Nastanak i vrste mutanata Izolovanje mutanata Mutageneza Nastanak i vrste mutanata Izolovanje mutanata

Fenotipska i genotipska promenljivost Fenotipska promenljivost – adaptacija na uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve jedinke u populaciji, ne nasleđuje se Genotipska promenljivost – promena u genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i nasleđuje se

Genetička varijabilnost Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji je neophodno za adaptaciju na izmenjene uslove sredine, opstanak i evoluciju živih organizama. Mehanizmi genotipske promenljivosti Mutacije – promene u broju i redosledu nukleotida u molekulu DNK Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije gena prenosom dela genetičke informacije iz jedne ćelije u drugu (horizontalni transfer gena) Transpozicije – premeštanje jednog ili više gena sa jednog mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi (sa plazmida na hromozom ili obrnuto, sa jednog palzmida na drugi isl.)

Reparacija DNK Velika promenljivost naslednog materijala može ugroziti opstanak organizma – proces mutageneze se mora održavati na nivou niske učestalosti Od vitalnog je značaja očuvati integritet nasledne informacije → kod svih organizama oštećenja na molekulu DNK se moraju ukloniti (ostali molekuli se mogu zameniti, ponovo sintetisati) Raznovrsni reparacioni sistemi razvijeni tokom evolucije su rezultat raznovsnosti oštećenja koja nastaju na DNK Većina reparacionih mehanizama se oslanja na komplementarnost baza i ne greši– error free Mali broj mehanizama greši – error-prone Održavanje života – strogi balans procesa reparacije DNK i mutageneze – dinamička ravnoteža koja učestalost mutacija održava na niskom nivou → balans između potrebe očuvanja genetičke informacije i potrebe promenljivosti koja omogućava evolutivne procese

Mehanizmi DNK reparacije kod prokariota 1. Direktna reverzija oštećenja Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin Fotoreaktivacija – monomerizuje pirimidinske dimere 2. Eksciziona reparacija - Ekscizija (isecanje) baza (BER) ispravlja oštećene ili neodgovarajuće baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane baze) - Ekscizija (isecanje) nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa - „Mismatch repair“ (MMR) ispravlja greške u toku replikacije, pogrešno sparene baze 3. Mehanizmi tolerancije oštećenja - rekombinacija (rekombinaciona reparacija, ispravlja prekide u DNK) - DNK Pol II zavisan „bypass“ (premošćivanje) oštećenja, inducibilan proces - DNK Pol IV i Pol V zavisna replikacija oštećenja, translezijska sinteza, inducibilna “error-prone” reparacija

Oštećenja DNK i reparacioni sistemi Postoji delimično preklapanje mehanizama: Isti reparacioni mehanizam može ispravljati različite tipove oštećenja Veći broj reparacionih sistema ispravlja jedan tip (česta) oštećenja

Neispravljen: G:C → A:T Dealkilacija Alkilirajući agensi (MMS, EMS, MNNG) Enzim O6-metilguanin DNK metiltransferaza (produkt ada gena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina, što ga inaktivira (nije enzim po strogoj definiciji) Neispravljen: G:C → A:T

Fotoreaktivacija UV (254 nm) dovodi do dimerizacije pirimidina (ciklobutanski pirimidinski dimeri i 6-4 fotoprodukti) Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2 prepoznaje pirimidinski dimer i vezuje se Kompleks apsorbuje kvant svetlosti (300-500 nm) i koristi energiju za razdvajanje dimera Fotoliaza se oslobađa Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i nekih životinja

Ekscizija baza - BER Oksidativna deaminacija baza (C u U), hidroksimetiluracil, 5-metilcitozin, hipoksantin, 8-oxoG Specifične DNK glikozilaze – uklanjaju bazu, hidrolizuju N-glikozidnu vezu (nastaje AP mesto) AP endonukleaze - raskidaju fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5' (najčešće) ili 3' od AP mesta Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom se zamenjuju reparativnom sintezom (DNK Pol I) i ligacijom

