Koncept ćelijske kulture – tehnike i primena dr Milica Pešić

Istorijat: ► još u XIX veku engleski fiziolog (Sydney Ringer) je napravio rastvor različitih soli u kojem je bilo moguće održavati pulsiranje srca izolovanog iz životinje ► Wilhelm Roux je začetnik 2D ćelijske kulture - još 1885. godine je uspeo da održi embrionalne ćelije pileta na ravnoj staklenoj posudi ► nemački bakteriolog (Julius Richard Petri) je napravio prve plastične posude tzv. petrijevke ► tehnike u ćelijskoj kulturi su značajno poboljšane sredinom XX veka (oblast-virusologija) ► pronalazak injektabilne polio vakcine (Jonas Salk)

Kultura ćelija ima primenu u različitim disciplinama: ► molekularna i ćelijska biologija ► biohemija ► imunologija ► histologija i citologija

Rekombinantna DNK tehnologija u ćelijskoj kulturi: ► proizvodnja enzima ► sintetskih hormona ► monoklonskih antitela ► interleukina ► limfokina ► antikancer agenasa

Gajenje ćelija na sofisticiranim podlogama: ► kolagen i fibrin ► poliakrilamidni gelovi ► 3D matriks koji po sastavu imitira vanćelijsku sredinu pojedinih tipova ćelija

Doprinos istrživanja u ćelijskoj kulturi: ► samo-obnavljanje stem ćelija u kulturi ► izdvajanje specifičnih tipova stem ćelija ► bolja karakterizacija fenotipa tumorskih ćelija ► bolje upoznavanje funkcije određenih ćelijskih tipova ► proučavanje kretanja ćelija i kontakata sa vanćelijskom sredinom i okolnim ćelijama ► prodor se očekuje u otkrivanju novih lekova, upoznavanju biologije kancera i regenerativnoj medicini

Sterilni blok sadrži: ► laminarnu komoru ► inkubator sa CO2 bocom ► mikroskop ► centrifugu ► vodeno kupatilo ► frižider i zamrzivač ► kontejner za tečni azot ► vakuum pumpu ► ELISA čitač

Laminarna komora: ► posebno izolovan sterilni prostor ► ventilatori i filteri onemogućuju ulazak vazduha iz spoljašnje sredine ► UV lampa ► sav materijal prebrisati 70% alkoholom (automatske pipete, kutije sa nastavcima za automatske pipete, plastika za rad sa ćelijama, boce sa rastvorima – PBS, medijumi, voda itd.) ► uneti sterilnu posudu za odlivanje rastvora i bacanje upotrebljenih nastavaka za pipete ► kada se ruke u sterilnim rukavicama unesu u radno polje laminarne komore ne vade se iz nje dok celokupna procedura sa ćelijama ne bude završena ► dodatne mere zaštite osoblja – vakcina protiv hepatitisa B

Inkubator: Mikroskop: Centrifuga: Vodeno kupatilo: ► obezbeđuje temperaturu 37°C ► vlažnu atmosferu ► 5% CO2 ► optimalni uslovi za rast, deobu i diferencijaciju ćelija Mikroskop: ► invertni ► promene u izgledu ćelija ► promene u gustini ćelija ► prisustvo kontaminacije ► brojanje ćelija Centrifuga: ► izdvajanje ćelija iz suspenzije u vidu taloga ► razdvajanje različitih ćelijskih frakcija Vodeno kupatilo: ► grejanje rastvora i medijuma ► otapanje ćelija

Sterilna plastika: ► flaskovi za uzgajanje ćelija i njihovo umnožavanje (25, 75 i 125 cm3) koji mogu imati zatvarač sa i bez filtera ► sterilne ploče sa različitim brojem bunarića (6, 12, 24 i 96) koriste se za potrebe samog eksperimenta ► sterilne petrijeve šolje različitih dimenzija

► sterilne epruvete različitih zapremina (od 0,5 do 50 ml) ► mikrometarski filteri i filterske jedinice ► vajlice za zamrzavanje ćelija u tečnom azotu

