CHƯƠNG 5 QÚA TRÌNH PHIÊN MÃ

1. Đặc điểm Sự phiên mã tạo ra phân tử ARN bổ sung với một sợi AND Enzym tham gia vào quá trình phiên mã: ARN polymerase, dịch chuyển từng bước dọc theo ADN khuôn và kéo dài chuỗi ARN theo hướng từ 5’-> 3’ Sự phiên mã chỉ sao chép chọn lọc một số phần của genome -> đơn vị phiên mã: gồm một hoặc nhiều gen, có những trình tự ADN đặc hiệu để khởi đầu (promoter) và kết thúc phiên mã. Chỉ một trong hai sợi đơn của phân tử ADN được dùng làm khuôn Sự phiên mã được khởi phát không cần mồi: ARN polymerase có thể khởi đầu sự tổng hợp ARN trên khuôn mẫu ADN

Đơn vị phiên mã

2. Quá trình phiên mã ở tế bào Prokaryota 2.1. Các yếu tố tham gia: AND khuôn (gen) NTP: 4 loại (ATP, GTP, CTP, UTP) RNA polymease: Chỉ có 1 loại ARN polymease t.hợp cả 3 loại ARN: mARN, rARN, tARN Có 5 tiểu đơn vị: β’, β, σ, α và ω. β’+ β + α + ω -> lõi: cần thiết cho hoạt động của polymease. Lõi+σ -> holoenzym. σ: giúp ARN pol nhận biết và liên kết đặc thù với promoter ở -10 và -35 Cấu trúc của enzyme ARN polymease

2.2. Diễn biến: a. Khởi đầu RNA pol+σ -> holoenzym -> gắn vào Promoter RNA poly: nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự hộp -35 Hộp -10 tháo xoắn dần-> sợi đơn DNA “mở" dưới dạng tự do, làm khuôn để sinh tổng hợp RNA 2 NTP đầu tiên mang đến vị trí bắt đầu được hoạt hóachúng xếp hàng trên khuôn và lk với nhau bằng lk phosphodiester nhờ enzyme RNA polymerase -> đầu 5’ của mRNA được giải phóng.

Giai đoạn khởi đầu

b. Kéo dài Sau khi tổng hợp được 10Nu-> σ tách khỏi RNA polymerase. RNA polymerase di chuyển dọc sợi DNA khuôn để kéo dài chuỗi RNA. Enzyme chuyển dịch trên khuôn: mở xoắn phía trước và tái xoắn phía sau  rN nối tiếp, duy trì vùng mở xoắn khoảng 17 bp Sợi RNA mới sẽ tách dần khỏi mạch khuôn DNA

Quá trình tổng hợp mARN

c. Kết thúc Sự tổng hợp RNA tiếp tục cho đến khi polymerase gặp một tín hiệu kết thúc. Tại điểm kết thúc phiên mã, RNA được giải phóng khỏi polymerase, và enzyme dời khỏi khuôn DNA -> Kết thúc quá trình phiên mã

c. Kết thúc Kết thúc phiên mã do hình thành cấu trúc kẹp tóc Điểm kết thúc là những trình tự đặc biệt gồm Hai trình tự đối xứng giàu GC và bổ sung cho nhau  tạo cấu trúc kẹp tóc  phá vỡ phức hợp kéo dài, mở kênh thoát cho RNA khỏi phức hợp hoặc phá vỡ liên kết giữa RNA với khuôn mẫu DNA. Cuối là 8 A  liên kết A – U (liên kết yếu giữa khuôn DNA và RNA)  RNA tách khỏi khuôn DNA, kết thúc phiên mã. Cấu trúc hình kẹp tóc

Kết thúc phiên mã do hình thành cấu trúc kẹp tóc

c. Kết thúc Kết thúc phiên mã nhờ yếu tố Rho Rho là protein hình nhẫn, gồm 5 tiểu đơn vị giống nhau Rho chịu trách nhiệm dừng phản ứng tại những vị trí đặc hiệu: có cấu trúc kẹp tóc nhưng sau đó không có chuỗi poly A - Rho có hoạt tính helicaza, làm cắt đứt liên kết giữa AND và ARN làm dừng phản ứng tổng hợp ARN.