Ekscizija nukleotida - NER UvrABC endonukleaza + UvrD helikaza Prepoznavanje oštećenja (dimera) i vezivanje proteinskog kompleksa Dve incizije na oštećenom lancu (5' i 3' od mesta oštećenja) Uklanjanje oligonukleotida (12 nt) sa oštećenjem Popunjavanje nastalog prekida DNK polimerazom I i ligacija „Transcription-coupled TC-NER” (ispravka na transkripciono aktivnom lancu) i globalna NER reparacija (ispravka oštećenja na oba lanca)

Reparacija pogrešno sparenih baza - MMR Editorska funkcija DNK polimeraze zataji: postojanje pogrešno sparenih baza (npr. A:C) Najčešći razlog nastanka: tautomerija baza Obe baze su ispravne, ali pogrešno sparene → mora postojati signal koji lanac treba ispravljati: Metilacija GATC sekvenci Dam metilazom (razlikovanje roditeljskog i novosintetisanog lanca) MutS protein prepoznaje pogrešno sparen bazni par MutH endonukleaza prepoznaje hemimetilovanu GATC sekvencu Formira se MutS/MutL/MutH kompleks MutH endonukleaza iseca nemetilovanu GATC sekvencu Lanac se degraduje egzonukleazama (dužina fragmenta i do 2000 nt) DNK Pol III popunjava prekid DNK ligaza povezuje lanac

Postreplikativna rekombinaciona reparacija Mehanizam za toleranciju oštećenja: popunjavanje jednolančanih prekida u novosintetisanom lancu (daughter-strand gaps - DSG) RecA zavisan mehanizam za ispravku: jednolančanih prekida (single-strand breaks – SSB i DSG) dvolančanih prekida (double-strand breaks - DSB)

Translezijska sinteza - TLS Inducibilni mehanizam uključen u toleranciju oštećenja Replicira lanac koji sadrži oštećenje Deo je odgovora ćelije na velika oštećenja DNK (SOS odgovor) Biološki smisao SOS odgovora je povećanje kapaciteta reparacije i preživljavanja TSL povećava preživljavanje, ali i genetičku varijabilnost

Model SOS indukcije kod E. coli LexA represor sprečava ekspresiju gena SOS regulona Zaustavljanjem replikacije na oštećenju formira se signal za SOS indukciju (ssDNK). RecA protein se vezuje za ssDNK i aktivira se (RecA*) RecA* ima koproteaznu ulogu, pomaže autokatalitičku razgradnju LexA represora Povećava se ekspresija inhibitora ćelijskih deoba i nekih proteina koji učestvuju u NER i rekombinacionoj reparaciji Eksprimiraju se polB (Pol II), dinB (Pol IV), i umuDC operon (Pol V)

RecA* omogućava post-translacionu obradu UmuD proteina u aktivnu formu UmuD’ Kompleks UmuD’2C je DNK Pol V koja vrši translezijsku sintezu Pol V nema editorsku funkciju (egzonukleaznu funkciju), ne može da ukloni pogrešan nukleotid Replizom (Pol III) se zaustavlja na oštećenju Zamena replizoma mutazomom (Pol V) Translezijska sinteza, ugrađivanje nekomplementarnih nukleotida naspram oštećenja Ponovno uspostavljanje replikacije Pol V TLS

Pol II i Pol IV reparativni mehanizmi ima editorsku funkciju omogućava nastavak replikacije nekoliko minuta posle njenog zaustavljanja na oštećenju „replication restart“ mehanizmom “chickenfoot” Pol IV nema editorsku funkciju – reparacija error-prone replicira AP mesta i velike adukte, npr. indukovane sa derivatima B(a)P ne može da ugrađuje nukleotide naspram pirimidinskih dimera

Pol II replication restart Regresija replikativne viljuške pomoću RecA + RecFOR kompleksa Pol II kopira neoštećeni novosintetisani lanac – struktura “chickenfoot” RecG vraća replikativnu viljušku na početnu poziciju PriA omogućava nastavak replikacije pomoću Pol III

