-rad iz uže specijalizacije- Mentor: prof. dr Svetislav Jelić UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET   Dr Vladimir Vukov   Korelacija odnosa neutrofil/limfocit i ishoda nakon hemioterapije kod metastatskog kolorektalnog karcinoma   -rad iz uže specijalizacije-    Mentor: prof. dr Svetislav Jelić

Odnos neutrofil limfocit – biomarker kancerske inflamacije Inflamacija je ključna komponenta tumorskog mikrookruženja Razvoj i rast tumora nastaje kao rezultat interreakcije između tumora i stromalnog tkiva zajedno sa krvnim sudovima i imunološko/inflamatornim ćelijama domaćina. U sistemske promene koje se detektuju kod pacijenata sa malignim solidnim tumorima spadaju leukocitoza i neutrofilija Ova hematološka stanja su u signifikantnoj korelaciji sa stadijumom bolesti i posledično, lošom prognozom

Odnos neutrofil limfocit – biomarker kancerske inflamacije Kancerom uzrokovana mijeloproliferacija utiče na imuni odgovor organizma, što ima integralan uticaj na tumorogenezu i metastaziranje Kvalitativne promene mijelopoeze posredovane neoplastičnim procesom, dovode do nakupljanja nezrelih mijeloidnih ćeliija koje deluju imunosupresivno Pokazano je kod pacijenata sa metastatskim kolorektalnim karcinomom da je odnos neutrofil/limfocit nezavisan faktor preživljavanja Chua i sar. promovišu odnos neutrofil/limfocit kao potencijalni korisni biomarker sistemskog inflamatornog odgovora u predikciji kliničkog ishoda pacijenata sa metastatskim KRK-om tretiranih prvom linijom hemioterapije Kada se hemioterapijom normalizuje visok neutrofil/limfocit odnos, produžava se preživljavanje

CILJEVI RADA Prikazati apsolutni broj leukocita, kao i relativni broj neutrofila i limfocita pre/posle sistemske hemioterapije (sHT) metastatskog kolorektalnog karcinoma (mKRK-a)   Prikazati uticaj sHT na neutrofil/limfocit odnos (NLR) Pokazati da li postoji razlika u apsolutnom broju leukocita, potom u relativnom broju neutrofila i limfocita, kao i NLR pre/posle sHT mKRK-a među ispitanicima koji su nakon hirurškog lečenja tretirani adjuvantnom hemioterapijom (aHT) i onima koji nisu Pokazati da li postoji odnos između promene NLR pre/posle sHT i ishoda bolesti

MATERIJALI I METODE Prospektivna studija sprovedena je na Službi medikalne onkologije KBC Zemun tokom 2011-2013. godine Studijom su obuhvaćena 46 ispitanika prosečne životne dobi 63±11 (34-82) godina, ženskog pola n=25 (54.3%) i muškog pola n=21 (45.7% Osnovni inkluzioni kriterijum za studiju bilo je postojanje metastatske bolesti karcinoma kolona (mKRK) i mogućnost sprovođenja sistemske hemioterapije (sHT) Ispitanici su podeljeni u dve grupe, a kriterijum je bilo sprovođenje adjuvantne hemioterapije (aHT) nakon hirurškog lečenja Prvoj grupi ispitanika (n=19) primenjena je aHT nakon operativnog lečenja lokalnog i lokalno uznapredovalog KRK. Tokom vremena se kod ovih ispitanika razvila metastatska bolest, te su tretirani sHT Druga grupa (n=27) obuhvatila je ispitanike koji su zbog već postojeće metastatske bolesti odmah tretirani sHT nakon operativnog lečenja Ispitanici su, nakon informisanja o studiji, dobrovoljno pristali na učešće

MATERIJALI I METODE Kod svih studijskih ispitanika, metastatska bolest (stadijum IV/DUKES D) je dijagnostikovana bilo u momentu prezentacije, bilo tokom praćenja (uključujući i tokom primene aHT) Primenjivane su sledeće kombinacije hemioterapijskih agenasa po protokolima za mKRK: FU/FA, FOLFOX, kao i 5-fluorouracil/folna kiselina/irinotekan (FOLFIRI) Ispitanici su tretirani sa 2 (2,2%), 3(2,2%), 4(13,0%), 5 (2,2%), tj. 6 (37%) ciklusa Hemioterapijska kombinacija za metastatsku bolest određivana je u zavisnosti da li se radilo o inicijalnoj hemioterapiji metastatske bolesti ili o prvoj sistemskoj hemioterapiji nakon aHT