Các giai đoạn của quá trình phiên mã Mở đầu Kéo dài Kết thúc

2. Quá trình phiên mã ở Eucaryota 2.1. Đặc điểm: Emzym RNA polymease: 3 loại, mỗi loại tham gia phiên mã tạo các RNA khác nhau Hoạt động cùng các yếu tố phiên mã Loại RNA Polymease Sản phẩm Vị trí RNA Polymerase I rRNA nucleolus RNA Polymerase II mRNA nucleoplasm RNA Polymerase III tRNA

Các yếu tố phiên mã (TF) 3 nhóm: Các factor kết hợp cùng ARN polymerase tạo phức nhận biết vị trí đầu tiên để phiên mã Các factor bám vào vùng ADN điều khiển nằm trước vị trí đầu tiên được phiên mã. Các factor làm nhiệm vụ điều khiển quá trình phiên mã.

2.2. Các giai đoạn: a. Khởi đầu Có sự tham gia của nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã: TFIID nhận biết và gắn vào trình tự TATAAAA (-25) trên promoter nhờ tiểu đơn vị TBP TFIIA gắn vào tạo phức hợp TFIID-TFIIA RNA polymerase liên kết với TFIIB và gắn vào phức hợp TFIID-TFIIA 1ATP thủy phân giải phóng năng lượng -> tách sợi DNA kép thành 2 sợi đơn (trạng thái mở) TFIIE cho phép khởi động phiên mã.

b. Giai đoạn kéo dài Được tiến hành bởi enzim ARN pol II với sự tham gia của nhân tố TFIIS ARN pol II đính từng nu một vào đầu OH của C3’ của đường ribose và chuỗi mRNA sẽ kéo dài từ đầu 5’ - > 3’

c. Kết thúc Phản ứng được dừng lại sau khi ARN polymerase vượt qua vị trí đặc biệt AATAAA (polyA: 0,5 - 2kb) mARN lúc này là mARN chưa hoàn thiện, cần có quá trình hoàn thiện trước khi ra tế bào chất để tham gia dịch mã.

2.4. Quá trình hoàn thiện mRNA Biến đổi tiền mARN thành mARN hoạt động, thực hiện ở trong nhân. Các bước: Gắn mũ 7-methylguanosine, gắn đuôi polyA, cắt nối intron-exon

a. Gắn mũ Xảy ra ngay sau khi bắt đầu phiên mã được khoảng 25Nu Mũ m7G (7-methylguanosine) được gắn vào đầu 5’ của phân tử mARN Vai trò: Giúp Rbx nhận biết mARN trong quá trình dịch mã. Bảo vệ đầu 5’ của mARN không bị phân cắt.

b. Gắn đuôi polyA Khi RNA pol II di chuyển đến cuối gengặp trình tự đặc hiệu (PolA)Enzyme CPSF + CstF đến gắn vào đoạn RNA này hút các protein khác tập trung tại đây: Enzym polymerase (PAP) gắn 200 - 250 A vào đầu 3’ Poly A Enzym RNA pol tiếp tục tổng hợp thêm 1 đoạn nucleotide (10-200N)  enzim rời khỏi khuôn, đoạn RNA tổng hợp thêm sẽ bị phân giải Vai trò: Ổn định các mARN và tham gia vào quá trình vận chuyển mARN từ trong nhân ra tế bào chất.

c. Quá trình cắt nối: loại bỏ intron, nối exon Thực hiện nhờ phức hệ spliceosome: snRNA + Protein Intron có 3 vị trí quan trọng: vị trí cắt nối đầu 5’ và đầu 3’. Vị trí phân nhánh gần đầu 3’(giàu GC và có A ở trung tâm). Bước 1: ARNm được cắt chính xác tại điểm nối giữa exon 1 và đầu 5’ của intron (↓GT intron) Bước 2: Hình thành nên liên kết 5’-> 2’ phosphodiester giữa vị trí 5’ của G tại điểm cắt với nu A bảo thủ nằm gần đầu 3’ trong intron tạo cấu trúc “thòng lọng”. Bước 3: Điểm nối giữa exon 2 và đầu 3’ của intron được cắt rời, Intron được loại ra 2 exon nối lại với nhau bằng lk phosphodiester, dạng thòng lọng được giải phóng ra Quá trình cắt nối theo đúng trật tự từ đầu 5’-3’ tạo thành phân tử mARN hoàn thiện. ->Từ 1 mRNA tiền thân có thể tạo ra nhiều mRNA hoàn thiện

Quá trình cắt nối: loại bỏ intron, nối exon

Quá trình dịch mã (Tổng hợp Protein) Chương 6. Quá trình dịch mã (Tổng hợp Protein)

