ZNAČAJ I DIJAGNOZA MENINGOKOKNE BOLESTI Referentna laboratorija za meningokok i hemofilus Zavod za javno zdravlje Sombor Snežana Delić Davor Čulić

CENTAR ZA MIKROBIOLOGIJU

Neisseria meningitidis striktno humani patogen kolonizuje nazofarinks zdravih individua 10-20% invazivni sojevi - meningitis i/ili septikemija smrtni ishod 5-10 % lečenih ,20% preživelih ozbiljne posledice (gubitak prstiju, neurološki deficit) 500.000 slučajeva godišnje, više od 50.000 smrtnih slučajeva ogroman javno zdravstveni problem Vaccine (Vol.27,Suppl.2, June 2009) 1887 Anton Weichelbaum,Vienn – prvi put izolovao meningokoke kod pacijenata sa meningitisom 1890 Kiefer – izolovao meningokoke kod obelelog od meningitisa i kod kontakta,bitno za razumevanje epidemiolgije ove bolesti

EPIDEMIOLOGIJA “meningitis belt”-sub Saharska Afrika i Azija UK,Novi Zeland,Kuba,Brazil,Norveška ,USA Industrijalizovane zemlje (neepidemijski uslovi): predškolska deca, case/fatality ↑ tinejdžeri serogrupa C, naročito gde predominira ET -37 kompleks 20 % infekcija grupom A, deca do 4 godine, severna hemisfera Grupa C (tinejdžeri) je manje zastupljena kod male dece od B

13 serogrupa:A,B,C,D,H,I,K,L,W135,X,Y,Z,29E Izazivači invazivnih bolesti: A,B,C,W135,Y B - kapsula od sijalinske kiseline (slabo imunogena) Endemski, ”cluster” slučajevi, epidemijski, pandemijski “hiperinvazivni sojevi”- povećana tendencija izazivanja invazivnih oboljenja Virulentni sojevi –polisaharidna kapsula glavni faktor virulencije Nekapsulirani sojevi – u nazofarinksu kod asimptomatskih kliconoša

PATOGENEZA SPEKTAR BOLESTI nazofaringealna kolonizacija - pik od 15-20 godina, sekretorni status, pušenje, socio-ekonomski status invazija kroz nazofaringealni epitel (deficijencija C5-9 ili propredina), infuenza A, druge respiratorne infekcije okultna (benigna) meningokokcemija – retko lokalne infekcije: pneumonija, artritis, oftalmitis, perikarditis septikemija Polmorfizam gena za plazma opsonine koji aktiviraju komplement (mannose-binding lectin) mogu takođe povećati osetljivost na meningokoknu bolest

Meningitis + septikemija – “preklapanje” kliničkih prezentacija Septični šok (oštećenje endotela, kapilarno curenje, i.v. tromboza, abnormalni vaskularni pritisak, miokardne disfunkcije – smanjena sistemska i kutana perfuzija, fokalna tromboza, tkivni edem →MOSF i šok) LPS – endotoksin : primarni medijator Gram-negativne sepse nivo endotoksina korelira sa mortalitetom

Ekcesivna produkcija IL -10 – visok mortalitet LPS – najznačajniji u pokretanju inflamacije (CD14 na makrofagima →TNF-α,IL-1 →IL-6,IL-8,up-regulacija ekspresije adhezivnih molekula ICAM-1 endotelne ćelije→ adherencija neutrofila Antinflamatorni medijatori (IL-4,IL-10) – moduliraju inflamatorni odgovor Ekcesivna produkcija IL -10 – visok mortalitet Polimorfizam TNF-α promoter regiona asociran sa lošom prognozom Inflamatorna citokinska kaskada se zbiva i u subarahnoidalnom prostoru u toku meningitisa Visok nivo u CSF nije asociran sa smrtnim ishodom, nema prelaza u cirklaciju

FAKTORI VIRULENCIJE Polisahardina kapsula - serogrupa OMPs+pili Porini - visoko varijabilni regioni (PorA - serosubtip i PorB - serotip) Faktor H vezujući protein (fHbp potentan Ag) Molekuli uključeni u preuzimanje Fe Endotoksin (LOS-lipooligosaharid) Fazne i Ag varijacije, molekularna mimikrija kapsularni “switching”- beg od imunog odgovora