MATERIJALI I METODE Procena efekata primenjene sHT mKRK-a vršena je kontrolnim pregledima zahvaćenog/ih organa dostupnim radiološkim metodama (CT pregledi grudnog koša, abdomena i karlice, RTG srca i pluća, EHO abdomena) Ishod nakon poslednjeg ciklusa sHT mKRK-a prema RECIST kriterijumima definisan je kao progresija bolesti (engl. Progression of disease - PD), stabilna bolest (engl. Stable disease -SD), kao i parcijalna remisija (engl. Partial remission - PR)

MATERIJALI I METODE Kod svih ispitanika je određivan apsolutni broj leukocita, apsolutni broj neutrofila i limfocita, kao i odnos broja neutrofila i limfocita (NLR) pre započinjanja sHT i tokom procene terapijskog efekta nakon sprovedenog poslednjeg ciklusa sHT Hematološke analize citoloških parametara su rađene na aparatu COULTER® HmX Hematology Analyzer, proizvođača „Beckman Coulter“, Službe laboratorije KBC Zemun Potom je vrednost odnosa broja neutrofil/limfocit (NLR) dobijena računskim putem

MATERIJALI I METODE Statistička metodologija. U statističkoj obradi podataka korišćene su metode deskriptivne i analitičke statistike. Od metoda deskriptivne statistike korišćeni su relativni brojevi, mere centralne tendencije i mere varijabiliteta. Od mera centralne tendencije korišćena je aritmetička sredina i medijana, a od mera varijabiliteta standardna devijacija, interval i koeficijent varijacije. Od metoda analitičke statistike korišćeni su testovi za procenu značajnosti povezanosti i razlike. Od testova za procenu značajnosti povezanosti korišćen je test jednostruke linearne povezanosti (Pearson) za parametarske, odnosno test korelacije ranga (Spearman) za neparametarske podatke. Za procenu značajnosti razlike korišćen je χ2 test u slučajevima kategorijskih podataka, odnosno u slučajevima intervalnih podataka koji ne slede normalnu distribuciju test sume rangova (Mann-Whitney) za nezavisne uzorke, tj. test ekvivalentnih parova (Wilcoxon) za zavisne uzorke. Za standardizaciju nivoa statističke značajnosti vrednost je bila 0.05, a visoke statističke značajnosti 0.01. U obradi podataka korišćen je statistički paket SPSS for Windows 17.0

REZULTATI Studija je obuhvatila 46 ispitanika, prosečne životne dobi 63±11 (34-82) godine Nije detektovana statistički značajna razlika u pogledu godina života među grupama ispitanika (t=0.689; df=44; p>0.05) Grafik 1. Prikaz distribucije ispitanika prema polu

REZULTATI Grafik br.2. Distribucija primarne lokalizacije KRK-a u ispitivanoj populaciji

REZULTATI Grafik br. 3. Distribucija metastatske bolesti u ispitivanoj populaciji

REZULTATI Grafik br. 4. Distribucija metastatske bolesti prema polu

Histološki stadijum bolesti REZULTATI Tabela br. 7. Distribucija frekvencija ispitanika po Dukesovoj klasifikaciji u grupi pacijenata lečenih adjuvantnom HT Histološki stadijum bolesti n % Dukes B 5 26.3 Dukes C 14 73.7 ∑ 19 100

REZULTATI Tabela br. 8. Protokoli adjuvantne hemioterapije Protokol Adj.HT n % 5FU/LV 16 84.2 FOLFOX 2 10.5 Xeloda 1 5.3 ∑ 19 100

REZULTATI Tabela br. 9. Protokoli sHT u ispitivanoj populaciji Protokol sistemske HT n % 5FU/LV 12 26.1 FOLFOX 32 69.6 FOLFIRI 2 4.3 ∑ 46 100

REZULTATI Grafik br. 4. Prikaz ispitanika po broju ciklusa sistemske hemioterapije

REZULTATI Procena ishoda sistemske HT vršena je nakon poslednjeg ciklusa HT, a definisana je kao progresija bolesti kod 22 (47.8%), stabilna bolest kod 11 (23.9%) i parcijalna regresija kod 13 (28.3%) ispitanika Nije bilo statistički značajne razlike među grupama ispitanika u pogledu ishoda (χ2=1.176; df2; p>0.05)

[X±SD(min-max)(x109ćel./l)] REZULTATI Tabela br. 10. Apsolutni broj leukocita, relaltivni broj neutrofila i limfocita, kao i NLR pre i posle sHT. Varijabla Pre sistemske HT Posle sistemske HT P Apsolutni broj Le [X±SD(min-max)(x109ćel./l)] 7.6±1.8 (4.5-13.0) 7.0±2.1 (3.6-12.0) p>0.05 Relativni broj Neut [X±SD(min-max)(%)] 62±10 (40-85) 62±11 (38-86) Relativni broj Ly [Med(min-max)(%)] 27 (6-50) 28±13 (10-90) NLR [Med(min-max)] 2.25 (0.8-12.5) 2.31 (0.8-9.1)

