Solubilni produkti imunskog odgovora kao biomarkeri

Dijagnostička imunologija Razdvojiti senzitivnost od specifičnosti u dijagnostičkim testovima Senzitivnost: verovatnoća da će test pokazati reakciju ako je uzorak zaista pozitivan Specifičnost: verovatnoća da pozitivan test neće biti reaktivan ako je uzorak zaista negativan Koja karakteristika je korisnija za pomoć u dijagnozi bolesti: specifičnost ili senzitivnost?

Testovi zasnovani na Ag/At reakciji Antigen-antitelo (Ag-At) reakcije čine osnovu mnogih in vitro metoda koje se obavljaju u laboratorijskim uslovima u dijagnostičke svrhe. Ispituje se prisustvo antigena ili antitela u odgovarajućem uzorku (serumu, likvoru, sinovijalnoj tečnosti...). - infektivni agens ili njegov deo (npr. HbsAg, p24 HIV...) - drugi molekuli (npr. citokini, hormoni, komponente komplementa, tumor markeri, proteini akutne faze , Ig...) - ukupni Ig (pojedine klase) ili specifična At za određeni Ag Tradicionalno se zovu i serološke reakcije/testovi 3

Serološki testovi Direktni testovi Indirektni testovi za detekciju Ag ili At (uzorak pacijenta) Indirektni testovi za detekciju At ili Ag (u serumu pacijenta)

Dokazivanje krvnih grupa Direktna aglutinacija kap krvi + antitelo ishod 1 2 3 4 + +

Određivanje reumatoidnog faktora (anti-IgG At) Indirektna aglutinacija Rose Waalerov test Stari test- ovčiji Er obloženi subaglutinišućom količinom kunićevog IgG antitela specifičnog za ovčije Er; kada se ovakvi Er izlože dejstvu humanog seruma koji sadrži RF dolazi do aglutinacije Test lateks aglutinacije na čestice lateksa se vežu molekuli humanih IgG i posmatra se aglutinacija čestica posle dodatka seruma ispitanika) A pozitivan test (aglutinacija lateks čestica) B-E negativan test (nema aglutinacije lateks čestica)

Coombsov test Antiimunoglobulinski test

Coombsov test Direktni Coombsov test Indirektni Coombsov test Služi za određivanje autoantitela specifičnih za sopstvene eritrocite Koristi se u transfuziji za predviđanje transfuzionih reakcija Normalan nalaz - nema aglutinacije Pozitivan nalaz – aglutinacija 1. Autoimunske hemolitičke anemije 2. Hemolitičke anemije izazvane lekovima 3. Autoimunske bolesti 4. Infektivna mononukleoza Direktni Coombsov test Detektuje neaglutinirajuća anti-Rh antitela klase IgG u serumu Rh- trudnica Serum se inkubira sa Rh+ eritrocitima koji vežu anti-Rh antitela, zatim se dodaju zečija, antiglobulinska antihumana antitela Pozitivan test - Rh inkompatibilnost (hemolitička bolest novorođenčeta) Indirektni Coombsov test

Reakcija inhibicije aglutinacije Klinički se primenjuje za: dokazivanje infekcije virusom influence Hemaglutinacija uključuje aglutinaciju Er, a neki virusi aglutiniraju Er in vitro. Antitela iz ispitivanog seruma inhibiraju hemaglutinaciju.

Reakcija inhibicije aglutinacije Klinički se primenjuje za: dokazivanje trudnoće - HCG u urinu

Test fiksacije komplementa I faza

Test fiksacije komplementa II faza

Elektroforeza Elektroforeza proteina predstavlja opšte prihvaćenu metodu za detekciju i kvantifikaciju pojedinih klasa proteina koji u nekim bolestima mogu biti značajno povišeni (npr. u toku nekih infekcija ili nekih monoklonskih hiper γ globulinemija) Kombinovana sa određivanjem ukupne količine proteina u serumu ova metoda je neophodna u dijagnostici i terapeutskom praćenju mnogih akutnih bolesti, posebno malignih monoklonskih gamopatija i imunodeficijencija.

Zonska elektroforeza celuloza-acetat, agar i agaroza (ne ometaju protok molekula) razdvajanje proteina na osnovu površinskog naboja uzorci seruma se stave u početni položaj, nakon čega se propušta jednosmerna struja (90 min) da bi se obezbedio protok struje, upotrebljava se odgovarajući pufer sa određenim pH i odgovarajućom jonskom jačinom glavni proteini seruma putuju ka anodi; po završteku elektroforeze trake se detektuju bojama za proteine, a intenzitet boje se meri u denzitometru

Zonska elektroforeza proteini normalnog seruma se elektroforezom razdvajaju u 5 glavnih zona/traka: Albumin α1-globulin (α1 antitripsin) α2-globulin (haptoglobin i α2 mikroglobulin) β-globulin (transferin i komponente komplementa) γ-globulin (imunoglobulini)

Primeri poremećaja detektovanih zonskom elektroforezom akutna inflamacija + - + - hronična inflamacija Alfa-1 i alfa-2 trake su povećane tokom inflamatornog odogovora zbog povećane sinteze akutno faznih reakatanata od strane hepatocita Sinteza Ig od strane antigenom aktiviranih B Ly transformisanih u plazma ćelije se detektuje povećanjem poliklonskih gama traka + - + - ciroza jetre hipogamaglobulinemija koncentracija albumina i proteina alfa i beta traka je smanjena Deficit sinteze Ig se ogleda kroz značajno smanjenje gama trake. Osobe sa ovim defektom imaju rekurentne infekcije

