Γενετικός Μετασχηματισμός των Φυτών To Agrobacterium tumefaciens είναι η αιτία σχηματισμού του κορονωτού κάλλου σε πάνω από 140 δικότυλα φυτά. Ο κορονωτός κάλλος είναι η ασθένεια των φυτών που προκύπτει από τη μολυσματικότητα των Agrobacterium. Είναι παθογόνο και έχει την ικανότητα να μεταφέρει ένα τμήμα του δικού του DNA (το λεγόμενο T-DNA) στο πυρηνικό γονιδίωμα των φυτικών κυττάρων, σε τυχαία θέση. Το υπό μελέτη γονίδιο μεταφέρεται συνήθως μαζί με ένα γονίδιο επιλογής. Τα τοξικά στελέχη του A. tumefaciens περιέχουν ένα μεγάλο εξωχρωμοσωμικό στοιχείο, στο οποίο εδράζονται τα γονίδια που εμπλέκονται στην επαγωγή του κορονωτού κάλλου.

Διαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου pTiC58 που προέρχεται από το στέλεχος A.tumefaciens C58. Το εξωχρωμοσωμικό στοιχείο είναι ένα πλασμίδιο με εξαιρετικά μεγάλο μέγεθος 200kb. Eξαιτίας του ρόλου του στην επαγωγή του κορονωτού κάλλου το πλασμίδιο αυτό ονομάζεται Ti, ογκοεπαγωγικό πλασμίδιο.

Το πλασμίδιο pTiC58 Ori: περιοχή του πλασμιδίου υπεύθυνη για την αντιγραφή, Vir: στην περιοχή αυτή εδράζουν τα γονίδια τοξικότητας. Con: γονιδιακές περιοχές που προσδίδουν τη συζευκτική δραστηριότητα του πλασμιδίου.

Σταθερός μετασχηματισμός φυτών A Σταθερός μετασχηματισμός φυτών A.thaliana με τη μέθοδο της διείσδυσης μέσω Agrobacterium. Η μέθοδος που εφαρμόζεται στο εργαστήριο είναι γνωστή ως “floral-dip”- εμβάπτιση ανθέων (Clough and Bent, 1998). Ανώριμα άνθη του φυτού εμβαπτίζονται σε εναιώρημα βακτηριακών κυττάρων Agrobacterium. Tα σπέρματα που προκύπτουν από τα συγκεκριμένα άνθη δίνουν φυτά συνήθως σε ημίζυγη κατάσταση (φυτά που έχουν μόνο ένα γονίδιο αντί για ζεύγος, για κάποιο χαρακτηριστικό) ως προς το εισαγόμενο γονίδιο. Άρα ο μετασηματισμός γίνεται μετά τη διαφοροποίηση σε ωοθήκες και ανθήρες. Η συχνότητα του μετασχηματισμού είναι ~1% και μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για την εισαγωγή γονιδίων όσο και σε πειράματα μεταλλαξιγένεσης για «σήμανση γονιδίων»

Πειραματική διαδικασία Α1 Βλάστηση Φυτών Φυτά Αrabidopsis thaliana αναπτύσσονται μέχρι το στάδιο της άνθησης σε θάλαμο ανάπτυξης με με τεχνητό φωτισμό και φωτοπερίοδο (8 h ημέρα/16 h σκοτάδι) για τον πρώτο μήνα του βιολογικού τους κύκλου. Και 18h ημέρα / 6h σκοτάδι) μέχρι την άνθηση και μετά τον μετασχηματισμό. Σπόροι φυτεύονται και στη συνέχεια νεαρά φυτάρια μεταφυτεύονται σε γλάστρες. Οι πρώτοι ανθικοί οφθαλμοί που εμφανίζονται, αποκόπτονται έτσι ώστε να καταργηθεί η επάκρια κυριαρχία και να προοωθηθεί μια πιο συγχρονισμένη ανθοφορία των δευτερογενών οφθαλμών. Τα φυτά είναι έτοιμα για γενετικό μετασχηματισμό 4-6 ημέρες αργότερα. Ιδανικά, τα φυτά φέρουν λίγα ώριμα και πολλά ανώριμα άνθη.