Sterilni rastvori: Medijumi: ► rastvori koji po svom sastavu podsećaju na vanćelijsku tečnost in vivo ► proizvode se u vidu praha ili tečnosti ► sadrže odgovarajuće količine malih molekula (soli, glukoza, amino kiseline i vitamini) ► ne sadrže serum kao ni ostale proteinske faktore (dodaju se prilikom pripreme kompletnog medijuma) ► rastvori se mogu pripremati u nesterilnim uslovima ► provera pH (optimalan pH 7,4) ► vlažna sterilizacija u autoklavu (isključivo voda i rastvori koji ne sadrže termolabilne komponente) ► filtriranje rastvora kroz 0,2 μm filter direktno u sterilnu posudu (serum, antibiotici, glukoza, kompletan medijum, proteolitički enzimi, rastvori biološki aktivnih supstanci itd.) ► filtracija se izvodi u laminarnoj komori

Komponente medijuma: * esencijalne samo u određenim slučajevima AMINO KISELINE VITAMINI SOLI I ELEMENTI DODATNE KOMPONENTE FAKTORI RASTA Arginin* Biotin NaCl Glukoza Insulin Cistein* Holin KCl Piruvat Transferin Glutamin* Folna kiselina NaH2PO4 Penicilin Eritropoetin Histidin Nikotinamid NaHCO3 Streptomicin Interleukin-2 Izoleucin Pantotenska kis CaCl2 Amfotericin B Hidrokortizon Leucin Piridoksal MgCl2 Fenol crveno FGF Lizin Tiamin Cd Serum EGF Metionin Riboflavin Mn Linoleinska kis ECGS Fenilalanin Mo Hipoksantin Treonin Ni Timidin Triptofan Putrescin Tirozin* Valin * esencijalne samo u određenim slučajevima

Komponente medijuma: ► amino kiseline su u L-obliku (0,1 ili 0,2 mM) ► esencijalne amino kiseline i ne-esencijalne amino kiseline ► L-glutamin se dodaje neposredno pri pravljenju kompletnog medijuma (2 mM) i pošto je termolabilna amino kiselina, potrebno je dodavati u istoj koncentraciji svake ili svake druge nedelje ► vitamini (oko 1 μM) ► glukoza (0,5- 4,5 g/L) ► piruvat je izvor energije, potreban za anaboličke procese (1 mM)

Komponente medijuma: ► penicilin (10000 U/ml) i streptomicin (10 µg/ml) se dodaju da bi se sprečila bakterijska infekcija ► amfotericin B (25 µg/ml) se dodaje da bi se sprečila gljivična infekcija ► fenol crveno predstavlja indikator pH, a karakteristična svetlo crvena boja je prisutna na pH oko 7,4 (reguliše se puferskim sistemom u medijumu - HEPES ili Na- bikarbonat) ► serum (fetalni goveđi, konjski ili ljudski): mešavina velikog broja različitih proteina, hormona, lipida, minerala i faktora potrebnih za proliferaciju ćelija ► nekim ćelijama su dodatno potrebni i specifični faktori rasta, koji u serumu nisu prisutni

Priprema medijuma: ► medijum komercijalno proizveden u prahu treba rastvoriti u odgovarajućoj količini dejonizovane vode na magnetnoj mešalici ► dodati glukozu i Na-bikarbonat ukoliko je neophodno ► doterati vrednost pH 7,4 ► u laminarnoj komori, profiltrirati rastvor medijuma u sterilnu staklenu bocu i u njega dodati odgovarajuće sterilne rastvore (L-glutamin, serum, antibiotike, antimikotike, faktore rasta) ► u sterilni medijum komercijalno proizveden u vidu rastvora dodati odgovarajuće sterilne rastvore (L-glutamin, serum, antibiotike, antimikotike, faktore rasta) ► medijum čuvati na +4°C ► neposredno pred upotrebu, medijum ugrejati u vodenom kupatilu na +37°C (samo količinu neophodnu za rad)

