Εργαστήριο Πρωτεϊνικών Αλ/δράσεων Ι/ΠΡΕΤΕΑ, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα:«Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική», Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ, Δεκέμβριος 2012 Kυτταροκίνες Πλειοτροπική δράση και εξειδίκευση-υποδοχείς και επιτελεστικά μόρια Δημήτρης Μαστέλλος Εργαστήριο Πρωτεϊνικών Αλ/δράσεων Ι/ΠΡΕΤΕΑ, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»

Κορμός διάλεξης-διάρθρωση Γενικά χαρακτηριστικά κυτταροκινών-λειτουργικά γνωρίσματα Οικογένειες κυτταροκινών -υποδοχείς και προσδέτες Το παράδειγμα των υποδοχέων ιντερφερόνης (IFN) Χαρακτηρισμός του ενδοκυττάριας oδού σηματοδότησης μέσω JAK/STAT-μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις-επιτελεστικά μόρια-μηνύματα Ρύθμιση/αναστολή κυτταροκινών μέσω JAK/STAT -πρωτεΐνες SOCs Θεραπευτικές προσεγγίσεις με βάση κυτταροκίνες σε ανοσολογικές παθήσεις

Γενικά λειτουργικά γνωρίσματα Κυτταροκίνες-’υπερδραστικά’ μόρια Ασκούν βιολογική δράση σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις π.χ.~10-15 M Γενικά τοπική η δράση δράση τους αυτοκρινής παρακρινής Ενδοκρινής (ενίοτε) Διαμεσολαβούν πληθώρα αλληλεπιδράσεων πλειοτροπισμός Αλληλεπικαλυπτόμενη δράση μεταξύ μελών συνεργιστική / ανταγωνιστική δράση

Λειτουργικά γνωρίσματα Ισχυρή ανοσορυθμιστική δράση Σε συγκεντρώσεις ~10-15 Molar

Λειτουργικά γνωρίσματα Τοπική δράση αυτοκρινής παρακρινής ενδοκρινής

Λειτουργικά γνωρίσματα Πλειοτροπισμός Κοινή δράση συνέργεια ανταγωνισμός

Οικογένειες υποδοχέων κυτταροκινών

Κυτταροκίνες τάξης ΙΙ Ιντερφερόνες(IFN-α/β/γ/ω), IL-10, IL-22, IL-28 Χαμηλή αμινοξική ομολογία (<15-25%) Ομόλογη τριτοταγής δομή (μοτίβο 6 α-ελίκων) Ομόλογη δομή των υποδοχέων τους Πλειοτροπική δράση

Κυτταροκίνες τάξης ΙΙ Ο προσανατολισμός των α-ελίκων καθορίζει το αν οι κυτταροκίνες ασκούν τη βιολογική δράση τους ως μονομερή (αντιπαράλληλη διάταξη ελίκων) ή ομοδιμερή (διάταξη ελίκων υπό γωνία) κατά την πρόσδεση τους στον αντίστοιχο υποδοχέα (π.χ.η IFN-γ σχηματίζει ομοδιμερή λόγω δομής μονομερούς τύπου-V

Δομή υποδοχέων κυτταροκινών τάξης ΙΙ

Δομή υποδοχέων κυτταροκινών κλάσης ΙΙ Σχηματίζουν ετεροδιμερή που απαρτίζονται από δυο διαμεμβρανικές υπομονάδες Υψηλή ομολογία στη δομή του εξωκυττάριου τμήματος 2 περιοχές φιμπρονεκτίνης τύπου ΙΙΙ (σχηματίζουν τη ζώνη πρόσδεσης της κυτταροκίνης Κυστεϊνες σε συντηρημένες θέσεις (στις εξωκυττάριες περιοχές) Κυτοπλασματική περιοχή χαμηλής αμινοξικής ομολογίας Τα ετεροδιμερή του συμπλόκου υποδοχέα περιλαμβάνουν συνήθως μια υπομονάδα με κοντή κυτοπλασματική περιοχή και μία με μεγαλύτερο μήκος

Βιολογικές δράσεις κυτταροκινών κλάσης ΙΙ (Ιντερφερόνες) Αντι-ιϊκές δράσεις Ιογενείς λοιμώξεις επάγουν την έκφραση IFNs στα προσβεβλημένα κύτταρα (dsRNA) Ιντερφερόνες (α,β, γ)= επάγουν την μεταγραφή γονιδίων που αναστέλλουν τον πολ/σιασμό του ιού στον ξενιστή Πολλοί ιοί έχουν ενσωματώσει στο γονιδίωμα τους γονίδια κυτταροκινών κλάσης ΙΙ-τρόπος ‘αποφυγής’ ανοσολογικής απόκρισης Π.χ. Πολλοί ιοί κωδικοποιούν διαλυτούς υποδοχείς IFNR που δρουν ως αναστολείς που ανταγωνίζονται τη δέσμευση των φυσικών κυτταροκινών στους υποδοχείς τους