A2. Καλλιέργεια Agrobacterium tumefaciens Το στέλεχος Agrobacterium tumefaciens που θα χρησιμοποιηθεί είναι το GV3101 με Ti το pM90(pTiC58ΔT-DNA) με ανθεκτικότητα στη ριφαμπυκίνη και γκενταμυκίνη. Τo στέλεχος είναι ήδη μετασχηματισμένο και φέρει τον δυαδικό φορέα pBIN και γονιδιο αναφοράς το GUS υπό τον έλεγχο του 35S προαγωγέα.

Α3 Μόλυνση των φυτών Εμβαπτίστε το υπέργειο μέρος των φυτών στο εναιώρημα Agrobacterium για 2-3 min. Θα πρέπει να είναι ορατή η επικάλυψη του φυτού από ένα λεπτό φίλμ υγρού. Στεγνώστε απαλά και σύντομα με χαρτί και καλύψτε τα φυτά με μεμβράνη, έτσι ώστε να διατηρηθεί η υγρασία, για 16-24 ώρες Τα βακτήρια αναπτύσσονται σε LB θρεπτικό μέσο με τα κατάλληλα αντιβιοτικά. Τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου στις 5500g. Eπαναδιαλύουμε σε διάλυμα MS, σακχαρόζης 5 % / 0,05 % Silwet και σε συγκέντρωση Ο.D. = 0.1-0.5. Απαιτείται διάλυμα 200-300 ml για την εμβάπτιση 2-5 γλαστρών. Μεταφέρετε τα φυτά στο θάλαμο ανάπτυξης για άλλες 3-5 εβδομάδες μέχρις ότου τα κεράτια (siliques) αποξηρανθούν και αποκτήσουν καφέ χρώμα. Συλλέξτε τους σπόρους και φυλάξτε τους στους 4 οC.

A4. Επιλογή των πιθανών μετασχηματισμένων φυτών Για τους σκοπούς της εργαστηριακής άσκησης θα δοθούν σπέρματα, τα οποία συλλέχθηκαν από ήδη μετασχηματισμένα φυτά Arabidopsis thaliana σύμφωνα με τη μεθοδολογία που περιγράφεται παραπάνω (Τ1 γενιά). Αποστειρώστε τους σπόρους εμβαπτίζοντάς τους σε 70% αιθανόλη για 30-60 sec και κατόπιν σε 30% χλωρίνη εμπορίου (2.625% υποχλωριώδες νάτριο)/ 0.05% Tween20 για 5 min. Eτοιμάστε τρυβλία με 1/2Χ MS θρεπτικό μέσο ανάπτυξης, 0.8% άγαρ και 50 μg/ ml καναμυκίνη. Προσθέστε vancomycin σε συγκέντρωση 500mg/l για τον έλεγχο ανάπτυξης βακτηρίων. Απλώστε ομοιόμορφα τους αποστειρωμένους σπόρους σε πυκνότητα περίπου 100-150 σπόροι (~15 mg) ανά τρυβλίο αναμιγνύοντας τους σπόρους με 2.5 ml 0,05% αγαρόζης ή νερό.

Eπιλογή των μετασχηματισμένων φυτών Κλείστε τα τρυβλία με Parafilm. Αφήστε στους 4 οC για 1 ημέρα και κατόπιν μεταφέρετέ τα σε θάλαμο ανάπτυξης υπό συνεχές φως (50-100 μEinsteins m-2 sec-1) για 7-10 ημέρες. Τα μετασχηματισμένα φυτά θα αναπτύσσονται ως πράσινα φυτάρια. Μεταφέρετε σε θρεπτικό μέσο επιλογής με 1.5% Phytagel, το οποίο θα επιτρέψει να επιμηκυνθούν οι ρίζες των φυτών και θα ελαττώσει τα πιθανά σφάλματα επιλογής. Μεταφέρετε τα μεταλλαγμένα φυτά σε έδαφος.