Primarne ćelijske kulture: ► fetalne ili neonatalne ćelije, tkiva odraslih jedinki ► metoda kulture eksplanta ► metoda enzimatske disocijacije ► proteolitički enzimi (tripsin, kolagenaza, akutaza itd) i helirajući agens (EDTA) ► do ćelijske suspenzije ► izdvajanje homogene populacije ćelija od interesa: fizičke osobine adhezivnost prisustvo specifičnih antigena na membrani

Primarne ćelijske kulture: ► homogena populacija ćelija može biti: - predmet direktnog biohemijskog/imunološkog/histološkog ili molekularnog ispitivanja - polazni materijal za uspostavljanje primarne ćelijske kulture ► uzgajanje ćelija u ćelijskoj kulturi omogućava povećavanje broja ćelija i ispitivanje njihovih karakteristika pod različitim uslovima ► ćelije i u kulturi, in vitro, ispoljavaju svoje karakteristične osobine, koje ispoljavaju u in vivo uslovima ► primarne ćelijske linije imaju veoma ograničen životni vek odnosno broj pasaža (presejavanja) ► u zavisnosti od toga da li izolovane ćelije imaju izražena svojstva adhezije kulture se mogu podeliti na adherentne i neadherentne

Primarna kultura adherentnih ćelija: ► većina ćelija sisara zahteva čvrstu podloga za koju adheriraju ► sastav vanćelijskog matriksa (eng. extra-cellular matrix-ECM) varira između različitih tkiva što treba imati u vidu prilikom uspostvaljanja primarne kulture određenog tipa ćelija ► podloga je posebna plastika namenjena uzgajanju adherentnih ćelija (negativno naelektrisana- SO3 2-; ili fabrički presvučena nekom proteinskom komponentnom vanćelijskog matriksa npr.kolagenom) gelovi i sunđeri – porozna smeša ECM molekula i biopolimera mikronosači – male sfere prevučene adhezivnim faktorima

Primarna kultura neadherentnih ćelija (ćelijska suspenzija): ► kod sisara, to su ćelije krvi i neke tumorske ćelije ► pri uzgajanju i propagaciji neadherentnih ćelijskih linija ne primenjuju se proteolitički enzimi za odlepljivanje od podloge ► najčešće korišćena kultura neadherentnih ćelija je kultura mononuklearnih ćelija periferne krvi (eng. perifferal blood mononucleoar cells, PBMC)

Imortalizovane ćelijske linije: ► ćelijska linija sa neograničenim životnim ciklusom ► normalne ćelije sisara prestaju da se dele u kulturi (starenje ćelija) ► ćelijske kulture se stabilizuju genetski – onkogenom transformacijom ► ograničenje beskonačnog broja deoba - progresivno skraćivanje telomera na hromozomima ► da bi proliferisale neograničeno – unosi se gen za katalitičku subjednicu telomeraze ► kod nekih ćelija potrebno je ne samo uvesti telomeraze već i inaktivirati kontrolu ćelijskog ciklusa unošenjem nekog onkogena ► za razliku od humanih ćelija, većina ćelija glodara ima aktivne telomeraze ► imortalizovane ćelijske linije se mogu lakše dobiti od tumorskih ćelija ► komercijalno dostupne banke ćelija: ATTC (American Tissue Type Collection) ECACC (European Collection of Cell Cultures) ► pacijenti ne polažu pravo na ćelijske linije dobijene iz njihovih biopsija ► utvrđivanje autentičnosti ćelijskih linija

Propagacija ćelija: ► pasaža ćelija se vrši najčešće dva puta nedeljno ► 80-90% konfluentnosti ► nakon uklanjanja medijuma, ćelije se ispiraju sa 1x PBS puferom (adherentne ćelije) ► odlepljivane od površine podloge vrši se pomoću 0,25% tripsin/EDTA rastvora (adherentne ćelije) ► enzimska reakcija se nakon 2-3 min prekida dodavanjem kompletnog medijuma sa 10% FBS, čistim serumom ili komercijalnim inhibitorom tripsina (adherentne ćelije) ► ćelije se potom talože centrifugiranjem 5 min na 1800 rpm ► broj ćelija se određuje pomoću hemocitometra na invertnom mikroskopu ► ćelije se na kraju zasejavaju u odgovarajućoj gustini u svež medijum za eksperimente ili za dalje umnožavanje i održavanje u kulturi (8000-32000 ćelija/cm2)

