ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ

Αν και το φωτονικό μικροσκόπιο και το μικροσκόπιο φθορισμού επιτρέπουν την εξέταση μονιμοποιημένων και ζωντανών δειγμάτων, επιτρέποντας την παρατήρηση μιάς δυναμικής διαδικασίας, υπάρχουν και κάποιοι περιορισμοί στην χρήση τους. Μια από τις κύριες δυσκολίες είναι η έλλειψη ευκρίνειας λόγω του θορύβου που προκύπτει από δομές που δεν βρίσκονται στο εστιακό πεδίο. Σε αυτές τις περιπτώσεις φωτίζεται και προσλαμβάνεται οπτική πληροφορία όχι μόνο από το επίπεδο εστίασης αλλά και επίπεδα πάνω και κάτω από αυτό με αποτέλεσμα η εικόνα να μην έχει την βέλτιστη αντίθεση και ανάλυση.

Τι είναι φθορισμός; Αν κάποιo μόριο απορροφήσει φως, μπορείτε να δείτε φως διαφορετικού χρώματος που εκπέμπεται από αυτό. Αυτό είναι φθορισμός. Το μόριο απορροφά υψηλή φωτεινή ενέργεια (π.χ., μπλε). Αυτό αυξάνει την ενέργεια του (κορυφαία μαύρη γραμμή,«διεγερμένο" μόριο). Ένα μέρος της ενέργειας από το μπλε φωτόνιο χάνεται (αντιπροσωπεύεται από το κόκκινο βέλος). Το μόριο στη συνέχεια εκπέμπει ένα φωτόνιο με λιγότερη ενέργεια, π.χ., πράσινο. Fluorescein είναι μια κοινή χρωστική ουσία που δρα ακριβώς με τον τρόπο αυτό, εκπέμπει πράσινο φως, όταν απορροφήσει μπλε φως διέγερσης. Το χρώμα του εκπεμπόμενου φωτός εξαρτάται από το υλικό, και παρομοίως το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης εξαρτάται από το υλικό.

Πως δουλεύει ένα μικροσκόπιο φθορισμού; Υποθέστε ότι το φως διέγερσης να είναι βιολετί, και το εκπεμπόμενο φως κόκκινο. Το μικροσκόπιο χρησιμοποιεί ένα διχροϊκό καθρέπτη (διχρωμικό). Αυτός ο καθρέφτης αντανακλά φως με μήκος κύματος μικρότερο μιας τιμής και επιτρέπει περάσει φως με μήκος κύματος μεγαλύτερο από αυτή την τιμή. Έτσι μάτι μας βλέπει μόνο το εκπεμπόμενο από την φθορίζουσα χρωστική κόκκινο φως, αντί να δει διάσπαρτα μωβ φως. Αυτό το είδος μικροσκοπίας φθορισμού είναι γνωστό ως επιφθορισμός, και χρησιμοποιεί τον φακό του μικροσκοπίου για να φωτίζει το δείγμα (αντί φωτισμό του δείγματος από την άλλη πλευρά, η οποία είναι τρανς-φθορισμός).

Πως δουλεύει ένα μικροσκόπιο φθορισμού; Το δείγμα φωτίζεται και διεγείρεται, αν και σε διοαφορετικό βαθμό, ολόκληρο και σε κάποιο βάθος και αντανακλά προς τα πίσω φως από σημεία που βρίσκονται σε διάφορα επίπεδα πάνω και κάτω από το εστιακό σημείο διέγερσης. Ως αποτέλεσμα η εικόνα που βλέπουμε δεν μπορεί να είναι ευκρινής.

Πως θα μπορούσε να λυθεί αυτό το πρόβλημα; Φανταστείτε ότι έχουμε κάποιες φακούς μέσα στο μικροσκόπιο, που εστιάζουν το φως από ένα εστιακό σημείο του φακού σε ένα άλλο σημείο (μπλε ακτίνες φωτός). Οι κόκκινες ακτίνες του φωτός αντιπροσωπεύουν το φως από ένα άλλο σημείο στο δείγμα, το οποίο δεν βρίσκεται στο σημείο εστίασης του φακού, αλλά παρ 'όλα αυτά μπορούμε να το δούμε από τους φακούς του μικροσκοπίου. (Σημειώστε οι κόκκινες και μπλε ακτίνες στην εικόνα δεν είναι διαφορετικά μήκη κύματος φωτός). Δηλαδή, βλέπουμε και το μπλέ και το κόκκινο.