- izolacija N.meningitidis iz normalno sterilnog mesta (NSS) EU definicija slučaja iz 2006 (European Commision Decision 2002/253/EC,20/03/2002) POTVRĐENI SLUČAJ klinički kompatibilan slučaj dijagnostikovan jednim ili više sledećih laboratorijskih kriterijuma: - izolacija N.meningitidis iz normalno sterilnog mesta (NSS) - detekcija nukleinske kiseline N.meningitidis iz NSS - detekcija Ag N.meningitidis iz NSS - demonstracija Gram – diplokoka iz NSS mikroskopijom

VEROVATAN SLUČAJ Klinički kompatibilan slučaj koji je dijagnostikovan jednim ili više sledećih laboratorijskih kriterijuma -identifikacija N.meningitidis iz nesterilnog mesta -visok nivo meningokoknih At u konvalescentnom serumu Ili Klinička slika kompatibilna sa meningokoknom bolešću (npr.meningitis i /ili meningokokcemija koja može da progredira brzo do purpurae fulminans, šoka i smrti, druge manifestacije su moguće) bez ikakve laboratorijske konfirmacije.

MENINGOKOKNI MENINGITIS – PATOLOšKI NALAZ

KLINIČKI SIMPTOMI

KLINIČKI SIMPTOMI

MATERIJAL ZA DIJAGNOSTIKU Krv :hemokultura: - ručna,bifazna,transizolatni TI medijumi ili automatski sistemi za kontinuirano praćenje –Bactec®,Bact/Alert®. kod visoko kliničkih suspektnih stanja prenošenje hemokultura na II dan “na slepo” iako bočica ne daje signal!!!! Komercijalni sistemi:obratiti pažnju na ↑ SPS poštovati pravila uzimanja i potreban volumen više uzoraka, mala deca 1-3 mL, odrasli 5-10 mL Koncenrtacija meningokoka u krvi nije konstantna u vremenu,zato vise uzoraka SPS –sodium polyanethol sulfonate TI –za prezivljavanje osetljivih bakterija na ambijentalnoj T ,cak i u tropskim uslovima za duze vreme

MATERIJAL ZA DIJAGNOSTIKU Likvor: obrada, zasejavanje podloga ili u komercijalne bočice za hemokulturu posle i.v.AB Th meningokoke ostaju duže vijabilne u likvoru Sobna T i što brži transport u laboratoriju! Bris ždrela i nazofarinksa, screeping ili aspirat kožnih lezija, zglobni aspirat, konjunktiva, sputum, sadržaj srednjeg uha...

OBRADA MATERIJALA Komora za bezbedan rad (BSL II) Ako nema komore, OBAVEZNA ZAŠTITA OSOBLJA (rukavice,maske,naočare) paziti na rizične tačke obrade: centrifugiranje, prosipanje i lomljenje tečne kulture –NAJOPASNIJE!!! BIOINCIDENT - obavezna pisana i vidljiva procedura u slučaju bioincidenta u laboratoriji: svi napuštaju prostoriju, otvaranje prozora, ne ulazi se u narednih 6 časova. Hemoprofilaksa prema uputstvu (ciprofloksacin)

DIJAGNOZA-LABORATORIJSKA podloga:čokoladni agar-neselektivne (selektivne-VCN 10 mL/L agara, sa SXT) uslovi inkubacije: 35-37 °C ,5% CO2 minimum testova u laboratoriji: Gram, oksidaza, katalaza, superoxol test, ONPG (gly +,mal+,lac), colistin R, boja kolonija, osetljivost na PEN *Pen R ?? – proveriti identifikaciju !!!

