Tumorska imunologija i animalni modeli

Tumorska imunologija Imunski sistem prepoznaje i eliminiše antigene. Da li su tumori antigeni? Ili: – Da li tumor prepoznaje fiziološku funkciju imunskog sistema? – Može li se stimulisati imunski sistem da spreči nastanak i/ili odbacivanje tumora?

Imunski sistem i tumori Rezultati morfofunkcionalnih studija na imunokompetentnim i jedinkama sa smanjenim imunskim odgovorom Fagociti Fagocitoza tumorskih ćelija, prezentacija antigena, antitelima posredovana ćelijska citotoksičnost (ADCC). Mijeloidna populacija sa imunosupresivnom aktivnošću favorizuje rast tumora Dendritske ćelije Prezentacija antigena NK ćelije Aktivne u borbi protiv cirkulišućih tumorskih ćelija i protiv lokalnih tumora T ćelije Obe podklase i pomoćničke i citotoksični T limfociti su veoma važni. Imunska memorija. Regulatorne T ćelije favorizuju tumore B ćelije, antitela, komplement Nisu relevantni ili povećavaju rast tumora (ali su odlični u terapiji)

Broj početnog tumora je mnogo veći nego broj tumora u makroskopski, klinički dokaznoj masi Smanjenje do aktuelnog nivoa je ostvareno delovanjem imunskog sistema, posebno ćelijskim imunitetom Tumori koji ostvare makroskopske dimenzije uspevaju da zaobiđu odbrambene mehanizme organizma Predviđanja Visoka incidencija tumora kod organizama sa smanjenim imunskim odgovorom “immunodepressed” Imunoselekcija spontanih tumora koji se kasnije javljaju zato je i niska imunogenost

procedura za identifikaciju gena koji kodiraju tumor specifične transplantacione antigene (TSTA). Većina TSTA može biti detektovana i uklonjena samo ćelijski-posredovanim odbacivanjem

Imunizacija – stimulacija imunskog odgovora tumorskim antigenima Imunogenost tumora Imunizacija – stimulacija imunskog odgovora tumorskim antigenima

Animalni modeli Životinje sa tumorom bilo istim ili sličnim bolesti kod ljudi. Animalni modeli se koriste za proučavanje razvoja i napredovanja bolesti i za testiranje novih terapeutika pre nego se upotrebe kod ljudi. Životinje sa transplantiranim humanim tumorima ili drugim tkivima nazivaju se ksenograft modeli Animalni modeli – su neinformativni zato što se ne dobijaju prediktivni rezultati za ljude Tumorski imunolozi treba da obezbede da oni najviše moguće imitiraju tumore ljudi za koje se terapija ili vakcine pripremaju

Animalni modeli PITANJA Da li je početak razvoja tumora komparabilan sa onim kod ljudi? Da li je slična progresija tumora i stupnjevi? Da li je patologija animalnih tumora slična onoj kod ljudi? Da li je uvećanje tumorske mase komparabilno? Da li je hormonska responsivnost slična? Ako je terapija koja se testira dizajnirana za lečenje metastatske bolesti u postoperativnom oporavku, da li su animalni modeli odgovarajući? Ako ciljani pacijenti imaju tumorom indukovanu imunosupresiju da li je animalni model na odgovarajući načim imunosuprimiran? Ako su ciljani pacijenti imunokompromitovani zbog godina, da li animalni model pokazuje sličan imunski deficit?

Modeli tumora koji se mogu transplantirati Modeli za testiranje imunoterapije i anti-kancer vakcina SV40-driven transgeni modeli Organ-specifični onkogen-driven transgeni modeli Tumor-supresor-gen knockout modeli Modeli Cre-lox uslovne ekspresije Transgeni miševi koji eksprimiraju humane tumorske antigene Gene-targeted (knockout) miševi

Lignées cellulaires tumorales Senzitivnost leka Proučavanje gentske i hromozomske nestabilnosti Proučavanje tumorigenih puteva Lignées cellulaires tumorales Mišji modeli humanih kancera Razvoj novih terapijskih vektora

Pregled razvoja antitumorskih lekova uloga animalnih modela IND NDA Chemical Synthesis and Formulation Development Animal Models for Efficacy Assay Development Dose Escalation and Initial PK Proof of Concept and Dose Finding Large Efficacy Trials with PK Screen Animal PK and PD PK/PD Studies in Special Populations PHASE I PHASE II PHASE III Pre-Clinical Development Clinical Development