Βιολογικές δράσεις κυτταροκινών κλάσης ΙΙ Ανοσορυθμιστική δράση κυτταροκινών Η IL-10 ασκεί ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση αναστέλλοντας την παραγωγή TNF και IL-1 σε καταστάσεις οξείας ανοσιακής διέγερσης και φλεγμονής (π.χ. σε χορήγηση LPS στην κυκλοφορία) (IFN-γ=ισχυρή φλεγμονώδης δράση) Αντικαρκινική δράση Οι ιντερφερόνες α,β,ω είναι ισχυροί αναστολείς του κυτ. πολλαπλασιασμού-επάγουν την έκφραση αποπτωτικών γονιδίων (επιμόλυνση καρκινικών σειρών με αδενοϊούς που κωδικοποιούν την ΙL-24 προκαλεί διαταραχή BAX/Bcl-2 ισοζυγίου-απόπτωση)

Μεταγωγή ενδοκυττάριου σήματος μέσω υποδοχέων ιντερφερόνης Η οδός ‘JAK/STAT’

Μεταφορά μηνύματος -Δέσμευση κυτταροκίνης στον υποδοχέα -Διμερισμός υποδοχέα -Ενεργοποίηση JAK-φωσφορυλίωση υποδοχέα -Προσέλκυση STAT στη μεμβράνη-φωσφορυλίωση STAT-διμερισμός και μετατόπιση στον πυρήνα

Ρύθμιση ενεργότητας JAK/STAT οδού SOCS PIAS PTPs Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Ομοιοπολική τροποποίηση JAK/STAT πρωτεϊνών Ουμπικουτινιλίωση-πρωτεάσωμα Αποικοδόμηση

Ρύθμιση JAK κινασών Οι JAKs δεσμεύονται σε περιοχή πλούσια σε αμινοξέα Pro στην ενδοκυττάρια περιοχή των δύο υπομονάδων του υποδοχέα κυτταροκινών κλάσης ΙΙ (box1/box2 περιοχή ) -Οικογένεια JAK κινασών με ομόλογη δομή-ομόλογες περιοχές: JH1-7 -JH1-Περιοχή στο COOH-άκρο με ενεργότητα κινάσης –περιλαμβάνει 2 Tyr που φωσφορυλιώνονται κατόπιν δέσμευσης της κυτταροκίνης στον υποδοχέα

JAKs:Just another kinase 1 and 2… ‘Janus’ kinase….why?

Ρύθμιση ενεργότητας JAK κινασών μέσω τρανσ-φωσφορυλίωσης

Ρύθμιση ενεργότητας JAK κινασών μέσω πρωτεϊνών SOCS SOCS: Supressors of Cytokine Signaling -SH2 (Src-homogy domain) περιοχή-ευθύνεται για αλληλεπίδραση με μοτίβα p-Tyr σε άλλες πρωτεΐνες (pJAKs) -Αρνητική επανατροφοδότηση σήματος μέσω κυτταροκινών

Αναστολή JAK κινασών μέσω πρωτεϊνών SOCS Δέσμευση της SOCS1 στις p-JAK πρωτεΐνες (μέσω περιοχής SH2) και αναστολή δράσης τους Δέσμευση SOCS3 στον υποδοχέα και αναστολή δράσης JAK κινασών H CIS ανταγωνίζεται τη δέσμευση των STATs στον φωσφορυλιωμένο υποδοχέα Οι SOCS συμβάλλουν στην αποικοδόμηση των JAK πρωτεϊνών μέσω της οδού ουμπικουιτίνης/πρωτεασώματος

Οι SOCS δεσμεύονται μέσω της περιοχής SOCS box σε συστατικά του συμπλόκου της Ε3 λιγάσης της ουμπικουιτίνης Με αυτόν τον τρόπο οι JAK πρωτεϊνες που έχουν δεσμευτεί στις SOCS γίνονται στόχος ουμπικουιτινιλίωσης και εν συνεχεία οδηγούνται για αποικοδόμηση στο πρωτεάσωμα (ριβονουκλεο-πρωτεινικό σύμπλοκο με δράση ATP-εξαρτώμενης πρωτεάσης)

Κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες ρυθμίζουν την ενεργοποίηση των SOCS μέσω μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων-φωσφορυλίωση της SOCS3 επάγει την αποικοδόμησή της Οι SOCS παρουσιάζουν εξειδίκευση ως προς τις κυτταροκίνες που τις ενεργοποιούν και όχι ως προς τις JAK/STAT πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρούν Π.χ. Η ενεργοποίηση STAT3 παρατείνεται μετά από ενεργοποίηση SOCS3-/- μακροφάγων από ΙL-6 αλλά όχι από IL-10.