VAKCINE Efektivne vakcine postoje za A,C,W135 i Y B- kapsularni polisaharid slabo imunogen (sličnost sa glikozil reziduama prisutnim na ćelijskim proteinima, na neuralnim ćelijama NCAM) autoimunost! Vakcina za grupu B bazira se na proteinskim Ag na površini ćelije Prva: OMVs (outer membrane vesicles), efektivna za specifične izolate i prekidanje “klonalnih” izbijanja OMVs –deterdžentom ekstrahovane vesikule outer membrane

“REVERZNA VAKCINOLOGIJA" Sekvencioniranje genoma za delove koji kodiraju površinske ćelijske proteine→produkcija proteina u ekspresionom sistemu→testiranje njegove imunogenosti Prepoznavanje novih kandidata za vakcinu -major outer membrane protein -proteini uključeni u preuzimanje Fe -adhezini -faktor H vezujući protein (fHbp), NspA, enzimi, Ag uključeni u membransku arhitekturu

PRIRODNA IMUNOST SBA (serum bactericidal antibody) CENTRALNA ULOGA Merenje SBA u prisustvu humanog komplementa je najbolji biomarker protektivne imunosti Virulentni meningokoke se ređe nalaze u zdravih kliconoša→protektivna At su stečena izlaganjem nevirulentnim meningokokama ili enteričnim bakterijama (cross reaktivnost karbohidratnog Ag E.coli sa meningokoknim kapsularnim PS)

HUMORALNA IMUNOST Bez tretmana smrtnost do 80% Antitela: - opsonizirajuća - direktno baketricidna u prisustvu komplementa 1960 (Goldschneider):obrnuti odnos incidence meningokokne bolesti i starosti, prevalence SBA u odnosu na serotipove A,B i C Najviša frekvencija bolesti od 4m -18 meseci života UK (Troter,1996-1999)- 86,6% dece od 6m do 2 god. nema SBA titar na grupu C 75% (15-24 god.) nema SBA titar na grupu C

VAKCINE MEN C -konjugovana UK,1999 god Rutinska vakcinacija A,C,Y,W - konjugovana UK,1999 god Rutinska vakcinacija Dramatičan pad bolesti izazvane grupom C Rutinski, deca 11-12 god.(US ,2005) Osobe sa povećanim rizikom 11-55 godina

VAKCINA ZA GRUPU B (OMV) Novi Zeland (4 OMV),Norveška (9 OMV), Kuba. Efikasnost i imunogenost usmerena na sojeve od kojih je OMV pripremana ili na blisko vezane sojeve sa homologim porA proteinom Deca >4 god. - efikasnost 74% SBA sa humanim komplementom je adekvatan indikator efektivnog protektivnog imuniteta protiv grupe B,čak iako imuni odgovor nije upravljen direktno protiv kapsularnog polisaharidnog Ag.

KONJUGOVANA vs POLISAHARIDNA OSOBINE POLISAHARIDNA KONJUGOVANA T –ćelijski zavisan imuni odgovor NE DA Imunska memorija Odsustvo hipo-respondera Booster efekat Perzistencija zaštite Grupni imunitet Redukcija kliconoštva

MenA ConjugateVaccine MenC ConjugateVaccine Serum Institute(pipeline) Company / Vaccine MenA ConjugateVaccine MenC ConjugateVaccine Men ACYW135 conjugate vaccine   Others Serum Institute(pipeline) √ JN international AC vaccine GSK Hib-MenCVaccine Baxter Chiron MenB vaccine Sanofi Pasture Transgene biotecK ABCYWZ vaccine Aventis Pasture Biomed Bio-Manguinhos

Hemoprofilaksa za bliske kontakte lek doza komentar CIPROFLOXACIN Odrasli > 18 godina 1x500 mg PO Kontraindikovan tokom trudnoće i laktacije,pogodan za osobe >18 g.Ne preporučuje se u pretpubertetu RIFAMPIN Odrasli : 600 mg PO q12 h x 4 doze Deca >1 mesec: 10mg/kg(max 600 mg)per dose PO q12h x4 doze Odojčad <1 mesec: 5mg/kg per dose PO q12h x 4 doze Kontraindikovan u trudnoći.Urin , suze i meka kontaktna sočiva mogu biti crveno obojeni.Redukuje efektivnost oralnih kontraceptiva. CEFTRIAXON 250 mg IM x 1 doza Deca < 12 god 125 mg IM x 1 doza Preporučuje se kod trudnica. Alternativa kod osoba koji ne tolerišu oralne lekove. Rastvoriti sa 1% lidokainom –redukcija bola na mestu injekcije.