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji Spontani tumori Idiopatski Transgene/knockout životinje: p53, RB, itd Kancerogenima indukovani modeli Izloženost hemikalijama kao što je DMBA (oralni kancer na modelu hrčka, kancer mlečnih žlezda kod miševa) Izloženost radijaciji (UV zračenje -> kancer kože) Hormoni, faktori rasta, virusi, … Transplantabilni tumori Alograft transplantacioni modeli (imunokompetentni recipijenti, domaćin i graft imaju istu genetsku osnovu) Ksenograft transplantacioni modeli (imunoinkompetenti recipijenti, domaćin = miš, graft = čovekovo sveže tkivo ili imortalizovane ćelijske linije) Transplantaciona lokacija (ortotopna -u organ porekla tumorskih ćelija, subkutana, itd

Humani ksenograft tumori Atimusni “nude” miševi su napravljeni 60-tih godina XX veka Mutacija u nu genu na hromozomu 11 Fenotip: poremećen rast, niska fertilnost, nemaju krzno, imunokompromitovani gubitak timusa, T-ćelijski imunitet Prvi humani tumorski ksenograft adenokarcinom kolona (Rygaard & Poulson, 1969)

Mesta za ksenograftove kod miša Subkutani tumor sa IP primenom leka Intraperitonealno Intrakranijalno Intrasplenično Renal subkapsula Inokulacija na specifična mesta, organe, (ortotopno)

Ksenograft studije Tačke posmatranja za toksičnost: Za lek povezana smrt Neto gubitak u težini životinja Tačke posmatranja za efikasnost Testovi za klonalnost Testovi za rast tumora Odnos preživljavanja tretiranih i kontrolnih životinja Promene u masi tumora

Prednosti ksenograft modela Moguće je transplantirati različite humane tumorske ćelijske linije Široko prisustvo većine humanih solidnih tumora Omogućava procenu terapijskog indeksa

Mane ksenograft modela Tumori mozga su problematični za ovaj model Različito biološko prepoznavanje, metastaze su retke Kratko “doubling times”od originalnog rasta u ljudima Malo nekroze, bolje dopremanje krvi Problematično održavanje životinja zbog rizika od infekcije Efekti terapije su različiti kod miša i čoveka

Transplantabilni tumori može lako biti presađen između individua istog inbrednog soja i neki od njih su takođe lako uspostavljeni u kulturi tkiva in vitro proučavanje njihove inokulacije u singenog domaćina tumorske ćelijske suspenzije dobijene iz kulture tkiva, ćelijske suspenzije dobijene disocijacijom in vivo nastalih tumorskih masa ili delovi in vivo nastalih tumora su ubrizgani stvoreni od spontano nastalih ili indukovanih maligniteta, kao što su radijacijom indukovani, karcinogen-indukovani ili onkogen-indukovane ćelije kancera dobar model za proučavanje uloge imunskog sistema u progresiji tumora, i verovatno su najupotrebljavaniji tumorski modeli zato što se sa njima relativno lako manipuliše i u in vitro i u in vivo uslovima

Transplantabilni tumori kod miša Transplantabilni tumori glodara dosta se razlikuju u njihovim metastatskim karakteristikama. Neki modeli su “spontano” metastatski i formiraju i primarne tumore i različite metastatska oštećenja prateći pojedinačna diskretna mesta inokulacije u solidnim tkivima. Drugi transplantabilni tumori samo rastu na mestu primarne inokulacije. Ipak neki modeli stvaraju “eksperimentalne” metastaze, zato što metastaziraju predominantno ili isključivo u plućima posle intravenskog unošenja, ali ne daju spontane metastaze. Oni se takođe dosta i razlikuju u odnosu na njihovu imunogenost. Najveći broj humanih tumorskih ćelija su slabi imunogeni jer je teško stimulisati efikasan imunitet protiv njih. Nasuprot tome, transplantabilni mišji tumori imaju opseg imunogenosti od “slabe” preko “srednje” do “jake”

Transplantabilni tumori kod miša

Miš kao model za razvoj dojke i istraživanja tumora dojke

Zašto je mlečna žlezda miša moćno genetsko sredstvo? Razlozi Eksperimentalna sredstva Kako se dizajniraju transgeni miševi za proučavanje razvoja/tumora

Zašto se miš koristi kao model za tumor dojke? Histologija je komparabilna sa histologijom kod čoveka Može se koristiti genetika za manipulaciju sa mlečnim žlezdama Imaju više pari mečnih žlezdi što omogućava više biopsija Mogu se purifikovati epitelne ćelije iz masnog tkiva i potom ih kultivisati

Transplantacija mlečne žlezde uklonite endogeni epitel od jastučta stromalnog masnog tkiva Transplantirani epitel raste u jastuče masnog tkiva u toku 6-8 nedelja Transplantirati deo tkiva koji sadrži epitel donora ili injecirati prečišćene ćelije Transplantacija mlečne žlezde

