ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΣΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ME ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ HPLC

μη ενζυματική γλυκοσυλίωση Η γλυκοσυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA1c) είναι το ποσοστό της αιμοσφαιρίνης HbA1 που έχει υποστεί γλυκοσυλίωση. Η υπεργλυκαιμία αυξάνει το ρυθμό σύνδεσης της γλυκόζης με την αιμοσφαιρίνη μέσω μιας αντίδρασης που καλείται μη ενζυματική γλυκοσυλίωση Όταν η Αιμοσφαιρίνη και η Γλυκόζη συνδέονται σχηματίζεται ένα στρώμα σακχάρου στην Αιμοσφαιρίνη. Όσο πιο υψηλό είναι το σάκχαρο στο αίμα τόσο πιο μεγάλο είναι το στρώμα, τόσο πιο αυξημένο είναι το ποσοστό της γλυκοσυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Το μόριο της αιμοσφαιρίνης (μια συζευγμένη πρωτεΐνη ) είναι ένα τετραμερές και αποτελείται από 2α και 2β πολυπεπτιδικές αλυσίδες, που η καθεμία συνδέεται με μια ομάδα αίμης. Η ομάδα της αίμης είναι προϊόν πορφυρίνης που περιέχει δισθενή σίδηρο ( Fe 2+ ). Η αιμοσφαιρίνη ( Hb ) συναντάται σε διάφορες μορφές με βάση την αλληλουχία των αμινοξέων σε κάθε υπομονάδα της. Στον ενήλικα υπάρχουν τρία είδη αιμοσφαιρίνης: Η HbΑ1αποτελεί το 97%, η HbA2 το 2% και η HbF το 1% της αιμοσφαιρίνης σε υγιή άτομα. Στα νεογέννητα η HbF αποτελεί το 80%, αλλά σταδιακά αυτή η αναλογία ελαττώνεται και περίπου τον 8ο μήνα μετά τη γέννηση τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης φθάνουν αυτά των ενηλίκων. Η HbS αποτελεί μια μη φυσιολογική μορφή της HbA και συναντάται σε άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία-γενετική διαταραχή όπου παράγεται μη φυσιολογική αιμοσφαιρίνη HbS (παρουσία βαλίνης αντί του γλουταμινικού οξέoς). Σε καταστάσεις υποξίας προκαλείται καθίζηση της HbS στα ερυθροκύτταρα που αποκτούν δρεπανοειδές σχήμα. Τα ερυθρά δρεπανοκύτταρα παρουσιάζουν δυσκαμψία, έχουν μικρή διάρκεια ζωής, μεγαλύτερη γλοιότητα από τα φυσιολογικά κύτταρα, γεγονότα που οδηγούν σε βαριά αναιμία.

Η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA1c)

Μέση Τιμή Γλυκόζης= 28,7 × HbA1c - 46,7 Σε τυχαιοποιημένες αναλύσεις οι τιμές της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c ) δίνουν μια προσέγγιση των μέσων τιμών της γλυκόζης πλάσματος. Κάθε αύξηση της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης κατά 1% μεταφράζεται με αύξηση της μέσης συγκέντρωσης γλυκόζης κατά 35mg/dl (2,0 mmol/L). Η μέση εκτιμώμενη τιμή γλυκόζης υπολογίζεται με το μαθηματικό τύπο: Μέση Τιμή Γλυκόζης= 28,7 × HbA1c - 46,7

5 % 97 mg/dL (5.4 mmol/L) 6 % 126 mg/dL (7 mmol/L) A1C level Αverage Βlood Sugar level 5 % 97 mg/dL (5.4 mmol/L) 6 % 126 mg/dL (7 mmol/L) 7 % 154 mg/dL (8.5mmol/L) 8 % 183 mg/dL (10.2 mmol/L) 9 % 212 mg/dL (11.8 mmol/L) 10 % 240 mg/dL (13.3 mmol/L) 11 % 269 mg/dL (14.9 mmol/L) 12 % 298 mg/dL (16.5 mmol/L) 13 % 326 mg/dL (18.1 mmol/L) 14 % 355 mg/dL (19.7 mmol/L)

Το 2009 η Α1c εγκρίθηκε για τη διάγνωση του διαβήτη από μια διεθνή επιτροπή εμπειρογνωμόνων (Diabetes Care 2009) και από τις αρχές του 2010 συμπεριλήφθηκε από την Αμερικάνικη Διαβητολογική Εταιρεία( (ADA) στα διαγνωστικά κριτήρια του σακχαρώδη διαβήτη για τιμές ≥6,5%.

