Metode proučavanja virusa Prof dr Biljana Nikolić

Detekcija i identifikacija virusa: Primenom “nekultivacionih” metoda fizičke metode (tehnike vizuelizacije i analize strukture virusnih čestica) serološke/imunološke metode metode molekularne biologije Primenom metoda izolacije i kultivacije (neophodnost korišćenja ćelija domaćina) - metode praćenja infektivnosti

Fizičke metode Elektronska mikroskopija (EM) – vizuelizacija virusnih čestica i proučavanje morfoloških karakteristika i enumeracija virusa (ukupan br, ne moraju sve čestice biti infektivne) (moć razdvajanja 0.4-1 nm; veličina virusnih čestica 20-300 nm) senčenje (‘shadowing’) teškim metalima (osmijum) ili cryoEM (brzo zamrzavanje uzorka virusa, virioni su zarobljeni u tankim slojevima leda) Kristalografija X zracima (analiza velikih proteinskih molekula) i NMR spektroskopija (analiza manjih proteina i peptida) - omogućavaju studiranje strukture virusnih čestica na molekularnom nivou

Fizičke metode Diferencijalno centrifugiranje (prečišćavanje virusa) Centrifugiranje (odvajanje ćelija u talogu i virusnih čestica u supernatantu) i Ultracentrifugiranje (taloženje virusnih čestica iz supernatanta primenom velikih brzina centrifugiranja) Centrifugiranje u gradijentu gustine (rastvori supstanci čija gustina raste ka dnu epruvete) pr. saharoza, manitol, dekstran, glicerol, CsCl –cezijum hlorid Omogućavaju fino razdvajanje čestica u biološkim uzorcima duž gradijenta (pr. razdvajanje rRNK od tRNK) Saharozni gradijent u virusologiji najkorišćeniji, CsCl-gradijent odvaja virusne čestice od ćelijskih komponenti, nepovoljan za viruse u omotaču (jer je omotač ćelijskog porekla)

Serološke/imunološke metode Zasnivaju se na korišćenju reakcije antigen-antitelo Omogućuju - određivanje antigenske strukture virusa - identifikaciju virusa u kliničkim izolatima (u uzorku iz prirode) - kvantifikaciju virusa u uzorku, koncentrovanje i prečišćavanje iz uzoraka - potvrdu prisustva i kvantifikaciju antitela u serumu Esej hemaglutinacije (detekcija virusa praćenjem hemaglutinacije crvenih krvnih zrnaca, npr. detekcija influenca virusa) Međusobno povezivanje eritrocita virusnim partikulama, nastaje hemaglutinat koji je uočljiv kao ’tepih’ (razgranata mreža u celom bunariću) Reakcija između virusnog proteina hemaglutinina i ćelijskog receptora na površini Pozitivna – u vidu ’tepiha’) Negativna – u vidu ’dugmeta’, eritrociti padaju na dno)

Serološke/imunološke metode Test neutralizacije virusa (detekcija specifičnih virusnih antitela u serumu preko praćenja citopatskog efekta virusa na ćelijama) Princip: Vezivanje specifičnih antitela za virusne čestice dovodi do neutralizacije citopatskog efekta – molekuli koji prepoznaju receptore na ćelijama domaćina su blokirani, virus ne može da izazove citopatski efekat (smrt ćelije) U zavisnosti od antigenih determinanti koje prepoznaju, antitela mogu da vrše neutralizaciju ili ne Test neutralizacije koristimo za definisanje serotipova virusa (serotipovi poliovirusa tako definisani) 3 serotipa poliovirusa (različite antigene determinante, antitela specifična za jedan serotip ne prepoznaju drugi serotip) bitno u klasifikaciji virusa i proizvodnji vakcina (mora da omogući imunitet prema sva tri serotipa)

Serološke/imunološke metode Immunostaining – imunološka bojenja (obeležena antitela omogućavaju vizuelizaciju virusnih proteina u uzorku ’obeleživači’ – fluorescein, peroksidaza rena (horseradish), nanočestice zlata direktna i indirektna imunološka bojenja - Imunofluorescencija (antitelo je fluorescentno obeleženo, fluorescentni mikroskop omogućava vizuelizaciju) - Immuno-Gold Electron Microscope (antitela obeležena zlatnim nanometarskim česticama, elektronski mikroskop omogućava vizuelizaciju)

