ΜΙΑ ΚΡΥΦΗ ΜΑΤΙΑ ΣΤΟ ΠΑΡΕΛΘΟΝ, ΝΕΟΙ ΟΡΙΖΟΝΤΕΣ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ ΜΟΥΣΕΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΙΣΤΟΡΙΑΣ ΚΡΗΤΗΣ UNIVERSITY OF CRETE NATURAL HISTORY MUSEUM OF CRETE ΑΡΧΑΙΟ DNA ΜΙΑ ΚΡΥΦΗ ΜΑΤΙΑ ΣΤΟ ΠΑΡΕΛΘΟΝ, ΝΕΟΙ ΟΡΙΖΟΝΤΕΣ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ Νίκος Πουλακάκης Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Βασιλικά Βουτών & Μουσείο Φυσικής Ιστορίας Κρήτης, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Λεωφ. Κνωσού, Τ.Θ. 2208, ΤΚ 71409, Ηράκλειο, Κρήτη, Ελλάδα

H τεχνολογική ανάπτυξη της Μοριακής Βιολογίας Αρχαίο DNA (aDNA) H τεχνολογική ανάπτυξη της Μοριακής Βιολογίας εύκολη και ταχύτατη αλληλούχιση DNA άνθιση στο χώρο της εξελικτικής Βιολογίας Ωστόσο… μόνο έμμεσες ενδείξεις για τις ιστορικές διαδικασίες που έχουν συμβάλει στην διαμόρφωση των αλληλουχιών DNA δηλαδή η Μοριακή Εξέλιξη είναι «παγιδευμένη» μέσα στο χρόνο

Αρχαίο DNA (aDNA) Αρχαίο DNA: Παράθυρο με θέα το παρελθόν σε νεκρούς οργανισμούς (σκελετούς, μούμιες) σε τμήματα τους (τρίχες, φτερά, φολίδες, σπέρματα, κουκούλια) ή σε προϊόντα τους (σάλιο, σπέρμα, αίμα, ουρία, περιττώματα) και το οποίο έχει υποστεί αυτολυτικές ή διαγενετικές διεργασίες ή άλλη μετατροπή.

Αρχαία Βιομόρια Η ανάκτηση βιολογικών μακρομορίων από αρχαιολογικά και παλαιοντολογικά ευρήματα. Οργανικά συστατικά διαφόρων οργανισμών έχουν απομονωθεί από πολύ καλά διατηρημένα απολιθώματα (Καινοζωικού και Μεσοζωικού): η διατήρηση και ανάκτηση αμινοξέων από ένα ψάρι της Δεβονείου περιόδου (360 εκ. χρ. πριν από σήμερα) (Abelson 1954) η μελέτη κολλαγόνου από διάφορα είδη θηλαστικών του Πλειστοκαίνου (Ηο 1966) η ανάκτηση γλυκοπρωτεϊνών από κέλυφος μαλακίου ηλικίας 80 εκ. χρ. (Weiner et al. 1976) η ανάκτηση κολλαγόνου από δεινόσαυρους της Ιουρασικής και Κρητιδικής περιόδου (Armstrong et al. 1983) η παρουσία διαφόρων λιπιδίων (λιπαρά οξέα, στεροειδή κ.α.) σε αρχαιολογικά ευρήματα (Evershed 1993)

Αρχαία Βιομόρια Η γνώση για τη διατήρηση πυρηνικών δομών και νουκλεϊκών οξέων έχει αποκτηθεί από τα μέσα του 20ου αιώνα. Η επιτυχής βλάστηση του καρπού του φυτού Canna sp.(είδος κρίνου) που συλλέχθηκε από ένα τάφο μίας αρχαιολογικής θέσης στη Santa Rosa de Tastil της Αργεντινής (550 π.Χ.) (Sivori et al. 1968).