ΓΙΑΤΙ ΓΙΝΕΤΑΙ Η ΕΞΕΤΑΣΗ Οι Αμερικάνικες, Ευρωπαικές και Διεθνείς Εταιρείες Διαβήτη συνιστούν: η εξέταση A1C είναι η βασική εξέταση για την διάγνωση του Προ- διαβήτη και του Διαβήτη τύπου 1 και τύπου 2. Η συγκέντρωση της στο αίμα αποτελεί δείκτη της μέσης συγκέντρωσης της γλυκόζης στο αίμα για τις τελευταίες, προ της αιμοληψίας, 4-8 εβδομάδες και αποτελεί δείκτη ελέγχου της πορείας της αντιδιαβητικής θεραπείας και συγχρόνως επιτρέπει την λήψη έγκαιρων αποφάσεων για την αλλαγή θεραπείας όταν απαιτείται. Η HbA1c παρέχει μια πολύ καλύτερη ένδειξη του μακροπρόθεσμου γλυκαιμικού ελέγχου σε σχέση με τον απλό προσδιορισμό της γλυκόζη στο αίμα και στα ούρα

Πότε γίνεται η μέτρηση H πρώτη εξέταση της A1c γίνεται στην διάγνωση του διαβήτη και χρησιμεύει σαν τιμή αναφοράς. Η εξέταση ίσως χρειαστεί να επαναληφθεί όταν ρυθμισθεί η γλυκόζη του αίματος. H επανάληψη της εξέτασης εξαρτάται από τον τύπο του διαβήτη, τον σχεδιασμό της θεραπείας, και την επιτυχία της ρύθμισης του σακχάρου. ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ Μία φορά τον χρόνο σε περιπτώσεις Προδιαβήτη (δείχνει υψηλότερο κίνδυνο για διαβήτη) Δύο φορές τον χρόνο σε περιπτώσεις διαβήτη τύπου 2, χωρίς χρήση ινσουλίνης και με επίπεδα γλυκόζης κοντά στον στόχο. Τρεις με τέσσερεις φορές τον χρόνο σε περιπτώσεις διαβήτη τύπου 1. Τέσσερεις φορές τον χρόνο σε περιπτώσεις διαβήτη τύπου 2, με χρήση ινσουλίνης και επίπεδα γλυκόζης που αποκλίνουν από τον στόχο. Περισσότερες φορές εάν ο γιατρός αλλάξει την θεραπεία.

Σακχαρώδης διαβήτης(ΣΔ) Σακχαρώδης διαβήτης(ΣΔ) Η HbA1c στη διαγνωστική προσέγγιση του ΣΔ και προ-Δ Διαγνωστική προσέγγιση του ΣΔ και προ-Δ ΓΛΥΚΟΖΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΤΥΧΑΙΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΛΥΚΟΖΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΝΗΣΤΕΙΑΣ ≥135mg/dl ≥200mg/dl <135mg/dl Σακχαρώδης διαβήτης(ΣΔ) <200mg/dl Επίπεδα HbA1c Επίπεδα HbA1c FPG:γλυκόζη πλάσματος νηστείας,RPG:γλυκόζη τυχαίου δείγματος 5.7% - 6.4% (39 - 46 mmol/mol) Διαγνωστική προσέγγιση του ΣΔ και προ-Δ προ-Διαβήτης(προ-Δ) ≥140mg/dl (47mmol/mol) Σακχαρώδης διαβήτης(ΣΔ) Η χρήση της στη διάγνωση του σακχαρώδη διαβήτη(ΣΔ) Η HbA1c στη διαγνωστική προσέγγιση του ΣΔ και προ-Δ ≤ 6.0%(42mmol/mol) Φυσιολογικό 5.7% - 6.4% (39 - 46 mmol/mol) προ-Διαβήτης(προ-Δ) ≥6.5% (47mmol/mol) Σακχαρώδης διαβήτης(ΣΔ) Με βάση τις οδηγίες της Αμερικάνικης Εταιρείας Διαβήτη(ADA) η δοκιμασία γλυκόζη πλάσματος νηστείας απαιτεί νηστεία 8-14 ωρών και τουλάχιστον 3 ημέρες χωρίς αυστηρή δίαιτα.