Serološke/imunološke metode Imunoprecipitacija (taloženje specifičnog proteinskog antigena, koristi se kada treba izolovati specifični “retki” protein iz uzorka) ćelije su ’preobeležene radioaktivitetom’ - gajene u radioaktivnom medijumu, nakon precipitacije i centrifugiranja vezani protein se oslobađa i radi se SDS-PAGE, kako bi se protein prečistio Imunoblot (Western blot, elektroforetsko razdvajanje proteina iz uzorka, prebacivanje na nitroceluloznu membranu, upotreba obeleženog antitela za detekciju željenog proteina) SDS-PAGE SDS: Sodium dodecil sulfat – linearizuje proteine i negativno ih elektriše (kretanje ka anodi) PAGE: poliakrilamidna gel elektroforeza imunoprecipitacija

Serološke/imunološke metode ELISA test (enzyme-linked immunosorbent assay) ’antigen capture ELISA’ – detekcija virusnih proteina-antigena u uzorku (bunarići ploče sadrže imobilisana antitela za dati virus) ’antibody capture ELISA’ – detekcija antitela u uzorku (imobilisani virusni antigeni na pločici) – za obeležavanje se koristi horsradish peroksidaza – oksiduje pomoću H2O2 hromogene supstrate koji menjaju boju, što se meri spektrofotometrijski (microplate reader, ELISA čitač) Hromogeni supstrati (indikatorske supstance): ABTS, AmplexRed, DAB...

Molekularna virologija Proučava organizaciju viralnih genoma, njihovu replikaciju i ekspresiju Proučava viralne proteine Omogućava identifikaciju virusnih čestica u uzorku iz prirode (kliničkom izolatu) primenom molekularnih metoda Metode molekularne biologije za proučavanje virusnih proteina PAGE i SDS PAGE Western blot određivanje AK sekvence virusnih proteina Metode molekularne biologije za proučavanje virusnih nukleinskih kiselina Southern blot (fragmentacija DNK restrikcionim nukleazama, prebacivanje fragmenata na membranu, hibridizacija sa specifičnim, radioaktivno obeleženim DNK viralnim sekvencama) Northern blot (analogna metoda za detekciju RNK) PCR, qPCR (quantitative real time PCR) i RT-qPCR (reverse transcription qPCR, koristi reverznu transkriptazu za inicijalno prevođenje RNK u DNK, omogućava analizu genoma RNK virusa) FISH metoda (fluorescentna in situ hibridizacija) “microarray” tehnika (korišćenje DNK silika čipova) sekvenciranje i analiza sekvenci virusnih DNK i RNK

Detekcija viralnih genoma u prirodi Viralna metagenomika – analizira ukupnost svih viralnih gena u nekoj životnoj sredini Zastupljenost virusa u prirodi ogromna (u 1 ml morske vode ~10x više virusnih čestica nego bakterijskih ćelija) Analize viralnih metagenoma nekoliko životnih sredina → ogroman viralni diverzitet na planeti (~75% virusnih gena ne pokazuje sličnost sa do sada poznatim sekvencama) Fluorescentno obeleženi (SYBR green) organizmi u morskoj vodi (virusi, bakterije, fitoplankton)

Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina plaque assay Enumeracija virusa – određivanje titra virusnog stoka (razlikovati ukupan broj virusnih čestica od broja PFU “plaque-forming units” = broj infektivnih virusnih čestica) princip metode isti kao i kod određivanja br. živih ćelija indirektnom metodom Procedura dobijanja plaka korisna i za izolovanje čiste kulture virusa princip metode isti kao i kod dobijanja čiste kulture bakterija , izolovanje potomstva jedne virusne čestice (iz jedne plake) Efikasnost plejtiranja (efikasnost sa kojom virusi uspešno inficiraju ćelije domaćina), čak i kad su čestice infektivne, nikada nije 100% Za bakteriofage najčešće veća od 50%, za animalne viruse značajno manja, čak može biti 0.1-1 %

Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina: Model: bakteriofag – bakterija (umnožavanje faga u ćeliji domaćinu) Problem gajenja animalnih i biljnih virusa - gajenje na eksperimentalnim životinjama, embrionima (najčešće pileta) i ćelijskim kulturama - gajenje na eksperimentalnim biljkama, kulturama biljnih ćelija i organa