Αρχαίο DNA (aDNA) Πρώτες μελέτες…

Αρχαίο DNA (aDNA) Ποιο είναι το θεωρητικό όριο διατήρησης του DNA; Παράγοντες που αναστέλλουν την δράση των νουκλεασών ξηρασία, χαμηλή θερμοκρασία και οι υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων Άλλοι μηχανισμοί καταστροφής του DNA οξείδωση, υδρόλυση, απαμίνωση και αποπουρίνωση (αδενίνη, γουανίνη) ακτινοβολία Hofreiter et al. 2001 Nature Reviews

1 εκατομμύριο χρόνια (σίγουρα όχι πέραν των 2 εκ. χρ.) Αρχαίο DNA (aDNA) Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις αλάτων, ουδέτερο pH και θερμοκρασία 15οC χρειάζονται 100.000 χρόνια για την υδρολυτική καταστροφή του DNA. Διατήρηση μορίων DNA (800bp) σε υδάτινο περιβάλλον (Pääbo & Wilson 1991) Προσπάθειες εκτίμησης του θεωρητικού ορίου επιβίωσης του DNA σε διάφορες θερμοκρασίες. Θεωρητικά το όριο ανέρχεται 1 εκατομμύριο χρόνια (σίγουρα όχι πέραν των 2 εκ. χρ.) Η επιβίωση του DNA εξαρτάται και από το τμήμα του οργανισμού από το οποίο προέρχεται.

Αρχαίο DNA (aDNA) Πηγές aDNA οι τρίχες, το δέρμα και τα απεκκρίματα για τα ζώα και το ξύλο, τα φύλλα και οι ρίζες για τα φυτά Ιδανικές πηγές Οστά Δόντια Σπόροι Η παρουσία υδροξυαπατίτη και η σύνδεσή του με το DNA υποδιπλασιάζει το βαθμό αποπουρίνωσης.

Αρχαίο DNA (aDNA) Αλληλουχία χλωροπλαστικού DNA από φύλλα του φυτού Magnolia sp., τα οποία είχαν διατηρηθεί σε ανοξικές συνθήκες σε αποθέσεις στην περιοχή Clarkia του Idaho (ΗΠΑ), ηλικίας 17 - 20 εκ. χρ. (Golenberg et al. 1990). Αν και αμφισβητείται αφού δεν έχει επαναληφθεί είχε το θετικό αποτέλεσμα της αναγκαστικής επανεκτίμησης της χρονικής κλίμακας για τη διατήρηση του aDNA «Εάν επιβεβαιωθεί η παραπάνω αλληλουχία, ανοίγει ο δρόμος για την ανάκτηση αλληλουχιών ανεξάρτητα της γεωλογικής ηλικίας και το όνειρο κάθε εξελικτικού βιολόγου για ένα ταξίδι πίσω στο χρόνο με στόχο τη δημιουργία του δέντρου της ζωής θα πάψει να ανήκει στη σφαίρα της φαντασίας»

Αρχαίο DNA (aDNA) Αν το DNA επιβιώσει  είναι τεμαχισμένο και χημικά τροποποιημένο. Μικρού μοριακού βάρους μόρια με μέγεθος που δεν υπερβαίνει τα 100 – 200 ζεύγη βάσεων. Αν και οι κατάλληλες ταφονομικές συνθήκες για τη διατήρηση aDNA είναι θεωρητικές, πιστεύεται ότι η ελάχιστη μεταφορά του υλικού μετά το θάνατο, ο γρήγορος ενταφιασμός, η χαμηλή θερμοκρασία, η ανοξία, το ουδέτερο pH, η έλλειψη νερού, το χαμηλό ιζηματογενές φορτίο και οι μικρές διαγενετικές επιδράσεις είναι παράγοντες που συμβάλουν στη διατήρηση των μακρομορίων.

Αρχαίο DNA (aDNA) Είδη ζώων από τα οποία έχει επιτευχθεί η ανάκτηση DNA. Hofreiter et al. 2001 Nature Reviews

Αρχαίο DNA (aDNA) Μαμούθ (Mammuthus primigenius), τότε και σήμερα. Η αναπαράσταση του σκελετού ενός μαμούθ από τη Σιβηρία (Paleontological Institute, Russian Academy of Sciences, Moscow) επί μιας προϊστορικής ζωγραφιάς σε ένα σπήλαιο στη Γαλλία (Φωτογραφία από Ulrich Joger, State Natural History Museum, Braunschweig, Germany). Hofreiter & Lister 2006 Current Biology Κατεψυγμένο Μαμούθ