1. VAI TRÒ CỦA CÁC LOẠI ARN TRONG TỔNG HỢP PROTEIN 1. 1 1. VAI TRÒ CỦA CÁC LOẠI ARN TRONG TỔNG HỢP PROTEIN 1.1. mRNA và mã di truyền Mỗi mARN mang thông tin di truyền quy định trình tự của mỗi polypeptit. Cấu trúc mARN: Đoạn dẫn đầu 5’ – UTR: không mã hoá Khung đọc mở:  1 bộ ba mở đầu 5’- AUG các bộ ba mã hoá aa 1 bộ ba kết thúc: UAG hoặc UGA hoặc UAA Đoạn theo sau: 3’ – UTR : không mã hoá

Cấu trúc của mARN

Mã di truyền: Tổ hợp 3 nucleotit qui định cho một aa -> mã bộ ba (codon) 4 loại Nucleotit -> 64 bộ ba: 61 mã ứng với 20 axit amin, 3 mã kết thúc (UAA, UGA, UAG). Đặc điểm của mã di truyền: Là mã bộ ba Có tính đặc hiệu Có tính phổ biến Có tính thoái hoá

1.2. tRNA tRNA vận chuyển aa đến chuỗi polypeptide đang kéo dài trong quá trình dịch mã. Đầu 3’ mang aa. Lá giữa có anticodon: khớp với codon trên mRNA theo NTBS Thực hiện chức năng nhờ enzyme đặc biệt: aminoacyl- tRNA synthetase, có 20 loại enzyme, tương ứng với 20 amino acid.

1.3. rRNA Ribosome: rRNA + Pr: là một thành phần quan trọng trong bộ máy dịch mã. Mang 3 vị trí tương tác với tRNA và một vị trí với mRNA A: tiếp nhận tRNA mang aa mới P: giữ tRNA mang chuỗi polypeptit đang được tổng hợp E: liên kết với tRNA đã chuyển giao aa, chuẩn bị ra khỏi phức hợp dịch mã.

2. Quá trình dịch mã 2.1. Hoạt hóa axit amin: mỗi aa được gắn vào tARN thích hợp nhờ một enzyme aminoacyl- tARN synthetase đặc thù. Quá trình xảy ra như sau: Các aa được cung cấp năng lượng từ ATP trở thành aa hoạt hoá. aa hoạt hoá dưới xúc tác của enzim gắn vào tARN, tạo thành phức hợp tARN-aminoacyl. 2.2. Quá trình dịch mã: Giai đoạn khởi động Giai đoạn kéo dài Giai đoạn kết thúc

2. Quá trình dịch mã a. Khởi động (tiếp) Tham gia của nhiều nhân tố khởi động (Initiation factor – IF) Bắt đầu tổng hợp từ codon AUG (mã hóa Met) nằm trên mRNA Có 2 loại tRNA: tRNAMet: kết hợp với AUG nằm giữa mRNA. tRNAiMet: kết hợp với AUG khởi đầu, gắn Met đầu tiên vào chuỗi polypeptit Các bước: Tiểu phần Rbs nhỏ bám vào mRNA: lk bổ sung giữa rRNA16S với TT đầu 5’UTR của mRNA (Shine-Dalgarno ở SV Prokaryota) -> dò tìm mã khởi đầu (AUG) Met – tRNAiMet mang Met đến, Anticodon của Met-ARNtimet bắt cặp với AUG Tiểu phần lớn kết hợp với tiểu phần nhỏ-> Met-tRNAiMet bọc lấy vị trí P (thủy phân 1 GTP) -> Sự dịch mã bắt đầu.

Khởi động dịch mã ở SV Prokaryota Met đầu tiên bị khóa (formyl-Met) Quá trình hình thành phức hợp khởi đầu sự tham gia của 3 nhân tố 3 nhân tố khởi động là: IF-1, IF-2 và IF-3 và GTP để cung cấp năng lượng. Tiểu phần Rbs nhỏ gắn vào mARN nhờ tương tác cặp bổ sung giữa trình tự bazơ gần đầu 3’ của 16S rRNA với trình tự bazơ ở đoạn 5’UTR của mRNA phía trước mã khởi đầu AUG (TT Shine-Dalgarno) để dò tìm mã khởi đầu. TT Shine-Dalgarno(S-D): nằm ở đầu 5’-UTR, có TT đặc thù giàu Purin, khoảng 6-8bp: AGGAGGU Sự tương tác giữa yếu tố Shine-Dalgarno của một mRNA và đoạn trình tự tương ứng ở đầu 3' của rRNA 16S