ΤΙΜΕΣ ΤΗΣ A1c ΓΙΑ ΤΑ ΠΑΙΔΙΑ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΕΦΗΒΟΥΣ Παιδιά ως 6 ετών <8.5% Παιδιά 6–12 ετών <8% Έφηβοι 13–19 ετών <7.5%

ΔΙΑΒΗΤΙΚΟΙ Οι διαβητικοί πρέπει να διατηρούν την HbA1c κοντά στο 7%. Επίπεδα > 9% δείχνουν κακό έλεγχο του διαβήτη Επίπεδα >12% δείχνουν πολύ κακό έλεγχο του διαβήτη Για τους διαβητικούς ασθενείς είναι πιο εύκολο να κάνουν την εκτίμηση για το διαβήτη τους με την μέση εκτιμώμενη γλυκόζη. Γιατί : με την μέση εκτιμώμενη γλυκόζη χρησιμοποιούν τις ίδιες μονάδες που έχει και ο προσωπικός τους μετρητής γλυκόζης, και με τις οποίες είναι εξοικειωμένοι. Η σχέση μεταξύ της μέσης εκτιμώμενης γλυκόζης και των μετρήσεων σακχάρου στο μετρητή μπορεί να βοηθήσει να καταλάβει ο ασθενής πώς οι καθημερινές μετρήσεις σχετίζονται με τη μακροχρόνια ρύθμιση του σακχάρου.

ΔΙΑΒΗΤΙΚΟΙ Μερικοί άνθρωποι που αποκτούν διαβήτη έχουν φυσιολογικά επίπεδα A1c στα πρώτα στάδια της πάθησης. Επίσης η A1c μπορεί να είναι φυσιολογική σε ασθενείς με διαβήτη που δεν είναι σε θεραπεία αλλά έχουν άλλα ιατρικά προβλήματα. Τα επίπεδα της A1c δεν είναι χρήσιμα για την ανίχνευση της υπογλυκαιμίας και δεν υποκαθιστούν τα άλλα τεστ για την ανίχνευση της γλυκόζης του αίματος.

ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Σε μεγάλη ή χρόνια αιμορραγία που ελαττώνονται οι εφεδρείες της αιμοσφαιρίνης και σε άλλες καταστάσεις που προκαλούν πρόωρο θάνατο των ερυθρών αιμοσφαιρίων η εξέταση της A1c είναι ψευδώς χαμηλή: αιμολυτική αναιμία, δρεπανοκυτταρική αναιμία, θαλασσαιμία, έλλειψη γλυκόζη-6-φωσφορική αφυδρογονάση (G6PD), ηπατική νόσος, μετά από χορήγηση υψηλών δόσεων  βιταμίνης C ή μετά από θεραπεία με ερυθροποιητίνη η εξέταση της A1c είναι ψευδώς ψηλή : σε ασθενείς με παρατεταμένο χρόνο ζωής των ερυθρών αιμοσφαιρίων, νεφρική ανεπάρκεια, χρόνια κατανάλωση αλκοόλ, υπερτριγλυκεριδαιμία, ανεπάρκεια Β12 ή φυλλικού οξέος. Εάν κάποιος έχει μια ασυνήθιστη μορφή αιμοσφαιρίνης τα αποτελέσματα της A1c θα είναι λανθασμένα. Επίσης τα αποτελέσματα μπορεί να διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων.

Επιθετική θεραπεία για τα επίπεδα Γλυκόζης Τάση να γίνονται άσκοπες μετρήσεις της HbA1C, και χορήγηση νέων φαρμάκων για τον διαβήτη στους ενήλικες με διαβήτη τύπου 2 Η υπερ-χορήγηση φαρμάκων μπορεί να οδηγήσει σε παρενέργειες, υπογλυκαιμία και να βλάψει σοβαρά τους ασθενείς και κυρίως τους μεγαλύτερους σε ηλικία που έχουν ήδη άλλα ιατρικά προβλήματα. Ανεβάζει το κόστος στους ασθενείς και στο σύστημα υγείας με λίγα ή καθόλου ωφέλη βραχυπρόθεσμα ή μακροπρόθεσμα. JAMA Internal Medicine.

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ Α1c ME HPLC υγρή xρωματογραφία υψηλής απόδοσης Fundamentally, chromatography is a technique used to separate the components contained in a sample. Above all, high performance liquid chromatography (HPLC) is a type of chromatography that, because of its wide application range and quantitative accuracy, is regarded as an indispensable analytical technique, particularly in the field of organic chemistry. It is also widely used as a preparation technique for the isolation and purification of target components contained in mixtures. An overview of HPLC, from the basic principles of chromatography to the characteristics of HPLC itself, is presented here.

XΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Στην Χρωματογραφία έχουμε 2 φάσεις: Μία σταθερή και μία κινητή φάση Η κινητή φάση, διέρχεται μέσα από τη στατική, και προκαλεί διαφορετική μετατόπιση των συστατικών ενός μείγματος Έτσι τα συστατικά διαχωρίζονται μεταξύ τους (Συνήθως) εξέρχονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές Εάν στην έξοδο τους υπάρχει ένα σύστημα ανίχνευσης και καταμέτρησης της ποσότητας κάθε συστατικού, εκτός του ποιοτικού διαχωρισμού τους, πραγματοποιείται και ποσοτικός προσδιορισμός

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Στην χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων η σταθερή και η κινητή φάση είναι αντίθετα φορτισμένες και προσελκύονται μεταξύ τους ώστε οι προς μέτρηση ουσίες να κατακρατούνται από ηλεκτροστατικές δυνάμεις Η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων είναι δύο ειδών: χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων Iονισμένες ουσίες που μπορούν να μετρηθούν με την χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων: Πρωτείνες ,πεπτίδια και αμινοξέα

Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής Χρησιμοποιούνται ιονανταλλακτικές ρητίνες ή γέλες ως στερεή στατική φάση και ένα υγρό ως κινητή φάση Τα Ιοντικά συστατικά του μείγματος συγκρατούνται ηλεκτροστατικά σε διάφορο βαθμό από τις με αντίθετο φορτίο ιοντικές ομάδες στατικής φάσης Όταν άτομα ή χημικές ρίζες αποκτήσουν ηλεκτρόνια τότε σχηματίζουν ιόντα με αρνητικά ηλεκτρικά φορτία. Αυτού του τύπου τα ιόντα ονομάζονται ανιόντα. Αντίθετα όταν τα παραπάνω άτομα ή ρίζες χάνουν ηλεκτρόνια τότε μετατρέπονται σε κατιόντα, δηλαδή με θετικό ηλεκτρικό φορτίο.

Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης ή Υψηλής Πίεσης HPLC Detector Column Pump Column Oven (thermostatic column chamber) The configuration of a high performance liquid chromatograph includes a solvent delivery pump, a sample injection unit, a column chamber, a detector, and a data processor (recorder). These units are essential. Accessories are added as necessary. The roles of these five basic units are as follows: Solvent Delivery Pump This unit delivers the eluent to the column. It incorporates features that allow it to maintain a constant, non-pulsating flow of solvent at a high pressure against the resistance of the column. Sample Injection Unit This unit introduces the sample to the column by injecting a specific quantity of sample solution. Types include a manual injector, which performs injection using a microsyringe, and an autosampler, which automatically injects a series of samples. Column Oven This unit maintains the column at a constant temperature. Temperature is an important factor that influences separation, so maintaining the column at a constant temperature makes it possible to improve the quality of separation and the reproducibility. This unit is also called a thermostatic column chamber. Detector This unit detects the components eluted from the column. There are many different types of detectors, based on various operating principles, and the detector used is selected according to the properties of the target compounds and the objective of analysis. UV-VIS absorbance detectors are the most commonly used. Data Processor (Recorder) This unit draws chromatograms by recording the signals received from the detector on charts or magnetic media. Data processors that, in addition to recording, have functions for adding peak areas and performing quantitative calculations are commonly used. Furthermore, systems that perform both instrument control and data processing using PCs are widespread. Sample injection unit (injector) Eluent (mobile phase) Drain Data processor Degasser

ANAΛΥΤΗΣ ΗbA1c BIORAD O D-10 Hemoglobin A1c αναλυτής βασίζεται στην ιονοανταλλακτική HPLC. Τα δείγματα αραιώνονται αυτόματα και προστίθενται στην αναλυτική στήλη. Οι αιμοσφαιρίνες διαχωρίζονται βάσει των ιοντικών τους αλληλεπιδράσεων με το υλικό της στήλης. Οι διαχωρισμένες αιμοσφαιρίνες εισέρχονται στο κύτταρο του φωτομέτρου και μετράται η απορρόφηση τους στα 415 nm. Χρησιμοποιούνται βαθμονομητές(calibrators) 2 επιπέδων. Το λογισμικό του D-10 επεξεργάζεται τα αποτελέσματα. Η απάντηση δίνεται σαν αποτέλεσμα και σαν σχεδιάγραμμα. Η καμπύλη A1c είναι σκιασμένη.