Imunoelektroforeza Zonska elektroforeza ništa ne govori o strukturnim osobinama pojedinih proteina koji su u povećanim koncentracijama pa se iz tih razloga mora dopuniti sličnom analizom koju nazivamo imunoelektroforeza Imunoelektroforeza predstavlja kombinaciju elektroforeze serumskih proteina sa imunoprecipitacijskom detekcijom Elektroforezom se obezbeđuje separacija serumskih proteina Imunoprecipitacijom se detektuju pojedine imunoglobulinske klase i drugi specifični proteini u serumu Dve su srodne metode: Imunoelektroforeza (IEF) Imunofiksaciona elektroforeza (IFE)

Imunoelektroforeza IEF je pouzdan i tačan metod za detekciju strukturnih abnormalnosti i poremećaja u koncentraciji proteina. Najčešće se primenjuje u dijagnozi monoklonskih gamopatija Najvažnija primena u ispitivanju urina je dokazivanje Bence Jones proteina (kapa ili lambda laki lanci)

Imunoelektroforeza Imunoelektroforeza je metoda kojom se pojedine komponente seruma mogu razlikovati ne samo na osnovu njihove pokretljivosti u električnom polju, već i na osnovu njihove antigenosti. Izvodi se u dve faze. Prva faza je po načinu izvođenja identična zonskoj elektroforezi. U agaru se naprave se rupice dijametra do 2 mm u koje se stavlja serum ispitivanih osoba. Zatim se propusti struja u određenom vrmenskom intervalu. Time se vrši razdvajanje seruma na komponente.

U drugoj fazi se stavlja antiserum odgovarajuće specifičnosti u napravljeni uzdužni kanal širine do 2 mm: antihumani IgG, IgA, IgM itd. Anti serum posle određenog vremena difunduje i u područjima ekvivalencije stvara precipitate. Pošto komponente seruma difunduju radijalno a antiserum u jednom smeru, pericipitati imaju lučni izgled. Imunoelektroforeza je isključivo kvalitativna metoda i omogućava samo razlikovanje pojedinih sastojaka seruma (negde oko 30), a takođe se tom metodom otkriva prisustvo tzv. patoloških imunoglobulina

21

+ imunodifuzija Uzorak - serum pacijenta anti humani serum Struja Zonska elektroforeza imunodifuzija precipitacija Protein Koncentracija (g/l) Albumin 47,6 a1 globulin 6,1 a2 -globulin 12,3 b - globulin 12,2 g-globulin 53,6 Imunoelektroforeza humanog seruma u agaru (natrijum barbituratni pufer pH-8,2)

Imunoelektroforeza Interpretacija nalaza 1. Reakcija proteina (antigena) sa antitelom "ima/nema„ - dokazuje se prisustvo ili odsustvo proteina u mešavini antigena 2. Promene u elektroforetskoj mobilnosti "normalna/izmenjena" promene u primarnoj strukturi ili fragmentacija proteina, pri čemu fragmenti imaju izmenjenu brzinu u odnosu na nativni protein

Imunoelektroforeza 3. Promene u distanci preciptiranih lukova "normalna/izmenjena" Smanjeno rastojanje od kanala: povećana konc. ili prisustvo proteina manje Mr (ubrzana difuzija) Povećano rastojanje od kanala: smanjena konc. ili prisustvo agregata (usporena difuzija) 4. Promene u obliku i izgledu luka Monoklonski imunoglobulini u monoklonskim gamapatijama

Imunoelektroforeza

LABORATORIJSKO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA Određivanje autoantitela je: * kvalitativno * kvantitativno: * titar * arbitrarne jedinice * koncentracija (standard) Bazirano na imunohemijskoj detekciji: * aglutinacija * precipitacija * ELISA * turbidimetrija * imunobloting * imunofluorescenca

IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA detekcija autoantitela koja reaguju sa tkivnim (intracelularnim) antigenima Upotreba : * tkivnih preseka (organ-specifična autoantitela) * ćelijske suspenzije: * Hep-2 ćelijska linija (ANA) * granulociti (ANCA)

Indirektna imunofluorescenca ANCA-Wegener-ova granulamatoza Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis) ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis, skleroderma, Sjogren-ov sindrom), rekcije na lekove, hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom RF (IgM, IgA ili IgG) – reumatoidni artritis

ANCA ANTITELA ANCA= autoantitela specifična za citoplazmatske Ag neutrofila * Substrat su etanolom fiksirani humani granulociti * prisutna u naglašenim tipovima vaskulitisa

ANCA AUTOANTITELA I VASKULITISI Antigen - proteinaza-3 u primarnim granulama Antigen – mijeloperoksidaza Wegener granulomatoza Cistična fibroza (90%), Hronični hepatitis (80%), SLE, RA

ANA IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE ANTI-NUKLEARNIH AUTOANTITELA (ANA) * autoantitela reaguju sa jedarni aparatom * prisutna kod pacijenata sa sistemskim bolestima vezivnog tkiva * njihov nivo je povezan sa intezitetom inflamacije ENA: ekstraktabilni nuklearni antigeni mitotički aparat centromera ANA

Ag: kinetohore hromozoma, centromerni Ag (CENP-A,B,C,D,E) CENTROMERNA FLUORESCENCA dsDNA (nativna DNK) Ag: kinetohore hromozoma, centromerni Ag (CENP-A,B,C,D,E) Ag: nativna dsDNK