Razmena genetičkog materijala kod prokariota

Mehanizmi razmene gena kod prokariota Prenošenje dela genetičkog materijala iz ćelije donora u ćeliju recipijenta konjugacijom transformacijom transdukcijom Rekombinacijom sa hromozomom recipijenta nastaje rekombinant

Rekombinacija homologa rekombinacija Fundamentalan ćelijski proces odgovoran za fizičku razmenu genetičkog materijala između različitih genetičkih elemenata. homologa rekombinacija mesto-specifična (“site-specific”) rekombinacija ilegitimna rekombinacija

Homologa rekombinacija Fundamentalni biološki proces, uključuje RecA zavisnu razmenu homologih sekvenci DNK različitog porekla. Kod E.coli postoje dva glavna puta (RecBCD, RecF) sa najmanje 25 gena RecA protein se polimerizuje na ssDNK (5'3' smer) i formira se nukleo-proteinski filament koji ima afinitet za homologi segment dsDNK (invazija lanca) Prekid se formira u homologom segmentu na lancu iste polarnosti i lanci se unakrsno povezuju (Holidejeva struktura) Holidejeva struktura migrira i formiraju se heterodupleksi Holidejeva struktura se razdvaja na dva moguća načina

Detekcija rekombinanata Odaberemo donora i recipijenta tako da se razlikuju po svojstvu koje pratimo: Donor:Trp+ (sintetiše triptofan) Recipijent:Trp- (ne sintetiše trp) Podloga: minimalni medijum (ukoliko zasejemo samo recipijente nakon transfera DNK, rastu samo rekombinanti koji su postali Trp+)

Konjugacija Transfer plazmida F plazmid (fertility factor)

Konjugacija – transfer plazmida ili čitavog hromozoma

Konjugacija, transfer hromozoma Integracija F plazmida u hromozom može se desiti na većem broju mesta Kada se F plazmid integriše u hromozom formira se Hfr (High Frequency of Recombination) soj Konjugacijom sa Hfr sojem dolazi do prelaska hromozoma u ćeliju recipijenta Transfer kompletnog hromozoma domaćina (veoma redak) traje 100 min. Proces se može koristiti u mapiranju gena na hromozomu

Lederberg i Tejtum, 1946 Dejvis, 1950

Kako selektovati transkonjugante (rekombinante nastale procesom konjugacije)? Hfr donor: prototrof (thr+, leu+), koristi laktozu (lac+), osetljiv na antibiotik (npr. streptomicin - str) Recipijent: auksotrof, ne sintetiše faktore rasta (thr-, leu-), ne koristi laktozu (lac-), otporan na antibiotik streptomicin Selekcija rekombinanata: 1. [ MM +str+glukoza ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+ 2. [ MM+str+laktoza (nema glukoze)+ thr+leu ] → rastu rekombinanti koji su postali Lac+ 3. [ MM+str+laktoza (nema glukoze) ] → rastu rekombinanti koji su postali Thr+ i Leu+ i Lac+

Transdukcija Transfer gena iz donora u recipijenta pomoću virusa Generalizovana transdukcija – prenos bilo kojeg fragmenta DNK donora u recipijenta. Efikasnost niska. Specijalizovana transdukcija – prenos određenog dela DNK donora u recipijenta. Efikasnost može biti veoma visoka.

Generalizovana transdukcija (model P1 fag) Umesto virusne DNK u virusnu česticu se upakuje bilo koji fragment domaćinove DNK odgovarajuće veličine (virus postaje ’defektan’, transdukujući fag)

Specijalizovana transdukcija (model λ fag) DNK umerenog virusa (profag) se pogrešno iseca iz hromozoma domaćina noseći deo svoje DNK i susedne gene domaćina

Otkriće transformacije, Grifit 1928 Streptococcus pneumoniae S ćelije sa kapsulom (kapsula je faktor patogenosti) R ćelije mutanti bez kapsule (nepatogene) Hemijska priroda “transformišućeg principa” – molekul DNK (Averi, 1944)

Transformacija Indukcija kompetencije (prirodna - quorum sensing fenomen kod B. subtilis ili veštačka) Com proteini (regulišu quorum sensing odgovor, učestvuju u vezivanju DNK i formiranju pore za njen prolazak) Uzimanje slobodne DNK često uz degradaciju jednog lanca Integracija u hromozom recipijenta homologom rekombinacijom

Kompetencija (sposobnost transformacije) Sposobnost prihvatanja gole DNK Prirodna: Azotobacter, Bacillus, Haemophilus, Streptococcus, Neisseria, Thermus Veštačka: E. coli Indukovana elektroporacijom Indukovana termalnim šokom i Ca2+ jonima Lakši ulaz cirkularne DNK (plazmida)

Rasprostranjenost razmene gena kod Bacteria Konjugacija: E. coli, enterične bakterije, Streptococcus, Staphylococcus Transdukcija: čest proces kod Bacteria, redak kod Archaea (metanogeni) Transformacija: Bacillus, Streptococcus, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria, Thermus (prirodno kompetentne)