Ρύθμιση ενεργότητας JAK κινασών από PTPs (φωσφατάσες τυροσινο-κινασών) αποφωσφορυλίωση των JAK κινασών και συμβάλλουν στον τερματισμό της μετάδοσης ενδοκυττάριου σήματος μέσω της ενεργοποίησης υποδοχέων κυτταροκινών

Ρύθμιση ενεργότητας μεταγραφικών παραγόντων STAT Φωσφορυλίωση STATs σε Tyr -Διμερισμός STAT -Μετατόπιση στον πυρήνα -Πρόσδεση στο DNA

Ρύθμιση ενεργότητας μεταγραφικών παραγόντων STAT Φωσφορυλίωση STAT (STAT1,3,4,5) σε σερίνες (Ser) H φωσφορυλίωση των STAT πρωτεϊνών σε Ser συσχετίζεται με την βέλτιστη επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων που ρυθμίζονται από ιντερφερόνες Κινάσες που φωσφορυλιώνουν STATs σε Ser: ΜΑPK:Erk,p38, JNK, CAMK2 (Ca++)

Ρύθμιση ενεργότητας μεταγραφικών παραγόντων STAT PIAS: Protein Inhibitors of Activated Stats Περιοχή RLD-αλληλεπίδραση με DNA (RING-finger like Zn+2 binding domain) Περιοχή SAP-αλληλεπίδραση με περιοχές αγκυροβόλησης χρωματίνης στον πυρηνικό σκελετό (scaffold)-ρύθμιση μεταγραφής γειτονικών γονιδίων

Μηχανισμοί αναστολής STAT μέσω αλληλεπίδρασης με PIAS 2.Αλληλεπίδραση PIAS με δεακετυλάσες ιστονών και καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων που ρυθμίζονται από STATs 3. Kατάλυση της ομοιοπολικής τροποποίησης των STAT με προσθήκη ομάδων SUMO-αδρανοποίηση-αποικοδόμηση STAT

Μηχανισμοί αναστολής STAT μέσω αλληλεπίδρασης με PTPs Oι μεταγραφικοί παράγοντες STAT υφίστανται αποφωσφορυλίωση σε Tyr (και Ser) από ειδικές φωσφατάσες, τόσο στο κυτόπλασμα όσο και στον πυρήνα -Διαμερισματοποίηση φωσφατασών -εξειδίκευση φωσφατασών ως προς το υπόστρωμα

‘Σύζευξη’ κυτταροκινο-εξαρτώμενων οδών σηματοδότησης μέσω JAK/STAT Τα ανοσοκύτταρα υπόκεινται σε συνδυασμένη επίδραση πολλών κυτταροκινών Π.χ. Ανοσοενισχυτική ή Συνεργιστική δράση:Διέγερση με IFN-γ ευαισθητοποιεί τα κύτταρα στην επακόλουθη έκθεση τους σε IFN-α ή σε δεύτερη έκθεση τους σε IFN-γ

‘Σύζευξη’ κυτταροκινο-εξαρτώμενων οδών σηματοδότησης Ανταγωνισμός μεταξύ δύο κυτταροκινών έναντι του ιδίου κυττάρου-στόχου SOCS Οι IFNs ανταγωνίζονται τη δράση της IL-4 σε μονοκύτταρα: έκθεση σε IFNs›υπερέκφραση SOCS1›αναστολή ενεργοποίησης STAT6 από IL-4

Τροποποίηση ενδοκυττάριου σήματος ‘Σύζευξη’ JAK/STAT-εξαρτώμενων οδών σηματοδότησης με άλλες ανοσοδιεγερτικές οδούς Τροποποίηση ενδοκυττάριου σήματος NF-kB SOCS1

Φαρμακευτικές παρεμβάσεις στην κυτταροκινο-εξαρτώμενη ενδοκυττάρια σηματοδότηση-ανάπτυξη θεραπευτικών εργαλείων

Η Υπερέκφραση IL-6 συσχετίζεται με την παθολογία πολλαπλών ανοσολογικών διαταραχών

Χρήση μονοκλωνικών anti-IL-6 αντισωμάτων σε κλινικές δοκιμές

Ενδοκυττάρια σηματοδότηση μέσω διέγερσης του υποδοχέα IL-6R/gp130

Cytokine Therapies Suppression of TH-cell poliferation and TC-cell activation

Mechanisms of tumor-mediated immune evasion VEGF, IL-6 M-CSF Tumor antigens

T-reg cell expansion promotes tumor growth via immunosupression in tumor microenvironment