Izveštaj o zaraznim bolestima u 2008 godini na teritoriji Republike Srbije 2004 2005 2006 2007 2008 Morbus meningococcica Oboleli (Cen.Srbija +Vojvodina) 37 (26+11) 46 (37+9) 43 (32+11) 14 (12+2) 4 (3+1) Inc/100.000 0,49 0,61 0,57 0,19 0,05 Meningitis bacterialis 274 295 203 197 180 3,65 3,93 2,7 2,65 2,43

NADZOR NAD MENINGOKOKNOM BOLEŠĆU www.neisseria.org www.EUIBIS.org www.emgm.eu ,EMGM -European Monitoring Group for Meningococci www.meningitis.org Meningitis Research Foundation www.patient.co.uk

JAVNO ZDRAVSTVENI ZNAČAJ MENINGOKOKNE BOLESTI NADZOR: -klinička i laboratorijska prijava regonalnom ZZJZ →IZJZ Srbije - obavezno slanje izolata u Referentnu laboratoriju (subkultivacija, rečekiranje izolata, identifikacija komercijalnim sistemom, serogrupisanje, disk difuzija, MIC-ovi, dugotrajno čuvanje izolata u nacionalnoj kolekciji sojeva) RL:za sada molekularna tipizacija i sekvencioniranje u National Centre of Epidemiology “Johan Bela”, Mađarska i Grac, Austrija. RL →EU-IBIS - European Invasive Bacterial Infections Surveillance Network budućnost?????

Referentna laboratorija za meningokok i hemofilus - Sombor

primarna obrada izolata slanje izolata u RL a) kultivabilni izolat na bris (Amies) i/ili čokoladni agar b) u slučaju sumnje na bakterijski meningitis (bez izolata) – uzorkovanje krvi i/ili CST c) slanje izolata (uputnica za Nm) primarna obrada izolata zasejavanje na čokoladni agar inkubacija na 35±2°C, 5%CO2, 20-24sata identifikacioni sistemi-BBL N/H, Api N/H oksidaza, katalaza, superoksol test, colistin serogrupa – aglutinacija komercijalnim test serumima disk difuzija MIC sekundarna obrada izolata PCR – reakcija lančane polimeraze

primarna obrada izolata identifikacioni sistemi-BBL, Api oksidaza, katalaza, superoksol test serogrupa – aglutinacija komercijalnim test serumima disk difuzija MIC-ovi

Minimalne QC preporuke Streptococcus pneimoniae ATCC 49619 na 5%CO2 za disk difuziju, sem što se azithromycin QC test inkubira u redovnim uslovima. Escherichia coli ATCC 25922 (inkubacija ili u redovnim uslovima ili na 5%CO2) za testiranje ciprofoxacina, nalidiksne kiseline, minocyclina i sulfisoxazola

tipizacija soja N. meningitidis serotipizacija genotipizacija (MLST) http://pubmlst.org – mlst baza podataka prokariota i eukariota serogrupa, serotip, serosubtip, sekvence type (clonal complex) B:2a:P1.2:F5-1: ST-33(cc32) B:P1.19,15:F5-1:ST-33(cc32) - preporuka

serotipizacija i genotipizacija B:(2a):P1.5-2,10-1:F5-1:ST-33(cc32) serogrupa – aglutinacija, serotip (por B) – pomoćno sredstvo u tipizaciji por A (VR1-135pept.sekvenci u 10 familija,VR2-375/18,VR3), fet A (VR1-186)– serosubtip i šta kodiraju ti geni (peptidne sekvence na osnovu prethodno izvršenog nukleotidnog sekvenciranja organizovane u brojne familije i subfamilije); npr. P1.5-2,10-1:F5-1 (slovo prati oznaka familije a zatim subfamilije) genotipizacija (MLST)- određivanjem nukleotidnih sekvenci internih fragmenata 7 housekeeping gena dobija se ST profil koji se ubraja u neki od postojećih cc

