«ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΝΕΧΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΣΤΗΝ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ» ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΝΕΧΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΣΤΗΝ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ» ΜΟΥΡΜΟΥΡΑ ΕΥΑΝΘΙΑ

ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Αποτελεί σημαντικό βήμα για την κύηση που προϋποθέτει : Ωρίμανση του γονιμοποιημένου εμβρύου στο στάδιο της βλαστοκύστης. Υποδεκτικό ενδομήτριο. Πραγματοποιείται σε 3 φάσεις : 1η φάση : αφορά τη σταθερή προσκόλληση της βλαστοκύστης στο ενδομήτριο. 2η φάση : περιλαμβάνει τη δράση παρακρινικών παραγόντων για τη σταθεροποίηση της προσκόλλησης. 3η φάση : αφορά τη διείσδυση του εμβρύου.

ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Πραγματοποιείται την 20η – 23η ημέρα του κύκλου, «παράθυρο εμφύτευσης» . Χαρακτηριστικά της : Η δράση της οιστραδιόλης (Ε2) στην παραγωγική φάση του κύκλου που προετοιμάζει το ενδομήτριο για φθαρτοποίηση από την προγεστερόνη (P4) κατά την εκκριτική φάση. Η εμφάνιση των πινοποδίων κατά το παράθυρο της εμφύτευσης. Martel et al., 1987 Van Mourik et al., 2009

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΜΒΑΛΛΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Α)ΟΡΜΟΝΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΧΟΡΙΑΚΗ ΓΟΝΑΔΟΤΡΟΠΙΝΗ (hCG) Επάγει κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες για την εμφύτευση όπως τον ανασταλτικό παράγοντα της λευχαιμίας ( LIF ). Τροποποιεί το ανοσολογικό περιβάλλον της μήτρας. ΕΚΛΥΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΤΗΣ ΚΟΡΤΙΚΟΤΡΟΠΙΝΗΣ (CRH) Συμμετέχει στη φθαρτοποίηση του ενδομητρίου. Ρυθμίζει την έκφραση κυτοκινών για την εμφύτευση. ΓΛΥΚΟΔΕΛΙΝΗ Αυξάνεται σταθερά στην 2η φάση του κύκλου παράλληλα με την Ρ4 δείκτης για την υποδεκτικότητα του ενδομητρίου. ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝΔΙΝΕΣ (PGs) Ποντίκια με έλλειψη των ενζύμων COX2 και cPLA2 ελαττωμένη σύνθεση των PGs ελαττωματική εμφύτευση

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΜΒΑΛΛΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Φονικά κύτταρα (ΝΚ) : σε ποντίκια ανεπάρκειά τους αποτυχία εμφύτευσης. Μακροφάγα : In vitro μελέτη έδειξε ότι η τροφοβλάστη μπορεί να τα ανακτήσει και διεγείροντάς τα παράγει κυτοκίνες για την εμφύτευση. Τ-λεμφοκύτταρα : ΤΗ2 αντίδραση υπερπαραγωγή των IL-4, IL-6, IL-10 επιτυχία εμφύτευσης. ΤΗ1 αντίδραση παραγωγή IFN-γ και TNF-α παραγωγή κυτταροτοξικών κυττάρων αποτυχία εμφύτευσης. 7) ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ Wnt Wnt ligand-binding proteins : επηρεάζονται από υψηλά επίπεδα Ε2 μετά από ωοθηκική διέγερση χαμηλότερα ποσοστά εμφύτευσης και κύησης. Dickkopf proteins : ένεση antisense ολιγονουκλεοτιδίου Dkk-1 σε ποντίκια την 3η ημέρα γονιμοποίησης αποτυχία εμφύτευσης.

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΜΒΑΛΛΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Β)ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMP) Κυτοκίνες π.χ LIF, IL-11, M-CSF Μόρια προσκόλλησης π.χ ιντεγκρίνες, σελεκτίνες Αυξητικοί παράγοντες π.χ HB-EFG, IGF

ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΙΝΑΣΕΣ (MMP) ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥΣ Ενδοπεπτιδάσες που επηρεάζουν τις μεταβολές στο φυσικό κύκλο μορίων όπως το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες. Ρυθμίζουν την προσκόλληση κυττάρων. Εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του εξωκυττάριου χώρου. Παράγοντες-κλειδιά για την αγγείωση και τη φθαρτοποίηση του ενδομητρίου. Guzeloglou-Kayisli et al., 2007

ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΙΝΑΣΕΣ (MMP) ΚΑΙ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Σε ποντίκια : Έλλειψη των παραγόντων Ets-2 (μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει τις MMP) και MMP-9 αποτυχία της εμφύτευσης. Υπερέκφραση των αναστολέων TIMP-1 και TIMP-2 αποτυχία εμφύτευσης. Έκφραση των αναστολέων των ΜΜΡ (ΤΙΜΡ) στο τοίχωμα της μήτρας εξασθένηση της διείσδυσης της τροφοβλάστης in vitro. Huang., 2007 Στον άνθρωπο : Ενδείξεις για το ρόλο της ισορροπίας ΜΜΡ-ΤΙΜΡ στην εμφύτευση χωρίς να έχει διευκρινιστεί ο μηχανισμός ρύθμισης των γονιδίων τους.