Mutacije Promene u broju ili redosledu nukleotida u molekulu DNK Mutacije su redak i slučajan događaj i uglavnom imaju negativan efekat Mali broj mutacija omogućava evolutivne promene

Tipovi mutacija Tačkaste mutacije - zamene baznog para (tranzicije ili transverzije) i promene okvira čitanja Delecije - gubitak baznih parova Adicije - dodavanje baznih parova Insercije - umetanje većeg broja baznih parova Inverzije - isecanje dela DNK i umetanje u obrnutom smeru Duplikacije - oblik adicija kod kojih su dodati nizovi baza identični

Zamene baznog para - efekat na strukturu proteina

Vanfazne - frameshift mutacije

Upravne mutacije i reverzije Upravne (forward) mutacije – u divljem soju, gubitak funkcije Reverzije (povratne mutacije) – nove mutacije koje uspostavljaju fenotip divljeg soja Prave reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna, wt stanje se uspostavlja i na genotipskom nivou Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava efekat prethodne, na fenotipskom nivou se uspostavlja wt stanje Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr. frameshift Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu, npr. supresija nonsense mutacije pomoću supresorskih tRNK

Spontane mutacije Greške u replikaciji izazvane tautomerijom baza “Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida Replikacija ili „error prone“ reparacija endogenih oštećenja DNK (oksidativna oštećenja, depurinacija, itd) Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih mutacija: Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim agensima, mutagenima, koji mogu izazvati različita oštećenja u molekulu DNK i povećati stopu mutacija Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija: Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi) Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno sparivanje (alkilacija, oksidativna deaminacija) Interkalacija (EtBr, akridin oranž) Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)

Mutagen Dejstvo Tip mutacija Bazni analozi 5-Bromouracil 2-aminopurin Analog T, sparuje se sa G Analog A, sparuje se sa C AT→GC, GC →AT Modifikacija baza Azotasta kiselina HNO2 Hidroksilamin NH20H Deaminacija A u H i C u U Reaguje sa C AT→GC i GC →AT GC →AT Alkilirajući i cross linking agensi Metil metan sulfonat MMS Mitomicin C Metiluje G (G me-T) Povezuju lance u dsDNK Tačakste, delecije Interkalirajući agensi Akridini Etidijum bromid EtBr Ubacuju se između 2 bp Male insercije i delecije Zračenja Ultravioletno UV-254 nm Jonizujuća (X-) Formiranje dimera pirimidina Slobodni radikali, prekidi lanaca U toku ispravke može doći do tačkastih mutacija ili delecija

Fiksacija mutacija Proces od nastanka oštećenja do nastanka mutacije Potrebne dve replikacije za fiksaciju mutacija U prvoj replikaciji naspram oštećenja dolazi do ugrađivanja nekomplementarnog nukleotida u novi lanac DNK U drugoj replikaciji dolazi do kopiranja templeta sa pogrešnim nukleotidom i stvara se mutirana DNK

Posledice delovanja mutagena Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji ne greše Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji greše - indukcija mutacija Smrt ćelije Manje od 1/1000 oštećenja će biti fiksirano u mutaciju

Mutanti Jedinke kod kojih je došlo do mutacija i koje se fenotipski razlikuju od roditelja Mutanti u morfologiji Mutanti u ishrani (auksotrofi) Mutanti rezistentni na antibiotike Mutanti u reparaciji DNK Uslovni mutanti

Izolovanje mutanata U morfologiji Zasejavanjem na bogate podloge i posmatranjem morfologije kolonija pr. Serratia marcescens (crvene kolonije nemutirane, mali br. belih kolonija – mutanti) Rezistentnih na antibiotike Zasejavanjem na podloge sa antibioticima (selektivne podloge – selektivno rastu samo bakterije otporne na dati antibiotik)

Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja bogata podloga mimimalna podloga