genotipizacija MLST-MultiLocus Sequence Type 7 housekeeping gena: abcZ (putative ABC transporter) adk (adenylate kinase) aroE (shikimate dehydrogenase) gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase) mtg (monofunctional peptidoglycan transglycosylase) pdhC (pyruvate dehydrogenase subunit) pgm (phosphoglucomutase) pilA (regulator of pilin synthesis) pip (proline imino-peptidase) ppk (polyphosphate kinase) serC (3-phosphoserine aminotransferase) dobijene sekvence genskih fragmenata se upoređuju sa postojećom bazom podataka, a izolati sa identičnim sekvencama se pripisuju istom alelnom broju >abcZ1 TTTGATACTGTTGCCGAAGGTTTGGGCGAAATTCGCGATTTATTGCGCCGTTATCATCATGTCAGCCATGAGTTGGAAAATGGTTCGAGTGAGGCCTTATTGAAAGAGCTCAACGAATTGCAACTTGAGATCGAAGCGAAGGACGGCTGGAAGTTGGATGCGGCGGTGAAGCAGACTTTGGGCGAACTCGGTTTGCCGGAAAACGAAAAAATCGGCAACCTCTCCGGCGGTCAGAAAAAGCGCGTCGCCTTGGCGCAGGCTTGGGTGCAGAAGCCCGACGTATTGCTGCTCGATGAACCGACCAACCATTTGGACATCGACGCGATTATTTGGTTGGAAAACCTGCTCAAAGCGTTTGAAGGCAGCCTGGTTGTGATTACCCACGACCGCCGTTTTTTGGACAATATCGCCACGCGGATTGTCGAACTCGATC >abcZ2 TTTGATACCGTTGCCGAAGGTTTGGGTGAAATTCGCGATTTATTGCGCCGTTACCACCGCGTCGGCCATGAGTTGGAAAACGGTTCGGGTGAGGCTTTGTTGAAAGAACTCAACGAATTACAACTTGAAATCGAAGCGAAGGACGGCTGGAAGCTGGATGCGGCAGTCAAGCAGACTTTGGGGGAACTCGGTTTGCCGGAAAACGAAAAAATCGGCAACCTTTCCGGCGGTCAGAAAAAGCGTGTCGCCTTGGCGCAGGCTTGGGTGCAGAAGCCCGACGTATTGCTGCTGGACGAACCGACCAACCATTTGGATATCGACGCGATTATTTGGCTGGAAAATCTGCTCAAAGCGTTTGAAGGCAGCTTGGTTGTGATTACCCACGACCGCCGTTTTTTGGACAATATCGCCACGCGGATTGTCGAACTCGATC……. za svaki soj, alelna kombinacija brojeva za datih 7 lokusa definiše multilokusni tip sekvence (ST) koji se zatim dodeljuje nekom od klonalnih kompleksa (cc) ST abcZ adk aroE fumC gdh pdhC pgm clonal_complex 7 8 10 19 10 1 2 ST-18 complex 7 8 10 19 8 1 2 ST-18 complex 6 8 10 17 10 1 2 ST-18 complex 1 5 1 1 2 16 17 11 5 18 8 11 24 21 ST-22 complex

šta mi možemo da radimo 2009. godina - sojevi iz tabele imaju rezistenciju na SXT, dok su senzitivni na ostale antibiotike uključujući i Penicillin što je od izuzetne važnosti u lečenju pacijenata u 2010. godini je do sada prikupljeno dva soja od kojih jedan soj nije N. meningitidis posle obrade izolata sojevi se zamrzavaju na -80 °C i čuvaju u nacionalnoj kolekciji sojeva

šta mi možemo da uradimo standardni PCR (2 gena)-in house protokol ctrA gen (1176bp) - (capsule transport gene) specijes specifični gen sod C gen (561bp) - (superoxid dismutase) usko specifični isključivo za N. meningitidis; olakšava detekciju soja kod neinvazivnih tj. najčešće nekapsuliranih sojeva por A gen (1179bp) - (outer membrane protein) radi dalje serosubtipizacije upotreba komercijalnih multipleks PCR panela za brzu detekciju bakterijskih uzročnika meningitisa od N. meningitidis, St. pneumoniae, Hib... napomena: slanje u druge referentne laboratorije radi genotipizacije

šta bismo želeli da radimo HVALA NA PAžNJI!!! www.zzjzsombor.org