Αρχαίο DNA (aDNA) Στρώμα άνθρακα Τα ιζήματα έχουν ενταφιαστεί σε βάθος τουλάχιστον 3 km και έχουν υποβληθεί σε θερμοκρασίες της τάξεως των 90 –95οC. Απίθανη η επιβίωση Τελικά: προϊόν επιμόλυνσης

Αρχαίο DNA (aDNA) Τα 9 κριτήρια αυθεντικότητας (2) Αρνητικοί έλεγχοι για εξαγωγή και PCR: έλεγχος μολύνσεων σε κάθε βήμα (3) Κατάλληλη ερευνητική παιδεία και συμπεριφορά: εξαιτίας της υποβάθμισης του DNA, ο επιτυχής πολλαπλασιασμός μεγάλων τεμαχίων DNA στην PCR πρέπει να αντιμετωπίζεται με προσοχή (4) Επαναληψιμότητα: πολλαπλές εξαγωγές και PCR (5) Κλωνοποίηση των προϊόντων*: εκτίμηση της καταστροφής του DNA (6) Ανεξάρτητη επανάληψη του πειράματος από άλλη ερευνητική ομάδα (7) Βιοχημική διατήρηση: διατήρηση άλλων βιομορίων που σχετίζονται με την επιβίωση του DNA (π.χ. ρακεμοποίηση αμινοξέων) (8) Ποσοτικοποίηση: μέσω competitive PCR ή Real-Time PCR για εκτίμηση του αριθμού των αρχικών μορίων στην αντίδραση (9) Συνοδά ευρήματα. Είναι τα συνοδά ευρήματα εξίσου καλά διατηρημένα; Υπάρχει ένδειξη επιμόλυνσης σε αυτά; * Το κριτήριο αυτό αμφισβητείται Ρακεμοποίηση Asp ως προς το μέγιστο μήκος DNA που ανακτάται (Poinar et al. 1996)

Αρχαίο DNA (aDNA) Αρχαίο DNA και άνθρωπος! Πως εξελίχθηκε ο σύγχρονος άνθρωπος; Πότε ξεκίνησε να χρησιμοποιεί εργαλεία; Πότε αναπτύχθηκε η ομιλία; Γιατί ο Homo erectus και ο σύγχρονος άνθρωπος άκμασαν, ενώ ο άνθρωπος του Νεάντερταλ εξαφανίστηκε; Τα τελευταία 4-5 χρόνια το aDNA έχει μπει σε μια νέα εποχή Δύο νέες τεχνολογίες η πολλαπλή PCR (multiplex PCR) η παράλληλη αλληλούχιση (Whole-Genome Shotgun Sequencing or parallel sequencing)

Αρχαίο DNA (aDNA) H πλήρης αλληλούχιση του mtDNA του μαμούθ (Μ. primigenius) Krause et al. 2006 Nature Χάρτης mtDNA του μαμούθ. Εσωτερικά είναι η θέση και το σχετικό μήκος των προϊόντων της πολλαπλής PCR. H αρχή της multiplex PCR και το αποτέλεσμά της.

Αρχαίο DNA (aDNA) Η αλληλούχιση 28 εκατομμυρίων βάσεων του μαμούθ (Μ. primigenius) Poinar et al. 2005 Science

Αρχαίο DNA (aDNA) Η αλληλούχιση 1 εκ. βάσεων του Νεάντερταλ Green et al. 2007 Nature Η αλληλούχιση 65.250 βάσεων του Νεάντερταλ Noonan et al. 2007 Nature "Illustration by Knut Finstermeier; Neanderthal reconstruction by the Reiss-Engelhorn-Museum Mannheim"

Αρχαίο DNA (aDNA) H πλήρης αλληλούχιση του mtDNA του Νεάντερταλ Green et al. 2008 CELL Φυλογενετικό δέντρο και χρόνοι απόκλισης των mtDNA αλληλουχιών του Νεάντερταλ και των σύγχρονων ανθρώπων

Αρχαίο DNA (aDNA)

Αρχαίο DNA (aDNA) Ο Νεάντερταλ – το τελευταίο ανθρώπινο είδος που εξαφανίστηκε – ήταν ικανός να μιλάει και αν ναι πόσο καλά; FOX2P γονίδιο που σχετίζεται με την ανθρώπινη ομιλία Krause et al. 2007 Current Biology

