  

Ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμός των Β κυττάρων Μετά την έξοδο των Β κυττάρων από το μυελό των οστών, λαμβάνει χώρα στην περιφέρεια ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση, ως απόκριση στην παρουσία αντιγόνου. Η ενεργοποίηση και η κλωνική επιλογή των παρθένων Β κυττάρων, που κατευθύνεται από ένα αντιγόνο, οδηγεί στην παραγωγή πλασματοκυττάρων και Β κυττάρων μνήμης. Απουσία αντιγονο-επαγόμενης ενεργοποίησης, τα παρθένα Β κύτταρα της περιφέρειας έχουν μικρή διάρκεια ζωής, πεθαίνοντας μέσα σε λίγες εβδομάδες με απόπτωση

Τα θυμο-εξαρτώμενα και τα θυμο- ανεξάρτητα αντιγόνα έχουν διαφορετικές προϋποθέσεις απόκρισης Παρατηρήσεις σε αθυμικά/γυμνά (nude) ποντίκια και σε ασθενείς που έχουν γεννηθεί χωρίς θύμο έχουν οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι ανάλογα με τη φύση του αντιγόνου, η πορεία από την ενεργοποίηση των Β κυττάρων, μέχρι την παραγωγή αντισωμάτων, εξελίσσεται μέσω δύο διαφορετικών οδών. Παρά το γεγονός ότι οι αποκρίσεις έναντι των περισσότερων αντιγόνων απαιτούν την ύπαρξη θύμου (θυμο-εξαρτώμενα αντιγόνα, Thymus Dependent, TD antigens), διάφοροι ερευνητές έχουν αναφέρει ότι μερικοί τύποι αντιγόνων επάγουν την παραγωγή αντισωμάτων ακόμα και απουσία θύμου αδένα (θυμο-ανεξάρτητα αντιγόνα, Τhymus Independent, ΙΤ antigens).

θυμο-εξαρτώμενα, θυμο-ανεξάρτητα αντιγόνα Η απόκριση των Β κυττάρων σε θυμο-εξαρτώμενα αντιγόνα, προϋποθέτει την άμεση επαφή με τα ΤΗ κύτταρα και όχι απλά την έκθεση στις κυτταροκίνες που προέρχονται από αυτά. Τα αντιγόνα που ενεργοποιούν τα Β κύτταρα χωρίς να ακολουθούν την παραπάνω οδό, δηλαδή τα θυμο-ανεξάρτητα αντιγόνα, διακρίνονται στους υποτύπους 1 και 2 και ενεργοποιούν τα Β κύτταρα μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Ως Τύπου 1 θυμο-ανεξάρτητα (ΤΙ-1) αντιγόνα, λειτουργούν μερικά συστατικά του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος, συμπεριλαμβανομένου του λιποπολυσακχαρίτη (LPS). Τα Τύπου 2 θυμο-ανεξάρτητα (ΤΙ-2) αντιγόνα είναι μόρια που εμφανίζουν υψηλά επαναλαμβανόμενα δομικά πρότυπα όπως οι πολυσακχαρίτες του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος, που εμφανίζουν επαναλαμβανόμενες πολυσακχαριδικές ομάδες.

λιποπολυσακχαρίτης (lipopolysacharide, LPS) Ο μηχανισμός διαμέσου του οποίου το ΤΙ-1 αντιγόνο, λιποπολυσακχαρίτης (lipopolysacharide, LPS), που αποτελεί κύριο συστατικό των κυτταρικών τοιχωμάτων των Gram-αρνητικών βακτηρίων, επάγει την παραγωγή αντισωμάτων, ανεξαρτήτως της ύπαρξης Τ κυττάρων, έχει κατανοηθεί επαρκώς. Ο LPS αλληλεπιδρά με δύο διαφορετικούς υποδοχείς των Β κυττάρων. Ο ένας είναι ο υποδοχέας τύπου Toll, TLR4, ο οποίος είναι ένας σημαντικός υποδοχέας του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος Ο άλλος είναι ο ΒCR.