Kultivacija animalnih virusa: Proučavanje citopatskog efekta i transformišućeg potencijala virusa na inficiranim ćelijama Omogućuje proizvodnju vakcina i specifičnih antitela protiv virusnih oboljenja Omogućuje pronalaženje novih antiviralnih lekova i ispitivanje njihovog antiviralnog potencijala monosloj neinficiranihVero ćelija Vero ćelija inficirana Herpes simplex virusom

Proučavanje infektivnosti virusa (determinacija virusnih infektivnih jedinica) Plaque assay (određivanje PFU – plaque forming units, omogućuje određivanje broja infektivnih virusnih čestica – titriranje virusa) Infectious center assay (određivanje frakcije ćelija u kulturi koja je inficirana virusom; svaka inficirana ćelija je centar širenja infekcije, odnosno jedna PFU) Transformation assay (određivanje titra virusa koji ne formiraju plake, ali dovode do transformacije ćelija)

MAGI assay za detekciju infekcije HIV virusom Indikatorske ćelije (MAGI) sadrže virus-inducibilnu reportersku gensku kasetu reporter genska kaseta: virusni ‘long terminal repeat - LTR’ uzvodno od gena za β-galaktozidazu (β-gal) Ako nema virusnog transkripcionog aktivatora Tat, LTR se ne eksprimira, a sa njime nema ekspresije ni fuzionisanog β-gal Ako ima virusnog transkripcionog aktivatora, Tat LTR se eksprimira, a sa njime se eksprimira i fuzionisani β-gal Tat se ne dodaje, već se dodaje uzorak koji se analizira (postoji infekcija – Tat prisutan u tkivu) Ukoliko su ćelije inficirane HIV virusom, u njima se prizvodi viralni protein Tat, što rezultira ekspresijom reporterske kasete X-gal je hromogeni supstrat koji omogućava praćenje ekspresije β-galaktozidaze (aktivna β-gal hidrolizuje laktozu, veštački supstrat je X-gal, njegovom razgradnjom dobija se plava boja) Intenzitet plave boje se očitava spektrofotometrijski i ukazuje na prisustvo infekcije)

Metode gajenja bakteriofaga Osnovne metode: Određivanje titra virusnog stoka Priprema virusnih stokova – metodom infekcije osetljivog soja (i virulentni i umereni bakteriofagi) - metodom lizogene indukcije umerenih virusa iz lizogenih bakterija Moguća praktična primena: Ispitivanje korišćenja bakteriofaga u kontroli rasta patogenih bakterija

Priprema virusnog stoka metodom infekcije osetljivog soja Inokulacija bakterija i virusa u polučvrstu podlogu (TA7) i plejtiranje na bogatu hranljivu podlogu (TA15) Zasejane bakterije – u kojoj fazi rasta i kakva je brojnost? eksponencijalna faza rasta (intenzivan metabolizam) broj bakterija takav da daju konfluentan rast (iz koncentrovane suspenzije) Zasejani fagi – kakva je brojnost? broj faga takav da izazivaju konfluentnu lizu (MOI = 0.01) MOI je multiplicitet virusne infekcije, tj. odnos broja infektivnih virusnih čestica i živih ćelija bakterija u suspenziji (1 fag na 100 ćelija) Prekonoćna inkubacija u odgovarajućim uslovima Sakupljanje polučvrste podloge (u njoj su izrasle bakterije i umnoženi virusi) u epruvete za centrifugiranje Centrifugiranje (odvajanje bakterija i njihovih ostataka u talog, virusi ostaju u supernatantu) Sakupljane supernatanta, uklanjanje eventualno prisutnih živih bakterija (dodavanje hloroforma) Dobijen stok virusa! Sledeći korak – određivanje titra

Priprema virusnog stoka metodom infekcije osetljivog soja bakterije fagi + 37°C/24h Virusi u supernatantu Bakterijski ostaci i medijum T7 u talogu Centrifugiranje

Priprema virusnog stoka metodom lizogene indukcije Model λ fag

λ fag Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički ciklus Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica Genom linearna dvolančana DNK sa jednolančanim komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta), u ćeliji se cirkularizuje

Životni ciklus λ faga Litički ciklus: Faza replikacije virusa Faza maturacije virusa Liza ćelije i oslobađanje novih viriona Lizogeni ciklus: Virusna DNK je integrisana u hromozom domaćina (profag) Bakterija koja nosi profag je lizogena, ona se normalno umnožava i daje potomstvo koje u sebi nosi profag. Lizogena bakterija je imuna na ponovnu infekciju istim tipom virusa Virusni geni odgovorni za ulazak u litički ciklus su pod represijom → ulazak u litički ciklus je sprečen Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u litički ciklus