Rasprostranjenost razmene gena kod Archaea Mnogo manje proučavana, pre svega zbog teže kultivacije (neophodnost gajenja na čvrstim podlogama i dobijanja pojedinačnih kolonija, manje selektivnih agenasa dostupno – antibiotici novobiocin (inhibitor DNK žiraze, deluje u oba domena prokariota) ili neomicin (inhibitori sinteze proteina na prokariotskim ribozomima) Sva tri procesa dokazana i kod Archaea Konjugacija: Sulfolobus solfataricus – slično kao kod bakterija, jednosmerni transfer DNK; kod nekih halofila dvosmerni transfer Transformacija: problem sticanja kompetencije: delovanjem dvovalentnih jona metala koji destabilišu glikoproteinske zidove Archaea Transdukcija: retka, dokazana kod Methanobacterium thermoautotrophicum

Transfer gena iskorišćen za eksperimente komplementacije Parcijalni diploid – merodiploid (jedna kopija gena na hromozomu, druga na plazmidu ili fagnoj DNK): genetičkim inženjerstvom može da se ciljano konstruiše Ispitivanje da li su mutacije koje dovode do iste fenotipske promene na istom ili različitim genima – exp. komplementacije (da li mutacije mogu da se dopunjuju) Mutacije koje se nalaze na istoj DNK – cis forma, na različitim DNK – trans forma Da li 2 mutacije u trans obliku mogu međusobno da komplementiraju i daju wt fenotip? Cis-trans sistem – pojam cistrona

Tehnologija rekombinantne DNK - genetičko inženjerstvo Izučavanje gena van organizma za koji je karakterističan Skup in vitro tehnika kojima je omogućeno stvaranje himernih molekula DNK, korišćenje in vitro tehnika za izmene gentičkog materijala u laboratoriji. Kloniranje gena: Izolovanje gena iz organizma Prebacivanje u manje genome - vektore za kloniranje Ubacivanje u ćeliju domaćina Selekcija transformisanih ćelija i identifikacija klona koji sadrži željeni gen Amplifikacija gena u domaćinu ili ekspresija stranog proteina u domaćinu Primena u istraživanju ili komercijalnoj proizvodnji korisnih produkata

Restrikcione endonukleaze Prisutne u oba domena prokariota Najčešći tip kod bakterija su RE tipa II (seku unutar prepoznate sekvence) Dimeri, seku dvolančanu DNK na palindromskim sekvencama koje nisu modifikovane (najčešće asimetrično) ostavljajući kratke jednolančane komplementarne krajeve (lepljivi krajevi, ‘sticky ends’) Dobijaju ime prema bakteriji iz koje su izolovane (EcoRI, HindIII, BsuRI, BamHI itd) ..G׀AATTC.. .G AATTC.. GAATTC ..C TTAA׀G.. .CTTAA G.. CTTAAG

Dobijanje himernih DNK molekula Tretiranje izolovane DNK restrikcionom endonukleazom Tretiranje DNK vektora istim enzimom Razdvajanje fragmenata pomoću gel elektroforeze Povezivanje molekula pomoću DNK ligaze Ubacivanje u ćeliju domaćina transformacijom

Osobine vektora za kloniranje Mali dobro okarakterisani DNK molekuli (po pravilu do 10 kbp) Autonomno se repliciraju u domaćinu i prenose u ćerke ćelije Imaju selektabilne genetičke markere Imaju jedno restrikciono mesto za pojedinu restrikcionu endonukleazu

Vektori za kloniranje Plazmidi, derivati prirodnih plazmida Virusi, uglavnom bakteriofagi Kozmidi Veštački hromozomi Ekpresioni vektori Šatl vektori

Plazmidni vektori Plazmid pBR322 (E. coli i S. typhimurium): bla gen (enzim β-laktamaza) – rezistencija na ampicilin tet gen (membranski protein, efluks antibiotika iz ćelije) – rezistencija na tetraciklin U okviru gena tet restrikciono mesto BamH1 Domaćin je osetljiv na oba antibiotika; uspešno kloniranje: ćelije nosioci kloniranog gena su ampRtetS

Plazmidni vektori pUC plazmidi Ampicilinska rezistencija Restrikciona mesta različitih enzima – polilinker sekvenca Restrikciono mesto je u okviru dela lacZ gena (kodira α-fragment β-galaktozidaze); ω-fragment β-galaktozidaze sintetiše ćelija; u odsustvu strane DNK enzim β-galaktozidaza je funkcionalan β-galaktozidaza razgrađuje laktozu, ali i njene analoge (Xgal), razgradnjom analoga nastaje obojeno jedinjenje – plave kolonije Selekcija ćelija sa kloniranim genom primenom Xgal: plave kolonije – nose samo plazmid, bele kolonije – uklonirana strana DNK