REZULTATI Tabela br. 11. Hematocitološki podaci i NLR odnos po grupama ispitanika Varijabla Grupa 1 (n=19) Grupa 2 (n=27) Apsolutni broj Le pre sHT [X±SD(min-max)(x109ćel/l)] 7.07±1.74 (4.5-11.0) 7.97±1.76 (5.2-13.0) Relativni broj Neut pre sHT [X±SD(min-max)(%)] 63.1±9.7 (40-85) 62.0±10.5 (44-78) Relativni broj Ly pre sHT [Med(min-max)(%)] 27 (6-50) 28(14-50) NLR pre sHT [Med(min-max)] 2.5 (0.8-12.5) 2.2 (0.8-5.5) Apsolutni broj Le posle sHT [X±SD(min-max)(x 109ćel./l)] 7.11±2.04 (4.2-11.0) 6.99±2.12(3.6-12.0) Relativni broj Neut posle sHT [X±SD(min-max)(%)] 64.9±11.0 (47-86) 60.8±10.5 (38-83) Relativni broj Ly posle sHT 25 (10-90) 30 (10-47) NLR posle sHT 2.6 (1.3-9.1) 2.1 (0.8-8.3)

REZULTATI Tabela br. 12. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po protokolima sHT u grupi 1 Protokol sHT n % 5FU/LV 1 0.19 FOLFOX 16 84.21 FOLFIRI 2 10.53 ∑ 19 100

REZULTATI Tabela br. 15. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po broju ciklusa sHT u grupi 1 Tabela br. 16. Prikaz raspodele učestalosti ispitanika po ishodu nakon sHT u grupi 1 Broj ciklusa sHT n % 2 1 5.3 4 3 15.8 6 15 78.9 ∑ 19 100 Ishod nakon sHT n % PD 10 52.6 SD 3 15.8 PR 6 31.6 ∑ 19 100

REZULTATI Pokazan je statistički značajan uticaj povezanosti promene NLR odnosa pre i posle sHT i ishoda bolesti (ρ=-0.924; p<0.01) u grupi 1 Ni jedan ispitanik sa PD nije imao sniženje NLR nakon sHT, kao što ni jedan ispitanik sa PR nije imao povećanje NLR

REZULTATI Tabela br. 17. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po protokolima sistemske HT u grupi 2 Tabela br. 18. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po broju ciklusa sHT u grupi 2 Protokol sHT n % 5FU/LV 11 40.7 FOLFOX 16 59.3 ∑ 27 100 Broj ciklusa sHT n % 2 1 3.7 4 11.1 6 22 81.5 ∑ 27 100

REZULTATI Tabela br. 19. Prikaz raspodele učestalosti ispitanika po ishodu nakon sHT u grupi 2 Ishod nakon sHT n % PD 12 44.5 SD 8 29.6 PR 7 25.9 ∑ 27 100

REZULTATI Pokazan je statistički značajan uticaj povezanosti promene NLR odnosa pre i posle sHT i ishoda bolesti (ρ=-0.893; p<0.01) u grupi 2 Ni jedan ispitanik sa PD nije imao sniženje NLR nakon sHT, kao što ni jedan ispitanik sa PR nije imao povećanje NLR

REZULTATI Grafik br.5. Raspodela pacijenata po grupama prema ishodu lečenja sHT

REZULTATI Tabela br.20. Sumarne vrednosti promena NLR pre/posle sHT po grupama ispitanika prema ishodu lečenja. ISHOD ∑ NLR pre/posle sHT GRUPA 1 GRUPA 2 PD ∑ NLR pre sHT 2.861 2.626 ∑ NLR posle sHT 4.318 3.868 SD 3.383 2.920 2.350 2.425 PR 4.371 3.701 2.098 1.624

Praćene varijable u odnosu na ishod bolesti REZULTATI Tabela br. 21. Statistička značajnost promena praćenih varijabli pre i posle sHT u odnosu na ishod bolesti kod svih ispitanika Praćene varijable u odnosu na ishod bolesti PD (n=22) SD (n=11) PR (n=13) Aps. broj leukocita pre/posle sHT t= - 2.431 (p<0.05) t= 3.806 (p<0.01) t= 3.008 (p<0.01) Rel. broj neutrofila pre/posle sHT t= - 8.225 (p<0.01) t= 1.749 (N.S) t= 7.214 (p<0.01) Rel. broj limfocita pre/posle sHT Z= - 3.398 (p<0.01) Z= - 2.194 (p<0.05) Z= - 3.183 (p<0.01) NLR pre/posle sHT Z= - 4.107 (p<0.01) Z= - 2.268 (p<0.05) Z= - 3.184 (p<0.01)