TB test za brojanje ćelija ► TB (Trypan blue) je boja koja prodire kroz oštećene membrane mrtvih ćelija - razlikuje vijabilne ćelije od mrtvih u toku brojanja na hemocitometru ► ćelije u kompletnom medijumu, pripremljene za brojanje, su resuspendovane u odnosu 1:1 sa 0,4% rastvorom TB u 1x PBS ► za postavljanje eksperimenata, odnos 0,4% TB rastavora u 1x PBS, 1x PBS i ćelija u medijumu iznosi 5:3:2 ► u periodu od 5 min se odvija prodiranje TB u mrtve ćelije ► po 10 µl obojene ćelijske suspenzije ubrizga se u obe izbrazdane komorice hemocitometra

TB test za brojanje ćelija ► ćelije se broje u obe komorice hemocitometra, u po 5 pet polja ► broj ćelija se određuje prema formuli: C/Q * Fh * Fd = broj vijabilnih ćelija/ml medijuma C - prebrojane vijabilne ćelije, Q – broj polja u kojima su prebrojane ćelije = 10 Fh – faktor hemocitometra (komorice) = 10 000 (svaki kvadrant ima površinu od 1 mm2 a dubina hemocitometarske komore iznosi 0,1 mm) Fd – faktor dilucije, koji predstavlja razblaženje ćelija u odnosu na boju = 2 ili 5 (u zavisnosti da li se radi pasaža ili postavka eksperimenta)

Zamrzavanje i otapanje ćelija: ► nakon odlepljivanja (adherentne ćelije) ćelije nataložiti i resuspendovati, pa prebrojati ► razblažiti suspenziju ćelija tako da 950 µl medijuma sadrži 2x106 - 5x106 ćelija i suspenziju sipati u vajlice za zamrzavanje ► ćelijskoj suspenziji ukapati 50 µl krioprezervativa - DMSO (ili finalno 5%) ► vajlice sa ćelijama držati 30 min na +4°C, 120 min na -20°C, preko noći na -80°C (ćelije se mogu čuvati 2 meseca), a zatim premestiti u kontejner sa tečnim azotom (ćelije se mogu čuvati nekoliko godina) ► ćelije se mogu zamrzavati i u serumu uz dodatak 5-10% DMSO ili u komercijalno dostupnom medijumu za zamrzavanje ćelija ► optimalno je postepeno zamrzavanje ćelija u specijalnim zamrzivačima gde se pad temperature tokom određenog vremenskog perioda može podesiti ► ćelije se naglo otapaju (vajlice odmah iz tečnog azota preneti u vodeno kupatilo na +37°C) ► otopljenu suspenziju ćelija preneti u posudu sa toplim medijumom ► sledećeg dana zameniti medijum ćelijama (osloboditi ih štetnog dejstva DMSO)

Kriva rasta i vreme duplikacije ćelija: ► dobijanje podatka koji omogućava planiranje eksperimenta u željenom trenutku (npr. dužina tretmana) ► važno prilikom uvođenja novih kultura čija se dinamika rasta ne poznaje ► rast zavisi od tipa ćelija i njihove gustine (kontaktna inhibicija – normalne netransformisane ćelije ili kontaktna stimulacija - tumorske ćelije) ► zasejava se određeni broj ćelija, koje se broje u vremenskim intervalima 24, 48, 72, 96, 120, 144 i 168 h ► vreme dupliranja broja ćelija (td) utvrđuje se formulom: td = ln2/μ u kojoj μ predstavlja stopu rasta datu formulom: μ = (lnx-lnx0) / t, gde je x broj ćelija u vremenu t a x0 broj ćelija u nultom vremenu (pri zasejavanju)