Identifikacija klona Izborom odgovarajućeg vektora, koji nosi pogodne ’reporter gene’ (selektabilne markere) pr. pBR322 - nosi gene za rezistenciju na amp i tet; pUC plazmidi – nose lacZ gen Hibridizacijom DNK sa obeleženim probama )nakon lize ćelija) Upotrebom obeleženih antitela za željeni proteinski produkt (u slučaju ekspresionih vektora)

Plazmidni vektori Ekspresioni vektor Ekspresioni vektori (kontrolisana sinteza rekombinantnog proteina) Vektori za studiranje ekspresije gena (sadrže “reporter” gene, npr. lacZ) Kontrola transkripcije: gen se klonira iza jakog promotora, npr. lac ili trp promotor, ili hibrid ova dva – tac i trc Kontrola translacije: ubaciti željeni gen iza mesta koje prepoznaju bakterijski ribozomi, rešiti problem introna eukariotskih gena (reverzna transkriptaza katalizuje mrNK →cDNK, ona se klonira) i zameniti kodone onima koje prepoznaju tRNK bakterijske ćelije u koju je gen ubačen Ekspresioni vektor

Fagni vektori λ vektori M13 vektori λ litički vektor (geni odgovorni za lizogeni ciklus su zamenjeni kloniranim fragmentom) λ lizogeni vektor (ubacivanje kloniranog gena u hromozom E. coli, studiranje jedne kopije gena) M13 vektori ssDNK virus → lako sekvenciranje Ima dsDNK oblik (replikativna forma) neophodan za kloniranje Inficirane ćelije se održavaju u životu, virus ih ne lizira, tako da mogu biti kontinuirani izvor klonirane DNK Intergenski prostor koji ne kodira proteine i koji se može zameniti stranom DNK je dovoljno veliki DNK se pakuje prolaskom kroz membranu, veličina fagne partikule nije fiksna, zavisi od veličine upakovanog fragmenta

Kozmidi (kombinacija plazmidnog vektora i cos mesta λ faga) – pakovanje plazmidne DNK u glavu faga, klonirani fragmenti do 45-50 kb Shuttle vektori (plazmidi koji sadrže ori i selektabilne markere karakteristične za dva domaćina, npr. E. coli i B. subtilis ili eukariotska ćelija) “Artificial chromosome” (veštački hromozomi, klonirani fragment do 1000 kb) Kozmidi (na bazi λ faga) PACs (na bazi P1 faga) BACs (na bazi bakterijskog hromozoma) YACs (na bazi hromozoma kvasca) HACs (na bazi humanog hromozoma)

Ćelije domaćini za kloniranje

Genske biblioteke Kolekcije rekombinantnih klonova koji sadrže sve gene nekog organizma Genska biblioteka – kompletan genom cDNK biblioteka – kodirajuće sekvence genoma Izolacija ukupne iRNK iz ćelije (hibridizacijom polyA repa sa polyT fragmentima na koloni) korišćenje reverzne transkriptaze – sinteza cDNK Isecanje restrikcionim endonukleazama i kloniranje u vektor

Konstrukcija probe na osnovu iRNK - cDNK

Određivanje primarne strukture gena – sekvenciranje DNK Metoda po Maksamu i Gilbertu (primena nukleaza) Sangerov metod - dideoksi metod (primena dideoksi analoga nukleotida i DNK polimeraze); Nobelova nagrada

Metoda Sangera Našla primenu i u sekvenciranju RNK molekula (isti princip, samo se koristi reverzna transkriptaza i dideoksi analozi ribonukleotida) Automatski sistemi za sekvenciranje (dideoksi metod, ali obeležavanje nije radioaktivitetom, već je svaki nukleotid obeležen različitom fluorescentnom bojom Sekvenciranje većih molekula i čitavih genoma – strategija shotgun sequencing (sekvenciranje nasumično isečenih fragmenata i rekonstrukcija celokupne sekvence na osnovu preklapanja sekvenci)

Konstrukcija probe na osnovu poznate sekvence aminokiselina

Sinteza DNK fragmenta (oligonukleotida) Sinteza probe ili prajmera za PCR reakciju Sinteza in vitro korišćenjem solid phase procedure (prvi nukleotid je vezan za čvrst nosač – silika gel) U zavisnosti od željene sekvence, u reakcionu smešu se dodaje samo jedan odgovarajući nukleotid (hemizam reakcije komplikovan) Između svakog dodavanja vrši se ispiranje nevezanih nukleotida

Umnožavanje DNK (PCR reakcija) Lančana reakcija polimeraze (polymerase chain reaction) Mulis, 1993, Nobelova nagrada dsDNK templet, 2 in vitro sintetisana prajmera, Taq polimeraza (Thermus aquaticus) Ciklus: 90-95°C razdvajanje lanaca 55°C vezivanje prajmera za jednolančane templete 70°C ekstenzija prajmera (sinteza DNK) Ponavljanje ciklusa 25-35 puta

Primena kloniranja u genetici bakterija Dirigovana (site directed) mutageneza Inaktivacija specifičnog gena tehnika cassette mutagenesis)

Molekularna biotehnologija