CI prisutan u ćeliji u dovoljnim količinama CI – represor λ faga Ključan u regulaciji ulaska u litički ili lizogeni ciklus Sinteza veoma fino regulisana (za njegovu sintezu neophodan je CII protein, a CII strabiliše CIII protein) CI prisutan u ćeliji u dovoljnim količinama ↓ Stabilno se vezuje za operatorska mesta virusnih gena (litičkih); onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus - virus ulazi u lizogeni ciklus. Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga, odmah se vezuje za operatorska mesta njegovih gena, a to znači imunost na ponovnu infekciju.

Zašto ulazak u litički/lizogeni ciklus zavisi od energetskog stanja u ćeliji? Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora CI i ulazak u lizogeni ciklus. Njegova stabilnost zavisi od prisustva proteina CIII (stabilizuje ga) i količine ćelijskih proteza koje ga razgrađuju odmah po sintezi. CII je PE aktivator protein, aktivira jedan od promotora sa koga se sintetiše CI represor (promoter establishment – uspostavlja lizogeni ciklus) Energetsko stanje u ćeliji dobro, intenzivan metabolizam ↓ Ima dovoljno proteaza koje razgrađuju CII protein nema CII, nema ni CI represora Litički ciklus Energetsko stanje u ćeliji loše, metabolizam usporen ↓ Nema dovoljno proteaza, CII je stabilan, CI represor se sintetiše Lizogeni ciklus

Regulacija ulaska u litički/lizogeni ciklus OR je operatorsko mesto promotora PR i PM (promotor maintenance gena za CI) Cro represor blokira sintezu sa PL(CIII sinteza blokirana), sa PR (CII sinteza blokirana, sopstvena sinteza blokirana) i sa PM (CI sinteza blokirana); najpre blokira sintezu CI (afinitet vezivanja za mesto 3 najveće), a na kraju sopstvenu sintezu → virus ulazi u litički ciklus CI represor blokira sintezu sa promotora PL, PR i PM ali najpre blokira sintezu Cro (afinitet vezivanja za mesto 1 najveće) → blokira litički ciklus. Kada je CI vezan za mesto 1, on služi i kao aktivator PM promotora. Na kraju, kada se veže i za mesto 3, blokira i sopstvenu sintezu (sa promotora PM).

Lizogena indukcija Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak u litički ciklus, omogućeno razgradnjom λ represora. Spontan proces se retko dešava, ali je moguće indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ zračenje, hemijski mutageni). U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije SOS odgovora. Jedna od manifestacija je i razgradnja represora koji drže zaključane SOS gene, ali i razgradnja CI represora λ faga. Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus. Virus se umnožava u veliki broj fagnih partikula, ćelije se liziraju, fagi oslobađaju u okolni prostor i inficiraju susedne ćelije. Manifestacija ovog procesa je pojava plaka na bakterijskom tepihu, odnosno bistrenje ćelijske suspenzije u tečnoj kulturi. Biološki smisao – virus napušta ćeliju kojoj je DNK značajno oštećena, tj. čije su šanse za preživljavanje male

Dobijanje stoka virusa lizogenom indukcijom (Iskorišćen je princip lizogene indukcije) EKSPERIMENT: Dodati bakterije u erlenmajer sa LB podlogom: ozračene bakterije (lizogena indukcija, umnožavanje faga) neozračene bakterije (negativna kontrola) UV(60 J/m2) Inkubacija na 37oC 3-4 h, do pojave ’prosvetljenih krpica’ (odsustvo bakt. ćelija, lizirane su), Dodavanje hloroforma – ubijanje živih bakterijskih ćelija Centrifugiranje: 15 min, 5000 rpm Sakupljanje supernatanta, hloroform Određivanje titra virusa Stok faga

Test na lizogenost Pre izvođenja lizogene indukcije neophodno je uraditi test na lizogenost Provera da li je fag prisutan u ćeliji Test se zasniva na imunosti lizogene bakterije prema istorodnom tipu faga Bakterija je lizogena sa λ fagom Bakterija nije lizogena sa λ fagom λwt λvir λwt λvir Uloga λvir je provera da li bakterija ima funkcionalne receptore za λ fage Uloga nelizogene bakterije je provera vijabilnosti λwt faga