ΚΥΤΟΚΙΝΕΣ Γλυκοπρωτεΐνες που ενέχονται στην εμφύτευση. Προσδένονται σε υποδοχείς Σχηματισμός ετεροδιμερούς με την gp130 Μεταγωγή σήματος μέσω JAK/STAT μονοπατιού

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-11 (IL-11) Α)ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Εκφράζεται σε επιθηλιακά και κύτταρα του στρώματος της μήτρας. Παρουσιάζει τα μέγιστα επίπεδα κατά τη φθαρτοποίηση. Μειώνει την παραγωγή της κυτοκίνης TNF-α από επιθηλιακά κύτταρα του ενδομητρίου. Ο υποδοχέας της, IL-11Rα, εκφράζεται από τη βασική στοιβάδα και αδένες του επιθηλίου χωρίς κυκλικές μεταβολές. Guzeloglou-Kayisli et al., 2007

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-11 (IL-11) Β)ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Σε ποντίκια : IL-11 Knock-out και IL-11Ra Knock-out πειράματα φθαρτοποίηση και εμφύτευση με προβλήματα υπογονιμότητα. Στον άνθρωπο : Συμμετέχει στη φθαρτοποίηση μέσω της δράσης της στα κύτταρα του στρώματος. Δεν έχουν βρεθεί υποδοχείς της σε ανθρώπινο έμβρυο, αν και αυτό παράγει IL-11 κατά τη διείσδυση της τροφοβλάστης. Robb et al., 1998 Makrigiannakis and Minas., 2007

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-6 (IL-6) Α)ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Προφλεγμωνώδης κυτοκίνη που παράγεται από κύτταρα του στρώματος και το επιθήλιο του ενδομητρίου στην εμφύτευση. Κυκλικές μεταβολές στα επίπεδά της με μέγιστα στο παράθυρο της εμφύτευσης. Συγκεκριμένα : Χαμηλά επίπεδα της IL-6 στην παραγωγική φάση του κύκλου που αυξάνονται σταθερά στην εκκριτική φάση ώστε να μειωθούν πάλι στο τέλος του κύκλου.

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-6 (IL-6) Β)ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Στα ποντίκια : Έλλειψη της IL-6 μειωμένη γονιμότητα και μειωμένα ποσοστά εμφύτευσης. Στον άνθρωπο : Τα επίπεδά της δεν σχετίζονται απόλυτα με περιπτώσεις υπογονιμότητας. Sherwin et al., 2002 Χαμηλή παραγωγή της αποβολές. Ανεπάρκειά της μείωση του ποσοστού εμφύτευσης. Paiva et al., 2009 Van Mourik et al., 2009

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-1 (IL-1) Ρυθμίζει την έκφραση μορίων στο ενδομήτριο όπως IL-6, IL-8, MMP-1, TIMP-1. Διεγείρει την παραγωγή της λεπτίνης και του ανασταλτικού παράγοντα της λευχαιμίας ( LIF ). Αυξάνει την έκφραση της ιντεγκρίνης β3. Σε ποντίκια : Ανεπάρκεια της IL-1 επηρεάζει την αναπαραγωγή. Αναστολή της δράσης της ενισχύοντας ανταγωνιστή της αποτυχία της εμφύτευσης. Στον άνθρωπο : Η βλαστοκύστη εκφράζει IL-1. Simon et al., 1994 Abbondanzo et al., 1996

ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-12 (IL-12)/ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-18 (IL-18) Αυξάνει την παραγωγή της ΤΗ1 κυτοκίνης. Χαμηλά επίπεδα της έκφρασής της αποτυχία εμφύτευσης μετά από θεραπεία IVF. Laird et al., 2007 Makrigiannakis and Minas., 2007 ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-18 (IL-18) Γυναίκες με αποτυχία εμφύτευσης μετά από IVF ανώμαλη έκφραση του γονιδίου της. Έλλειψή της χαμηλά ποσοστά εμφύτευσης σε περιπτώσεις IVF. Ledee-Bataille et al., 2004