Αρχαίο DNA (aDNA) Προσοχή ο κίνδυνος της επιμόλυνσης παραμένει! Hunter 2006 EMBO Rep

Περιορισμένες μελέτες κυρίως σε Αρχαίο DNA (aDNA) Τι γίνεται στον ελληνικό χώρο; Περιορισμένες μελέτες κυρίως σε Πλειστοκαινικά θηλαστικά (ελέφαντες και ελάφια) και Ιστορικά αντικείμενα (περγαμηνές)

Η φυλογένεση της οικογένειας των ελεφάντων Elephantidae Αρχαίο DNA (aDNA) Η φυλογένεση της οικογένειας των ελεφάντων

Αρχαίο DNA (aDNA) Η φυλογενετική γραμμή του γένους Mammuthus Η φυλογενετική γραμμή του γένους Elephas

Αρχαίο DNA (aDNA) Οι ελέφαντες στην Μεσόγειο εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια του μέσου και ανώτερου Πλειστόκαινου.

Τα νάνα ελεφαντοειδή της Μεσογείου Αρχαίο DNA (aDNA) Τα νάνα ελεφαντοειδή της Μεσογείου Νησιά Αιγαίου Elephas sp. Τήλος E. antiquus falconeri Σαρδηνία Mammuthus lamarmorae Σικελία – Μάλτα Elephas falconeri Elephas mnaidriensis Elephas melitensis Κύπρος Elephas cypriotes Κρήτη Elephas creticus

Αρχαίο DNA (aDNA) Στρατηγική πολλαπλής PCR Αρχαίες αλληλουχίες που ανακτήθηκαν Species/subspecies Locality Material Age Acc No Elephas cypriotes Cyprus (Akrotiri-Aetokremnos)1 Vertebra (axis) 10,000 y.a. DQ329148 (252bp) Elephas maximus asurus Iraq (Kish)2 Molar 4,200 y.a. DQ329149 (256bp) Elephas antiquus falconeri Greece (Tilos, Charkadio cave)3 Rib 17,000 y.a. DQ329147 (258bp) Elephas creticus Greece (Crete, Cape Meleka)4 ~800,000 y.a. (43bp) 1- Kourion Museum, Episkopi, Cyprus, FN136 2- Department of Anthropology, The Field Museum, Chicago, FM 236234 3- Natural History Museum of Crete, University of Crete (NHMC 20.2.2.1) 4- Natural History Museum of Crete, University of Crete (NHMC 20.1.2.30) 43bp τμήμα του νάνου ελέφαντα της Κρήτης

Αρχαίο DNA (aDNA) Φυλογενετικό δέντρο των Elephantidae βάσει του κυτοχρώματος β. (νάνες μορφές) Poulakakis et al. 2002 J. Molecular Evolution Poulakakis et al. 2006 Biology Letters

Αρχαίο DNA (aDNA)

Αρχαίο DNA (aDNA) Περγαμηνές και άλλα ιστορικά έγγραφα Χιλιάδες βιβλία και χειρόγραφα, κυρίως της Μεσαιωνικής Ευρώπης, διατηρούνται μέχρι σήμερα, όμως οι ειδικοί δυσκολεύονται να βεβαιώσουν για πολλά από αυτά που και πότε δημιουργήθηκαν. Poulakakis et al. 2007 J. Αrchaelogical Science

H ανάλυση aDNA ρίχνει φως στην ιστορία των γιγάντιων χελωνών των Galápagos. Poulakakis et al. 2008 Historical DNA analysis reveals living descendants of an Extinct Species of Galápagos Tortoise PNAS, 105, 15464-15469

Αρχαίο DNA και διαχείριση Ο ρόλος των μουσειακών συλλογών Οι μουσειακές συλλογές είναι η μόνη πηγή δειγμάτων για εξαφανισμένα taxa. “… are to biodiversity research what genome databases and cell lines are to genomics” Butler et al. 1998 Nature

Αρχαίο DNA και διαχείριση Γενετική Διαχείριση Ταξινομικές αμφιβολίες Διάσωση λανθασμένης «μονάδας» Η σωστή ταξινόμηση είναι εξαιρετικά κρίσιμη για τη διατήρηση κινδυνεύοντων ή τρωτών ταξινομικών μονάδων “Bad taxonomy can kill -- or, rather, bad taxonomy can even kill what we don't intend to kill” M. Novacek

Αρχαίο DNA και διαχείριση Γιγάντιες χελώνες των Galápagos (Geochelone spp. ή Chelonoidis spp.)