Πως δουλεύει ένα συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού; Πως δουλεύει ένα συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού; Όμως εμείς θέλουμε να βλέπουμε μόνο το φως που αντανακλάτεται από το μπλε σημείο, δηλαδή, το σημείο στο οποίο εστιάζει ο φακός. Αν βάλουμε ένα διάφραγμα με μια οπή στην άλλη πλευρά του συστήματος φακών, στο σημείο εστίσης των ακτίνων που αντανακλώνται από το μπλέ σημείο, τότε όλο το φως από το μπλε σημείο θα περάσει μέσα από αυτή την οπή (pinhole). Ωστόσο, το μεγαλύτερο μέρος του φωτός από το κόκκινο σημείο δεν περνάει από την οπή. Έτσι απορίπτεται το μεγαλύτερο μέρος από το κόκκινο φως και αυξάνεται η ευκρίνεια της εικόνας.

Πως δουλεύει ένα συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού; Επειδή η εικόνα από το σημείο εστίασης του αντικειμενικού φακού του μικροσκοπίου σχηματίζεται στην οπή, το εστιακό σημείο και η οπή ονομάζονται «συζυγά» σημεία . Και επειδή η οπή είναι συζηγής με το εστιακό σημείο του φακού η οπή είναι συνεστιακή και η μικροσκοπία συνεστιακή.

Πως δουλεύει ένα συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού; Λέιζερ, που προσφέρει υψηλές εντάσεις, χρησιμοποιείται για να διεγείρεται το δείγμα Το φως λέιζερ (μπλε) ανακλάται από έναν διχρωϊκό καθρέφτη. Από εκεί, το λέιζερ χτυπά δύο κάτοπτρα τα οποία είναι τοποθετημένα σε κινητήρες που σαρώνουν με το λέιζερ ολόκληρη την επιφάνεια του δείγματος. Η χρωστική του δείγματος φθορίζει, και το εκπεμπόμενο φως (πράσινο) κατευθύνεται από τους ίδιους καθρέφτες στον διχρωματικό καθρέφτη και εστιάζεται στην οπή. Το φως που περνά μέσα από την οπή ανιχνεύεται και ενισχύεται από ένα φωτοπολλαπλασιαστή.

Ποια είναι τα πλεονεντήματα από την χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου? Το συνεστιακό μικροσκόπιο είναι πραγματικά αποτελεσματικό στην απόρριψη φωτός που δεν προέρχεται από το σημείο εστίασης. Το πρακτικό αποτέλεσμα είναι ότι η εικόνα προέρχεται από μια λεπτή τομή του δείγματος (έχουμε μικρό βάθος πεδίου). Με τη σάρωση πολλών λεπτών τομών, από το δείγμα σας, μπορείτε να χτίσετε μια πολύ καθαρή τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος. Επίσης, αποκλείει φως που προέρχεται από άλλα σημεία του εστιακού επιπέδου, αλλά όχι στο σημείο εστίασης. Έτσι, ένα συνεστιακό μικροσκόπιο έχει ελαφρώς καλύτερη ανάλυση οριζόντια, όσο και κάθετα. Στην πράξη, η καλύτερη οριζόντια ανάλυση συνεστιακού μικροσκοπίου είναι περίπου 0,2 μικρά, και η καλύτερη κάθετη ανάλυση είναι περίπου 0.5 microns.

Ένα κοινό πρόβλημα με την συνεστιακή μικροσκοπία και την μικροσκοπία φθορισμού είναι ο αποχρωματισμός των φθοριοχρωμάτων όταν αυτά διεγείρονται. Αυτό περιορίζει το μέγιστο χρόνο συλλογής εικόνων και είναι σημαντικό πρόβλημα όταν συλλέγεται μία σειρά από διαδοχικές εικόνες. Αυτό το πρόβλημα είναι επίσης σημαντικό όταν παρατηρούμε ζωντανά κύτταρα αφού κατά την διάρκεια της διέγερσης και του αποχρωματισμού παράγονται τοξικά παρα- προϊόντα. Πρόσφατα έχει αναπτυχθεί η πολύ-φωτονική μικροσκοπία φθορισμού στην οποία η διέγερση περιορίζεται μόνο στο οπτικό επίπεδο εστίασης.

Κατά την διάρκεια μιάς σύντομης ώσης Laser δύο φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος απορροφώνται από το φθοριόχρωμα στο επίπεδο εστίασης αντί για ένα φωτόνιο μικρού μήκους κύματος με αποτέλεσμα την διέγερση φθορισμού. Με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η διέγερση του φθοριοχρώματος μόνο στο επίπεδο εστίασης