Ćelijski vijabilitet stepen preživljavanja ćelija - odnos između broja živih i broja mrtvih ćelija u kulturi ►može se odrediti različitim kolorimetrijskim testovima: SRB test SRB (Sulforodamin B) je negativno naelektrisana supstanca sa dve sulfonske grupe kojima se elektrostatički vezuje za bazne ostatke aminokiselina, bojeći ukupne proteine ćelija ružičastom bojom MTT test MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolijum bromid) test se zasniva na sposobnosti vijabilnih ćelija da na membrani funkcionalnih mitohondrija redukuju tetrazolijumovu so u formazan ► na kraju testa, apsorbanca se određuje na ELISA čitaču (eng. microplate reader) na odgovarajućoj talasnoj dužini

xCELLigence - Cell Counter

Gold Microelectrode Array RTCA Software 1.2 Real Time Cell Analyzer

Ćelijski indeksi = (Rtn – Rt0)/Fi Ćelijski indeks-I na 10 kHz, Ćelijski indeks -II na 25 kHz i Ćelijski indeks -III na 50 kHz. Definisani kao: Ćelijski indeksi = (Rtn – Rt0)/Fi gde je: i = 1, 2, ili 3; F1 = 15, F2 = 12, F3 = 10; a n = 0, 1, 2, …, N (vremenske tačke). Rt0 je pozadinski otpor u vremenuT0, Rtn je otpor ćelija u vremenu Tn. Z=Z0 osnovni otpor Z=Zcell ćelijski otpor Z = Zcell2 dupli otpor Z = Zcell3 dalje povećanje otpora

4000 ćelija po bunariću

Karakterizacija ćelija: ► ćelije primarne kulture je potrebno ispitati i potvrditi da one pripadaju tipu ćelija koji je očekivan ► potvrditi transfekciju ćelija (plazmidnim DNK ili siRNK konstruktima) ► okarakterisati promene kod ćelija dobijenih izlaganjem nekom biološki aktivnom supstancom (npr. antikancer agensi) ► svetlosna mikroskopija je osnovni i prvi korak u verifikaciji ćelija po njihovom karakterističnom obliku ► fluorescentna mikroskopija omogućava ispitivanje prisustva odgovarajućih “markera” koji su specifični za određene tipove ćelija (proteini tj. antigeni u ćeliji ili na membrani) ► većina markera je poznata iz literature, pa postoje antitela koja su za ove antigene specifična ► na osnovu pozitivnog boljenja na citokeratin bi se moglo reći da su u pitanju epitelne ćelije, ali ne i koje su to epitelne ćelije ► zato se proverava i neki drugi specifični marker ► fluorescentno obojena kultura pomešanih neurona i glije: vimentin se nalazi u fibroblastima i endotelijalnim ćelijama GFAP se nalazi u astrocitima neki astrociti su obojeni i vimentinom i GFAP-om –heteropolimerni filamenti

Karakterizacija rezistentne ćelijske linije: NCI-H460/R Povišena ekspresija mdr1 iRNK (RT-PCR metoda) Povišena ekspresija P-glikoproteina (protočna citometrija)

Ukrštena rezistencija na različite droge (SRB test vijabilnosti) IC50 (mM) faktor rezistencije NCI-H460 NCI-H460/R DOX 0.04 2  54.5 VP-16 0.33 7 21.2 PTX 0.0006 0.117 185.7 VBL 0.005 0.173 34.6 EPI 0.046 0.411 8.9 Smanjena akumulacija rodamina 123 (protočna citometrija)

Opšti principi rada u ćelijskoj kulturi: ► pošto se mikroskopom uoči da su adherentne ćelije konfluentne, tj. da su potpuno prekrile površinu na kojoj su rasle, treba ih odlepiti i rasejati na nove površine, ili upotrebiti za eksperiment ► kada su ćelije konfuentne dolazi do promene boje medijuma koji sadrži indikator fenol crveno, u svetliju boju, ka žutoj, zbog pojačane produkcije CO2 ► uneti u laminar sve što je potrebno za dalji rad, bocu sa PBS, bocu sa medijumom, tripsin (sterilan rastvor), automatske pipete, nastavke za automatske pipete, posudu za odlivanje tečnosti (sve pre unošenja u laminar treba prebrisati 70% etanolom, a rastvore ugrejati u vodenom kupatilu) ► izbegavati unošenje i iznošenje ruku iz laminara više puta tokom procedure zbog sterilnosti, što znači da sve što je potrebno za rad prethodno treba uneti u laminar ► odliti medijum i ćelije isprati PBS-om (funkcija ispiranja PBS-om jeste uklanjanje ostataka medijuma pošto serum koji se nalazi u medijumu inhibira dejstvo tripsina) ► izbegavati da ćelije duže vremena budu bez rastvora, tj da budu suve