Λίγα μόνο μέλη του Β κυτταρικού πληθυσμού διαθέτουν BCR ειδικό για τον LPS, ενώ το σύνολό τους διαθέτει TLR4. H ενεργοποίηση τόσων πολλών διαφορετικών κλώνων Β κυττάρων από τον LPS, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μιας μεγάλης ποικιλίας αντισωμάτων, κάποια από τα οποία είναι δυνατό να αλληλεπιδράσουν με τα εισβάλοντα gram-αρνητικά βακτήρια, προκαλώντας την εξουδετέρωσή τους.

ανεξαρτησία των ΤΙ-1 αντιγόνων από τα Τ κύτταρα Η ανεξαρτησία των ΤΙ-1 αντιγόνων από τα Τ κύτταρα, φαίνεται παραστατικά σε πειράματα που χρησιμοποιούν αθυμικά/γυμνά ποντίκια, τα οποία παρουσιάζουν έλλειψη θύμου αδένα και διαθέτουν πολύ λίγα Τ κύτταρα. Αν ένας πληθυσμός αθυμικών ποντικών χωριστεί σε δύο ομάδες, Α και Β, στην ομάδα Α χορηγηθούν Τ κύτταρα από φυσιολογικά ποντίκια και στη συνέχεια και οι δύο ομάδες ανοσοποιηθούν με ένα ΤΙ-1 αντιγόνο, παρατηρείται ότι τα πειραματόζωα και των δύο ομάδων παράγουν παρόμοια επίπεδα αντισωμάτων εναντίον του αντιγόνου που χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση. Το γεγονός ότι η απόκριση των αθυμικών ποντικών δεν ενισχύεται σημαντικά από τη χορήγηση Τ κυττάρων, σημαίνει ότι τα ΤΙ-1 αντιγόνα είναι πράγματι ανεξάρτητα από τα Τ κύτταρα

Η μερική εξάρτηση των αντιγόνων ΤΙ-2 από μικρούς πληθυσμούς Τ κυττάρων, Φαίνεται από πειράματα, στα πλαίσια των οποίων η χορήγηση μικρού αριθμού Τ κυττάρων σε αθυμικά ποντίκια, (παρουσιάζουν έλλειψη των Τ κυττάρων που προέρχονται από το θύμο, αλλά περιέχουν μικρούς αριθμούς Τ κυττάρων που προέρχονται από άλλα σημεία που πιθανόν εντοπίζονται στο έντερο) αποκαθιστά την ικανότητά τους να παράγουν Β κυτταρικές αποκρίσεις σε αντιγόνα ΤΙ-2.

Η μεταγωγή των διεγερτικών μηνυμάτων εμπλέκει τα ετεροδιμερή Ig-α/Ig-β η σύνδεση του υποδοχέα Ig με ένα αντιγόνο μπορεί να ενεργοποιεί ενδοκυτταρικές οδούς σηματοδότησης?? Όλοι οι ισότυποι των mIgs διαθέτουν κυτταροπλασματικές ουρές πολύ μικρού μήκους. Τόσο η mIgM όσο και η mIgD στα Β κύτταρα εκτείνονται στο κυτταρόπλασμα σε μήκος τριών μόνον αμινοξέων, η ουρά της mIgA περιλαμβάνει 14 αμινοξέα και οι ουρές των mIgG και mIgE περιλαμβάνουν 28 αμινοξέα.

Β κυτταρικός υποδοχέας (B-Cell Receptor, BCR) η κυτταροπλασματική ουρά είναι πολύ μικρή για να μπορεί να συνδέεται με ενδοκυτταρικά μόρια σηματοδότησης, όπως οι κινάσες τυροσίνης και οι G πρωτεΐνες. Τη λύση σε αυτό το μακροχρόνιο ερώτημα έδωσε η ανακάλυψη ότι η μεμβρανική Ig συνδέεται με το ετεροδιμερές Ig-α/Ig-β, το οποίο σταθεροποιείται με δισουλφιδικούς δεσμούς, σχηματίζοντας έτσι τον Β κυτταρικό υποδοχέα (B-Cell Receptor, BCR)

μόνο ένα ετεροδιμερές Ig-α/Ig-β συνδέεται με ένα μόριο mΙg για το σχηματισμό του συμπλέγματος του υποδοχέα