Izolovanje mutanata U reparaciji DNK (primer: mutanti sa nefunkcionalnim NER mehanizmom) „Replica plating“ tehniku koristimo da zasejemo bakterije na dve bogate podloge, prvu tretiramo mutagenom (npr. ozračimo UV zracima), druga je netretirana kontrola. One kolonije koje rastu samo na netretiranoj podlozi su mutanti u reparaciji. Uslovnih mutanata (primer: mutanti osetljivi na temperaturu) U permisivnim uslovima mutacija se ne ispoljava na fenotipskom nivou, u nepermisivnim se ispoljava. Replica plating tehniku koristimo da zasejemo bakterije na dve bogate podloge, prvu gajimo u nepermisivnim uslovima, drugu u permisivnim. One kolonije koje rastu samo u permisivnim uslovima su uslovni mutanti.

Fenotip Vrsta promene Detekcija mutanata Auksotrofi Odsustvo biosintetičkih puteva Ne rastu na MM Osetljivi na temperaturu Promene u proteinima koji se inaktiviraju na određenoj temp. Ne rastu na temperaturama na kojima roditelji rastu Rezistentni na antibiotike Izmenjena propustljivost, izmenjeno mesto vezivanja ili razgradnja antibiotika Rastu na antibiotskim podlogama Bez kapsule ili LPS Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili LPS Male, grube (rough) i nepravilne kolonije Gubitak flagela, nepokretni Odsustvo enzima za sintezu flagelina Kompaktne kolonije Gubitak pigmenta Odsustvo enzima za sintezu pigmenata Kolonije su drukčije boje ili bezbojne Ne fermentišu šećere Odsustvo enzima za razgradnju šećera Ne menaju pH podloge i boju indikatora Osetljivi na mutagene Odsustvo enzima za reparaciju DNK Ne rastu na podlogama koje sadrže mutagen Rezistentni na viruse Gubitak receptora za viruse Rastu u prisustvu virusa

Testovi za detekciju mutagena Ames test, test na bakteriji S. typhimurium Najpoznatiji, rutinski se koristi za ispitivanje mutagenog efekta različitih supstanci Osnovni princip: Bakterije gajimo u prisustvu i odsustvu test supstance u uslovima koji dozvoljavaju uočavanje i brojanje mutanata. Upoređivanjem broja mutanata zaključujemo da li je test supstanca mutagena (i koliko je mutagena) ili nije.

Ekstrahromozomalni genetički elementi Plazmidi i epizomi Insercione sekvence i transpozoni Invertibilni genetički elementi

Plazmidi Mali DNK molekuli van hromozoma, najčešće cirkularni (izuzetak su linearni plazmidi Streptomyces i Borrelia) Ako imaju sposobnost integracije u hromozom – epizomi Imaju sopstveni ori, autonomno se repliciraju i regulišu broj kopija u ćeliji (F faktor – br kopija 1-2, ColE1 – br kopija oko 50, postoje plazmidi sa ~100 kopija po ćeliji) Mehanizam replikacije: cirkularni molekuli (θ replikacija, mehanizam kotrljajućeg obruča); linearni molekuli (za 5’ kraj svakog lanca se vezuje proteinski prajmer, jednolančani krajevi vezani kovalentno u strukturu ukosnice – zaštita od ćelijskih nukleaza i obezbeđivanje prajmera) Enzimi uključeni u relikaciju su kodirani sa hromozoma, ali plazmid obezbeđuje informaciju za inicijaciju replikacije i pravilnu distribuciju kopija u kćerke ćelije) Nose genetičke informacije neesencijalne za domaćina (domaćin može da preživi i bez plazmida, ne kodiraju esencijalne životne funkcije) Povećavaju kompetitivnost, u specifičnim uslovima daju domaćinu selektivnu prednost nad bakterijama koje ih ne poseduju (bolje preživljavanje)