Opšti principi rada u ćelijskoj kulturi: ► odliti PBS i na ćelije sipati sterilan rastvor tripsina u zapremini koja je dovoljna da prekrije površinu na kojoj se nalaze ćelije ► posmatrati na mikroskopu kako ćelije gube svoj poligonalni oblik i postaju okrugle (odlepljene od površine plastike) i pokretne u rastvoru tripsina ► izbegavati da tripsinizacija traje dugo, pošto tripsin može da ošteti ćelije ► na ćelije u tripsinu sipati medijum koji sadrži serum, kako bi serum inhibirao tripsin (sadrži alfa1- antitripsin) i prekinuo njegovo proteolotičko dejtvo ► suspenziju ćelija iz posude preneti u sterilnu epruvetu, zatvoriti je i izneti iz laminara ► epruvetu staviti u centrifugu 5 min na 1800 rpm ► zapaža se da su se ćelije izdvojile u vidu taloga na dnu epruvete ► epruvetu uneti u laminar i odliti medijum iznad taloga ► na talog ćelija sipati 1-3 ml medijuma i resuspendovati ćelije ► izbrojati ćelije u komori hemocitometra i izračunati broj ćelija ► ćelije dalje koristiti u željenom broju, za dalju propagaciju ili za eksperiment

Problem kontaminacije: hemijska kontaminacija ► i esencijalni nutritijenti u visokoj koncentraciji mogu postati potencijalno toksični ► dejonizovana voda (MilliQ) je veoma agresivan rastvarač tako da može da unese u medijum potencijalno toksične metalne jone sa staklenih površina ili pipeta koji se talože na posuđu tokom njihovog pranja ► endotoksini- supstance koje sadrže lipopolisaharide (proizvode gram negativnih bakterija) se uglavnom mogu naći u serumu, vodi i drugim aditivima za ćelijsku kulturu, posebno onima koji se dobijaju fermentacijom mikroorganizama ► ostaci hemikalija, uz deterdžente za pranje posuđa ili aluminijum iz aluminijumske folije mogu biti izvor hemijske kontaminacije ► HEPES, riboflavin ili triptofan podležu fotoaktivaciji pri čemu nastaje vodonik peroksid i slobodni radikali koji su toksični za ćelije ► mešavina gasova koja struji kroz inkubator može da sadrži toksične nečistoće naročito ulja ili druge gasove kao što je CO zato treba voditi računa o ispravnosti CO2 boce

biološka kontaminacija ► bakterije – zamućen medijum, pad pH, sitne pokretne granule ► virusi – ređa pojava, teško uočljiva, detekcija imunobojenjem, ELISA, PCR ► buđ – uočljiv micelijum na površini medijuma ► gljivice – sferne partikule koje pupe, pad pH pri jakoj infekciji ► mikoplazme – teško uočljiva, menjaju metabolizam i ponašanje kulture, detekcija fluorescentnim bojenjem, imunobojenjem, ELISA, PCR, mikrobiološkim esejima ► druge ćelijske linije – ’’cross’’ kontaminacija

PROCEDURA PRESAĐIVANJA ĆELIJA ADHERENTNE ĆELIJE ĆELIJE U SUSPENZIJI uklanjanje medijuma brojanje ćelija u malom uzorku ispiranje puferom (PBS) zasejavanje u svež medijum odlepljivanje ćelija – mućkanjem, grebanjem (mehanički) enzimatski (tripsin) prebacivanje ćelija u tube centrifugiranje resupendovanje i brojanje ćelija zasejavanje u svež medijum