Khởi đầu dịch mã ở SV Eukaryota Met đầu tiên không bị khóa mRNA của SV nhân chuẩn không có vị trí liên kết Rbs. Thay vào đó là cấu trúc mũ Cap ở đầu 5’. Protein gắn mũ (một trong những tiểu đơn vị của eIF4) liên kết với mũ của mRNA Nhân tố eIF2 liên kết với codon khởi đầu Met-tRNA, nhân tố eIF3 liên kết với tiểu phần nhỏ của ribosome (40S) và nhân tố eIF4 liên kết với mRNA (thông qua protein bám mũ). -> Lắp ráp tạo thành phức khởi đầu. Tiểu đơn vị 40S di chuyển dọc theo mRNA từ đầu 5’ cho đến khi tìm thấy codon mở đầu (QT rà soát (quét)). Xungg quanh codon khởi đầu AUG có TT bảo thủ (GCCRCCAUGG (R=A hoặc =G)). Nếu trình tự xung quanh của nó khác quá xa trình tự bảo thủ thì 1 AUG có thể bị bỏ qua. Khi một AUG phù hợp đã được định vị, eIF5 cần thiết để cho phép các tiểu phần 60S tham gia vào và cho eIF2 và eIF3 rời đi.

Khởi đầu dịch mã ở Eukaryota

Giai đoạn khởi đầu

b. Kéo dài Sau khi Met được đặt vào vị trí P, chuỗi polypeptit bắt đầu được tổng hợp (kéo dài). Mang tính lặp lại, cần các factor kéo dài (EF) Các bước: Bước 1: Phức aminocyl-ARNt mới tương tác với vị trí A: 3 Nu của anticodon trên tARN tạo cặp bổ sung với 3 Nu của codon trên phân tử mARN. Bước 2: Hình thành cầu nối peptít: aa đã được gắn tARN ở vị trí P được tách ra và gắn với aa trên tARN ở vị trí A = liên kết peptit: hình thành giữa nhóm cacboxyl của aa ở vị trí P với nhóm amin của aa ở vị trí A nhờ enzim peptydyl transferase. Bước 3: Sự chuyển dịch: mRNA chuyển dịch -> tARN ở vị trí P chuyển đến vị trí E và tARN ở vị trí A chuyển đến vị trí P và vị trí A sẵn sàng tiếp nhận một aminoacyl – tARN mới. Cần sự tham gia của EF-G có hoạt tính thủy phân GTP. Quá trình này được lặp lại cho đến khi gặp phải dấu hiệu kết thúc dịch mã

c. Kết thúc Ribosome chuyển dịch trên phân tử mARN liên tục -> chuỗi polypeptide được kéo dài Khi gặp codon kết thúc ở vị trí A (được nhận biết bởi các yếu tố giải phóng –RF) Phức hợp peptidyl-ARNt tách ra làm đôi: phân tử ARNt tự do và chuỗi polypeptit hoàn chỉnh. Ribosome rời khỏi ARNm, tách đôi thành 2 tiểu đơn vị sẵn sàng cho cho một chu kỳ dịch mã mới.

So sánh quá trình dịch mã ở sinh vật Prokaryota và Eukaryota mARN đa cistron mARN đơn cistron Phiên mã và dịch mã đồng thời Phiên mã và dịch mã không đồng thời Không có mũ Cap ở đầu 5’ của mARN Có mũ Cap ở đầu 5’ của mARN Codon khởi đầu nằm ngay sau vị trí gắn Rbs Không có vị trí gắn Rbs ở trước mã khởi đầu AUG aa đầu tiên là formyl -Met aa đầu tiên không bị cải biến Rbs 30S: 16S rARN + 21 Pr Rbs 40S: 18S rARN + 33 Pr Rbs 50S: 23S, 5S rARN + 31 Pr Rbs 60S: 28S, 5.8 S. 5S rARN +49Pr Nhân tố khởi đầu: IF1, IF2. IF3 Nhân tố khởi đầu: eIF1, eIF2,Eif3… Nhân tố kéo dài: EF-Tu, EF-G Nhân tố kéo dài: eEF1, eEF2

4. Cải biến sau dịch mã Pr sau dịch mã được biến đổi tiếp để trở thành dạng hoạt động. Ở VK:loại bỏ gốc formyl của Pr. Loại bỏ một vài aa đầu tiên nhờ enzyme amino peptidase. Gắn thêm đường vào Pr (giúp định hướng di chuyển và hđ của Pr). Gắn gốc phosphat vào Pr bởi enzyme kinase. Hình thành các liên kết disulphate (S - S) giữa các polypeptide tạo thành một Pr phức hoặc enzyme phức hoạt động. Cắt bỏ một đoạn polypeptide: Loại bỏ peptide di chuyển Loại bỏ trình tự tín hiệu của protein giúp chúng tiến vào mạng lưới nội chất hạt (ER) Cắt bỏ polypeptide để tăng hoạt tính của enzyme.