REZULTATI Posle evaluacije nakon sprovedene sHT konstatovano je ukupno 22 PD, 13 PR i 11 SD metastatskog oboljenja U odnosu na praćene varijable pokazan je visokostatistički značaj promene NLR odnosa pre/posle sHT i ishoda kod pacijenata koji su postigli progresiju i parcijalnu remisiju metastatskog oboljenja U grupi pacijenata koji su postigli stabilizaciju bolesti promena NLR odnosa u odnosu na ishod bolesti postoji, ali nije visokostatistički značajna

DISKUSIJA Migracija leukocita je jedan od ključnih događaja u inflamatornom odgovoru na tumor. Tumor oslobađa specifične hemokine koji kontrolišu ovu migraciju i funkciju ovih ćelija nakon njihovog dolaska u tumorsku mikrookolinu Sve je veći broj dokaza da kancerogeneza i progresija tumora rezultuju u kvalitativnim i kvantitativnim promenama mijelopoeze Kancerom uzrokovana mijelopoeza karakteriše se nagomilavanjem mijeloidnih ćelija u različitim fazama diferencijacije, što rezultuje supresijom imuniteta domaćina i promociji angiogeneze tumora

DISKUSIJA Mijeloidne ćelije su najbrojnijie hematopoetske ćelije sa jedrom u ljudskom telu i predstavljaju grupe ćelijskih populacija sa različitim funkcijama Tri grupe krajnje diferentovanih mijelodinih ćelija ( makrofagi, dendritične ćelije i granulociti) su esencijalne za normalnu funkciju i urođenog i stečnog imuniteta Tumorska mikrookolina alteriše mijeloidne ćelije i konvertuje ih u potentne imunosupresivne ćelije Ove ćelije se nazivaju mijeloidne izvedene supresorke ćelije (“myeloid-derived supresor cells”- MDSC) , imaju snažan imunosupresivni efekat i potiču iz koštane srži Cirkulišući neutrofili sadrže i luče većinu cirkulišućih faktora rasta za koje se smatra da igraju ključnu ulogu u razvoju tumora

DISKUSIJA Odnos neutrofil/limfocit iz uzorka krvi je identifikovan kao potencijalno koristan marker inflamacije za prognozu ishoda u različitim oboljenjima uključujući kardiovaskularna oboljenja i gastrointestinalne tumore Povišena vrednost cirkulišućih neutrofila vrši nepovoljni efekat na nosioca tumora, na šta ukazuje negativna korelacija između broja cirkulišućih neutrofila I preživljavanja bolesnika NLR se može posmatrati kao ravnoteža između proinflamatornog statusa tumora I antitumorskog imunog statusa domaćina

DISKUSIJA Pacijenti sa povišenim NLR imaju relativnu limfocitopeniju I neutrofiliju, što ukazuje da ukoliko je balans pomeren u korist proinflamatornog odgovora tumora onda je udružen sa lošim onkološkim ishodom NLR se ispituje kao prognostički-prediktivni parametar u različitim tipovima kancera Neutrofil/limfocit odnos kao marker sistemskog zapaljenja nije ispitivan u kontekstu ishoda nakon primenjene sistemske hemioterapije u metastatskoj bolesti KRK-a

ZAKLJUČCI Sprovedena je prospektivna studija na Službi medikalne onkologije KBC Zemun na ispitivanoj populaciji od 46 ispitanika sa mKRK. Kod svih ispitanika je prvobitno sproveden hirurški tretman. Observrane su dve grupe ispitanika prosečne životne dobi 63±11 godina. Kod prve grupe ispitanika (Dukes B i C, n=19), sproveden je tretman aHT. Tokom praćenja, zbog progresije bolesti u mKRK, započet je tretman sHT-om. Kod druge grupe ispitanika (Dukes D, n=27), odmah je započeta sHT. Nakon sprovedene sHT konstatovano je ukupno 22 progresije, 13 parcijalnih remisija i 11 stabilizacija metastatskog oboljenja Nije bilo statistički značajne razlike između opštih karakteristika pacijenata i praćenih hematocitoloških parametara (apsolutni broj leukocita, relativni broj neutrofila i limfocita). Promena NLR odnosa značajno varira sa ishodom bolesti: ispitanici sa PD su imali povećanje NLR, dok ispitanici sa PR su imali sniženje NLR.