MACROPHAGE-COLONY STIMULATING FACTOR (M-CSF) Ρυθμίζει την παραγωγή και διαφοροποίηση των μακροφάγων. Σε ποντίκια : Θηλυκά ποντίκια ομοζυγωτικά για μεταλλάξεις του M-CSF χαμηλότερα ποσοστά εμφύτευσης. Στον άνθρωπο : αυξημένη παραγωγή του M-CSF στο σημείο εμφύτευσης και στην αρχή της εγκυμοσύνης. Kauma et al., 1991 Laird et al., 2007

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Α) ΣΕΛΕΚΤΙΝΕΣ - ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες με ρόλο στα πρώτα στάδια της εμφύτευσης. Υπάρχουν 3 μορφές : E-selectin που εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. P-selectin που εκφράζεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. L-selectin που εκφράζεται στα λευκοκύτταρα.

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Α) L-selectin - ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Σε ποντίκια : Αναστολή της δράσης της L-selectin μέσω των αντισωμάτων MECA-79 και HECA-452 ασθενής προσκόλληση της βλαστοκύστης. Fucuda and Sugihara., 2008 Van Mourik et al., 2009 Στον άνθρωπο : Αμφιλεγόμενα πειραματικά δεδομένα για τα ερωτήματα Υπάρχει όντως L-selectin στη βλαστοκύστή; Είναι απαραίτητη η L-selectin στην αναπαραγωγή; Γιατί ανεπάρκειά της σχετίζεται με στειρότητα;

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Β) ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ - ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Ετεροδιμερείς πρωτεΐνες που εντοπίζονται στο βασικό και αδενικό επιθήλιο. Lessey et al., 1992 Achache and Revel., 2006 Αυξημένη η έκφρασή τους στη μέση ωχρινική φάση δείκτες για το παράθυρο της εμφύτευσης. Διεγείρονται από την Ρ4 και αναστέλλονται από τα οιστρογόνα.

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Β) ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ - ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Στον άνθρωπο : Γυναίκες με φυσιολογικά επίπεδα ιντεγκρινών την 21η ημέρα του κύκλου διπλάσιο ποσοστό εμφύτευσης και κύησης μετά από IVF θεραπεία. Η ιντεγκρίνη ανβ3 αυξάνεται στο παράθυρο της εμφύτευσης δείκτης για την υποδεκτικότητα του ενδομητρίου σε IVF περιστατικά. Thomas et al., 2003

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Γ) ΚΑΝΤΕΡΙΝΕΣ Διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες με ρόλο στην εμφύτευση και στην ανάπτυξη του εμβρύου στα προεμφυτευτικά στάδια. Σε ποντίκια : Μεταλλάξεις της E-cadherin ελαττωματική εμβρυϊκή ανάπτυξη και αποτυχία εμφύτευσης. Στον άνθρωπο : Άγνωστος ο ρόλος της στην εμφύτευση παρόλο τα υψηλά επίπεδά της στην εκκριτική φάση του κύκλου. Rosales et al., 2005 Singh and Aplin., 2009

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Δ) ΜΟΥΚΙΝΕΣ - ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Εκφράζονται από επιθηλιακά κύτταρα του ενδομητρίου. Υψηλά επίπεδα στην εκκριτική φάση του κύκλου. Hey et al., 2003

ΜΟΡΙΑ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ Δ) ΜΟΥΚΙΝΕΣ - ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Σε ποντίκια/αρουραίους : Όταν το ενδομήτριο είναι υποδεκτικό η MUC-1 μειώνεται υπό την επίδραση της Ρ4. Απαραίτητη η MUC-1 στην εμφύτευση λόγω των υδατανθράκων της. Στον άνθρωπο : Στο παράθυρο εμφύτευσης η MUC-1 αυξάνεται υπό την επίδραση της Ρ4. Άγνωστος ο ακριβής μηχανισμός δράσης της στην εμφύτευση αν και δεδομένα δείχνουν ότι είναι αρνητικός παράγοντας γιατί εξαφανίζεται από τα σημεία εμφύτευσης.

ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Α) INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR (IGF) Συμμετέχει στην επικοινωνία εμβρύου-ενδομητρίου. Το σύστημά του περιλαμβάνει τον IGF (IGF-1 και IGF-2) και την IGFBP-1 (insulin-like growth factor binding protein). Ο IGF-2 ευνοεί την εμφύτευση και τη διείσδυση της τροφοβλάστης, ενώ IGFBP-1 αναστέλλει τη δράση του IGF-2. Αυξημένα επίπεδα της IGFBP-1 εμποδίζουν την πρόσδεση του IGF-2 στους IGF-1Rs υποδοχείς αποτυχία της εμφύτευσης.

ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Β) ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ –β (TGF-β) Εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα του ενδομητρίου και στο υποκείμενο στρώμα. Ando et al., 1998 Makrigiannakis and Minas., 2007 Στον άνθρωπο : Συμμετέχει στη δημιουργία περιβάλλοντος ανοσοανοχής στην εμφύτευση. Ρυθμίζει μόρια σημαντικά στην εμφύτευση όπως τον LIF και MMP-9. Herrler et al., 2003 Dimitriadis et al., 2005 Οι υποδοχείς του αυξάνονται όταν το ενδομήτριο γίνεται υποδεκτικό και μειώνονται με τη διείσδυση της τροφοβλάστης.

ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Γ) HEPARIN BINDING-EPIDERMAL GROWTH FACTOR (HB-EGF) Εντοπίζεται στα επιθηλιακά κύτταρα και στη μήτρα ποντικών την 4η ημέρα της γονιμοποίησης. Η έκφρασή του δεν επηρεάζεται από ορμόνες. Υψηλά επίπεδα HB-EGF όταν τα πινοπόδια είναι ανεπτυγμένα.

ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Γ) HEPARIN BINDING-EPIDERMAL GROWTH FACTOR (HB-EGF) Πρόσδεση του HB-EGF σε υποδοχείς ErbB1 και ErbB4 Διμερισμός Αυτοφωσφορυλίωση Ενεργοποίηση μονοπατιού MAPK κινασών Εικ : Απεικόνιση της σηματοδότησης μέσω HB-EGF στην εμφύτευση.

ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Γ) HEPARIN BINDING-EPIDERMAL GROWTH FACTOR (HB-EGF) Σε ποντίκια : Έμβρυο σταδίου 8 κυττάρων εκτέθηκε σε HB-EGF υψηλότερος ρυθμός ανάπτυξης και εκκόλαψης της διάφανης ζώνης. Ο HB-EGF προωθεί την ανάπτυξη της τροφοβλάστης in vitro. HB-EGF Knock-out αποτυχία εμφύτευσης. Στον άνθρωπο : Παρόμοια πειραματικά δεδομένα. Σημαντικός παράγοντας για την εμφύτευση.

ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (LIF) Προφλεγμωνώδης κυτοκίνη που προκαλεί διαφοροποίηση των μακροφάγων. Εκφράζεται στο βασικό επιθήλιο 6-9 ημέρες μετά το κύμα της LH με μέγιστα επίπεδα κατά το παράθυρο της εμφύτευσης. Aric et al., 1995 Dimitriadis et al., 2007 Van Mourik et al., 2009 Ενέχεται στη διαφοροποίηση και ανάπτυξη της τροφοβλάστης. Διεγείρει την έκφραση γονιδίων που εξαρτώνται από την P4. Σημαντικός για την ανάπτυξη της βλαστοκύστης αλλά όχι για τη βιωσιμότητά της!!

ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (LIF) Α)ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ Σε ποντίκια : LIF Knock-out πειράματα απουσία φθαρτοποίησης στειρότητα και αποτυχία εμφύτευσης. Stewart et al., 1992 Van Mourik et al., 2009 Σε πιθήκους : Χορήγηση από τη μήτρα μονοκλωνικού αντισώματος LIF μείωση του ποσοστού κυήσεων. Στον άνθρωπο : Μειώνεται στην όψιμη εκκριτική φάση σε γυναίκες με ανεξήγητη υπογονιμότητα. Ανεπάρκεια ή πολύ χαμηλά/υψηλά επίπεδα του LIF αποτυχία εμφύτευσης. Αναστολή της δράσης του LIF και/ή της IL-11 αποτυχία της εμφύτευσης.

ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ (LIF) Β)ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ Έλεγχος της ποσότητας των ανοσοκυττάρων του ενδομητρίου στην εμφύτευση. LIF Knock-out ποντίκια : μείωση μακροφάγων και αύξηση των ηωσινόφιλων και των NK κυττάρων. Paiva et al., 2009 Συμμετοχή στις αλληλεπιδράσεις φθαρτοποιημένων κυττάρων και τροφοβλάστης. Ενδείξεις για positive feedback-loop μεταξύ hCG και LIF. Sherwin et al., 2004 Εικ:Η επικοινωνία της τροφοβλάστης και ενδομητρίου (Α) πριν την εμφύτευση και (Β) αλληλεπίδραση φθαρτοποιημένων κυττάρων και τροφοβλάστη κατά την εμφύτευση.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ IL- 11 / 6 / 12 / 18 Ιντεγκρίνες HB-EGF LIF

Σας Ευχαριστώ