Osobine bakterija kodirane plazmidima Proizvodnja antibiotika (Streptomyces) Proizvodnja bakteriocina (E.coli, Bacillus) Konjugacija (E.coli, Staphylococcus, Streptococcus) Rezistencija na antibiotike i teške metale (enterične bakterije, Neisseria, Staphylococcus, Pseudomonas) Specifični katabolički putevi (Clostridium, Rhizobium, Pseudomonas – degradacija oktana, naftalena ili kamfora) Faktori patogenosti (Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Agrobacterium, enteropatogene E.coli,)

Podela plazmida Prema veličini, broju kopija, sposobnosti za samostalni transfer konjugacijom i mehanizmima replikacije Konjugativni (veliki, mali broj kopija, repliciraju se sinhrono sa hromozomom domaćina, imaju mehanizme za distribuciju u ćerke ćelije) Nekonjugativni plazmidi (mali, veliki broj kopija, repliciraju se nezavisno od replikacije hromoza) Horizontalan transfer plazmida (prenos kroz populaciju sa ćelije na ćeliju: konjugacijom, nekonjugativni – transdukcijom ili transformacijom, ili ih konjugativni mobilišu Svrstavaju se u inkompatibilne grupe u zavisnosti od gena uključenih u kontrolu replikacije (inc geni). Dva plazmida iste inkompatibilne grupe su u kompeticiji kada se nađu u istoj ćeliji domaćinu – ne mogu opstati zajedno, nakon određenog broja deoba jedan od njih se gubi.

F plazmid Konjugacija kod E. coli

R plazmidi R100 plazmid - 89,3 kbp Rezistencija na streptomicin, fusidinsku kiselinu, tetraciklin, hloramfenikol, sulfonamide i soli žive Konjugativni plazmid enterobakterija

Ti plazmid iz Agrobacteruim tumefaciens Nosi T-DNK koja se unosi u biljnu ćeliju, odlazi u nukleus i stabilno se ugrađuje u hromozome T-DNK nosi funkcionalne biljne promotore odgovorne za pojačanu sintezu biljnih hormona, uzrokuje tumore stabla Transformisano tkivo sintetiše opine, derivate arginina koji bakteriji služe u ishrani Na Ti plazmidu su geni za katabolizam opina

Transpozoni Genetički elementi koji se premeštaju sa jednog mesta na hromozomu na drugo procesom transpozicije - mesto specifičnom rekombinacijom (site-specific recombination)

IS sekvence Najjednostavnije građeni transpozoni, dužine 700-2500 bp, kodiraju samo enzime transpozaze koji katalizuju transpoziciju, na krajevima su invertovani ponovci

Pravi transpozoni Prosti: slične građe kao IS sekvence, ali pored gena za transpozazu nose i gene za faktore virulencije ili rezistenciju na antibiotike (Tn3, Tn7, itd) Složeni: ograničeni IS sekvencama, a u centralnom delu su geni za faktore virulencije ili rezistenciju na antibiotike (Tn5, Tn10) Najsloženiji transpozon je Mu (mju) bakteriofag.

Mehanizmi transpozicije Konzervativna transpozicija Isecanje transpozona sa prvobitne pozicije i ugradnja na novom mestu (transpozon uklonjen sa prvobitne pozicije)

Mehanizmi transpozicije Replikativna transpozicija Pojava nove kopije transpozona na drugom mestu (transpozon postoji i na prvobitnoj poziciji) Privremenu strukturu – kointegrat razdvaja enzim resolvaza

Efekti transpozicije Insercione mutacije Veliki genetički rearanžmani (delecije, inverzije) Promene u ekspresiji gena

Invertibilni genetički elementi; fenomen fazne varijacije kod S Invertibilni genetički elementi; fenomen fazne varijacije kod S. typhimurium Invertovani ponovci oko hin gena (kodira Hn protein – enzim invertazu) Fazna varijacija – reverzibilne promene u strukturi flagela Biološki smisao – zaštita od odbrambenih mehanizama domaćina (S. typhimurium je patogena)