Αρχαίο DNA και διαχείριση Παραμένουν τρωτές σε όλη την έκταση της κατανομής τους (IUCN 2006). Πληθυσμοί τους εντοπίζονται σε 6 νησιά. Isabela Santiago Pinzon Santa Cruz Española San Cristobal

Αρχαίο DNA και διαχείριση 15 taxa έχουν προσδιοριστεί (είδη ή υποείδη) 11 αρτίγονα taxa (απειλούμενα από τον άνθρωπο) Η τρέχουσα ταξινομική βασίζεται σε μορφολογικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών (σχήμα χέλιου).

Σχήμα σέλας (Saddle back) Αρχαίο DNA και διαχείριση “ Captain Porter has described those from Charles and from the nearest island to it, namely Hood Island, as having their shells in front thick and turned up like a Spanish saddle, whilst the tortoises from James Island are rounder, blacker, and have a better taste when cooked” Charles Darwin The Voyage of the Beagle 1845 Voice: Derek Briggs Σχήμα σέλας (Saddle back) Σχήμα θόλου (Dome) Ποικιλομορφία χέλιου (καβούκι)

Αρχαίο DNA και διαχείριση Η ταξινόμηση και οι εξελικτικές τους σχέσεις Caccone et al. (1999) PNAS Caccone et al. (2002) Evolution Ciofi et al. (2002) Molecular Ecology Beheregaray et al. (2003) Science Beheregaray et al. (2004) PNAS Caccone et al. (2004) MPE Russello et al. (2005) Biology Letters Russello et al. (2007) Current Biology Rusello et al. (2007) Animal Conservation Αμοιβαία μονοφυλετικές ομάδες σε όλα τα νησιά Εξαίρεση: το νησί Isabela

Αρχαίο DNA και διαχείριση Στόχος: Ο προσδιορισμός της εξελικτικής προέλευσης και η κατανόηση της ιστορίας των 4 εξαφανισμένων πληθυσμών (μουσειακά δείγματα). Floreana Santa Fe Fernandina Rabida Με τη χρήση: αλληλουχιών mtDNA (περιοχή ελέγχου, CR) και μικροδορυφορικών πυρηνικών τόπων (10)

Αρχαίο DNA και διαχείριση Λήψη μουσειακών δειγμάτων

Αρχαίο DNA και διαχείριση Μουσειακή συλλογή Γεωγραφική προέλευση Αρ. δειγμάτων MCZ 1 Floreana 16 AMNH 2 24 Santa Fe 12 Fernandina CAS 3 Rabida 1Museum of Comparative Zoology; 2American Museum Natural History; 3California Academy of Science Rabida = 2 Santa Fe = 12 Fernandina = 1 Floreana = 40

Αρχαίο DNA και διαχείριση Προφυλάξεις – Ελαχιστοποίηση μολύνσεων Τουλάχιστον 2 ανεξάρτητες εξαγωγές για κάθε δείγμα και 2 «αρνητικοί» έλεγχοι παράλληλα με κάθε αντίδραση PCR για τον έλεγχο μόλυνσης.

Αρχαίο DNA και διαχείριση Δέντρο Bayesian Inference βάσει των αλληλουχιών CR mtDNA (mean ln=-3343.21). elephantopus

Αρχαίο DNA και διαχείριση

“Alien” ή “non-native” ή αλλόχθονα άτομα Αρχαίο DNA και διαχείριση PBL16 και PBR12 “Alien” ή “non-native” ή αλλόχθονα άτομα Διαφέρουν κατά 17-32 νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις από τα υπόλοιπα άτομα του νησιού Isabela, 2-9 υποκαταστάσεις από τους απλότυπους του κλάδου της Floreana.