Kako se konstruišu transgeni miševi specifični za mlečnu žlezdu Ovi promotori su hormonski regulisani milk protein gene minimal promoter Your Favorite cDNA obično MMTV (engl. mouse mammary tumour virus) ili Wap  (engl. whey acidic protein)  Injecirati u izolovani nukleus miša Proveriti da li postoji povećanje ekspresije željenog gena u mlečnim žlezdama kod ženskog potomstva

Genetski modifikovani animalni modeli N-etil-N-nitrozourea (ENU) mutageneza Random mutageneza Transgene životinje nose jedan ili više stranih gena u zavisnosti od promotora ekspresija transgena može biti vremenski ili tkivno zavisna Ciljane modifikacije Knock- out miševi (p53 knockouti – Li-Fraumeni Sindrom) „Conditional knockout“ miševi Korišćenje Cre-lox sistema Tetraciklinom-kontrolisana transkripciona aktivacija Nivo kompleksnosti u modeliranju

Ostali animalni modeli Transgeni animalni modeli knockout životinje za P53 ili drugi tumor supresor gen razvoj endogenih tumorskih ćelija mogu biti dobri za terapiji monoklonskim At Ostali animalni modeli Ortotopni animalni modeli: implantacija tumorskih ćelija u ciljne organe Metastatski modeli

Transgeni mišji modeli spontanih maligniteta

Transgeni mišji modeli koji eksprimiraju humane tumorske antigene

Endostatin: endogeni inhibitor angiogeneze i rasta tumora Animalni modeli tumora u proceni efekasnosti terapijskih protokola Endostatin: endogeni inhibitor angiogeneze i rasta tumora O'Reilly et al, Cell 88:277-285 (1997)

Studije na “immunodepressed” miševima Primarne imunodeficijencije – Mutanti, npr “nude” miševi i pacovi sa deficijencijom T ćelija – Genetski modifikovane životinje (transgene ili knockout) Indukcija smanjenja imunskog odgovora – In vivo tretman antitelima, imunosupresivnim lekovima, inhibitorima fagocitoze – Neonatalna timektomija i/ili subletalno zračenje – Selektivna rekonstitucija

Konceptualizacija stresa Dinamično stanje ugroženosti ili primećena ugrožena homeostaza Aktivacija primarnih stres sistema Hipotalamo-hipofizna-adrenalna osa (HPA) Simpatički nervni sistem (SNS) Osnovni stres hormoni Kateholamini Glukokortikoidi Individualno mikrookruženje Neuroendokrina funkcija Mikrosredina tumora Individualne razlike u toku bolesti i odgovor na lečenje Adaptirano po Cole (2008)

Izlaganje hroničnom stresu promoviše rast tumora i angiogenezu Upotreba mišji domaćin-humani tumor hibridni model Prvi eksperimentalni dokaz da behjvioralni stresori mogu da povećaju patogenezu ovarijalnih karcinoma in vivo Neuroendokrini stres odgovor utiče na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na tumorskim ćelijama SKOV3 HeyA8 SKOV3-ip Hronični stres podstiče rast tumora i angiogenezu u mišjem modelu ovarijalnih karcinoma Thaker et al., (2006)

ovarijalnih karcinoma in vivo Efekat stresa rast ovarijalnih karcinoma in vivo Eksperimentalni rezultati pokazuju da hronična izloženost stresu i socijalna izolacija rezultuju rastom tumora Identifikovana su dva molekularna mehanizma: Regulacija stresa: Signaling kateholamina preko beta-adrenergičkih receptora Biologija tumora: Povećana angiogeneza

Implikacije i ograničenja Implikacije: β-blokada može da pomogne u usporavanju progresije tumora kod humanih ovarijalnih kancera Ograničenja: Relevantnost za druge tipove kancera Uloga drugih mehanizama biologije tumora Kapacitet invazivnosti Onkogena aktivnost Preživljavanje ćelija i adhezija Inflamacija Hemoterapijska rezistentnost

Kliničke mogućnosti Test prognostičke vrednosti ekspresije β-receptora i polimorfizmi Određivanje efekta hroničnog stresa i nivoa kateholamina i njegovi efekti na mikrookruženje tumora Identifikacija novih biomarkera koji mogu da identifikuju koji je tip kancera i profil bihejvioralnog rizika koji su uglavnom zahvaćeni odgovorom stresa Odrediti efekata farmakoloških i/ili bihejvioralnih intervencija na modulaciju biomarkera, progresija slobodnog preživljavanja i eventualno prekomerno preživljavanje