Αρχαίο DNA και διαχείριση Περαιτέρω διερεύνηση της εξελικτικής ιστορίας της Floreana και των αλλόχθονων (“non-native”) ατόμων μέσω της ανάλυσης της ποικιλότητας 10 ειδικών για το είδος μικροδορυφορικών τόπων. Σύγκριση με γενετική βάση που περιλαμβάνει 336 άτομα όλων των αρτίγονων πληθυσμών των γιγάντιων χελωνών των Galápagos.

Αρχαίο DNA και διαχείριση Bayesian ανάλυση συνάθροισης (STRUCTURE) αποκάλυψε K=14 ως τον «αληθινό» αριθμό ομάδων. 11 από τα 13 “non-native” άτομα της Isabela δείχνουν ισχυρή συσχέτιση με τα άτομα της Floreana παράμετρος q (συντελεστής συμμετοχής, membership coefficient) = 0.706-0.967

Αρχαίο DNA και διαχείριση HYBRIDLAB: προσομοίωση πατρικών και υβριδικών γονοτύπων 500 άτομα για κάθε πατρικό πληθυσμό και για τα υβρίδια F1, F2 και B2 (ανάδρομη διασταύρωση) Πατρικοί πληθυσμοί Floreana, Volcano Wolf, Volcano Darwin 2.Floreana, Santa Cruz 3.Floreana, Santa Cruz, Roca Union, RU

Αρχαίο DNA και διαχείριση

Αρχαίο DNA και διαχείριση Τα δεδομένα του μιτοχονδριακού και πυρηνικού DNA εισηγούνται την υβριδική προέλευση των “non-native” ατόμων της Isabela. Απόγονοι ενός γεγονότος υβριδισμού μεταξύ αυτόχθονων ατόμων της Floreana και της Isabela. Πληθυσμοί PBR και PBL Διατηρούν μορφολογία σέλας (saddlebacked) 40% του PBR έχουν μικτή γενεαλογία εκτιμώμενο πληθυσμιακό μέγεθος (1000-2000) Σημαντική πηγή ατόμων σε ένα πρόγραμμα διασταυρώσεων, όπου επιλεγμένες διασταυρώσεις μπορεί να συμβάλουν στην «επαναφορά» της γενετικής ακεραιότητας του εξαφανισμένου πληθυσμού της Floreana.

Αρχαίο DNA και διαχείριση Μέσω της χρήσης τεχνικών aDNA είναι εφικτή η ενσωμάτωση μουσειακών δειγμάτων σε γενετικές μελέτες εξαφανισμένων, κινδυνευόντων και τρωτών οργανισμών επιτρέποντας τον καθορισμό της γενετικής δομής των εξαφανισμένων πληθυσμών επανεκτιμώντας την ταξινομική τους κατάσταση και θέτοντας προτεραιότητες για διαχειριστικές πράξεις Π.χ. για τις χελώνες των Galápagos Επαναπροσδιορισμός των διαχειριστικών πρακτικών για τη διατήρηση αυτών που μένουν και δυνητικά την αναβίωση αυτών που έχουν χαθεί εξαιτίας του ανθρώπου.

Αρχαίο DNA Η ανάκτηση DNA από μουσειακές συλλογές και απολιθώματα Πλειστοκαίνου έχει θέσει νέες βάσεις για την μελέτη της εξελικτικής ιστορίας των ειδών και τη γενετική των πληθυσμών του παρελθόντος. Μια ιδιαίτερα συναρπαστική ανάπτυξη θα αποτελέσει η ανάλυση DNA από απολιθωμένες κοπρόλιθους, αφού θα δώσει πληροφορίες για τη δίαιτα και ως εκ τούτου για την ηθολογία εξαφανισμένων οργανισμών. Κοπρόλιθος ηλικίας 20.000 χρόνων. Hofreiter et al. 2001 Nature Reviews

Αρχαίο DNA Κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη μεθόδων που θα απομακρύνουν ή επιδιορθώνουν τις χημικές καταστροφές του αρχαίου DNA. Δέκατη εντολή θα πρέπει να προστεθεί στη λίστα με τα 9 κριτήρια: «Ερμήνευσε την ακρίβεια των δεδομένων σου μέσα από μια κριτική θεώρηση όλων των διαθέσιμων πληροφοριών»

Σας ευχαριστώ