Απόπτωση ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Εξειδίκευσης Κλινική Βιοχημεία, Μοριακή Διαγνωστική Π.Παπαζαφείρη

Η τύχη των κυττάρων στους πολυκύτταρους οργανισμούς διαφοροποίηση αύξηση η τύχη των κυττάρων εξαρτάται από παράγοντες επιβίωσης και επαγωγής λειτουργιών παράγοντες επιβίωσης : διατήρηση των κυττάρων Παράγοντες επαγωγής: αύξηση, διαφοροποίηση, απόπτωση, μετασχηματισμός απόπτωση μετασχηματισμός

Κυτταρικός Θάνατος Κυτταρικός θάνατος είναι η μη αντιστρεπτή απώλεια δομής ή και λειτουργίας κυττάρου. Βασικό φαινόμενο απαραίτητο για την κανονική ανάπτυξη, όπως π.χ. στην οργανογένεση των εμβρύων, τη διατήρηση του σχήματος ιστών και την ανανέωση κυττάρων μπορεί να αποτελέσει παθολογική διεργασία

Κυτταρικός Θάνατος Υπάρχουν 2 μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου βάσει της μορφολογίας των κυττάρων που πεθαίνουν: Απόπτωση (κανονικός ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) είναι η φυσιολογική διαδικασία με την οποία άχρηστα κύτταρα εξουδετερώνονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και άλλων βιολογικών διεργασιών. Νέκρωση (τυχαίος κυτταρικός θάνατος) είναι η παθολογική διαδικασία που εξελίσσεται όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε ισχυρό μηχανικό ή χημικό ερέθισμα.

Ιστορικά στοιχεία Μορφολογική περιγραφή (Vogt, 1842) Programmed cell death: a form of cell death in normal embryogenesis (Glucksmann, 1950s) Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death (Kerr, 1962) -apoptotic bodies (arrowed) in liver -lobe atrophy after portal vein ligation Apoptosis: distinct mechanism of controlled cell deletion that is complementary but opposite to mitosis (Kerr, Wyllie, Currie, 1970)

νέκρωση: παθητικός κυτταρικός θάνατος αφορά ομάδα κυττάρων Βίαιο σήμα απελευθέρωση συστατικών, δημιουργεί φλεγμονή φθορά κυτταρικής μεμβράνης εξάντληση ΑΤΡ στο κύτταρο απόπτωση: ενεργητική αυτοκαταστροφή αφορά μεμονωμένο κύτταρο έναρξη προγραμματισμένου θανάτου Φαγοκυττάρωση από γειτονικά κύτταρα κατάτμηση του κυττάρου σε κυστίδια ενδοκυτταρικό μονοπάτι σηματοδότησης (κασπάσες)

Μηχανισμοί νέκρωσης και απόπτωσης Κατά τη νέκρωση ο κυτταρικός μεταβολισμός καταρρέει, το κύτταρο διογκώνεται και οι κυτταρικές μεμβράνες αποσυντίθεται. Κατά την απόπτωση, το κύτταρο στρογγυλοποιείται και συρρικνώνεται, το DNA κομματιάζεται «κανονικά». Σε αντίθεση με τη νέκρωση, το περιεχόμενο του αποπτωτικού κυττάρου συσκευάζεται σε μεμβρανικά κυστίδια και απορροφάται από γειτονικά κύτταρα μέσω φαγοκυττάρωσης.

Διαφορές νέκρωσης και απόπτωσης Νέκρωση Απόπτωση αφορά ομάδες εφαπτόμενων κυττάρων προκαλείται από μη φυσιολογικές διαταραχές (λυτικούς ιούς, υποθερμία, ισχαιμία, δηλητήρια) φαγοκυττάρωση από μακροφάγα σημαντική αντίδραση φλεγμονής αφορά μεμονωμένα κύτταρα προκαλείται από φυσιολογικά ερεθίσματα (έλλειψη αυξητικών παραγόντων, αλλαγές στο ορμονικό περιβάλλον) φαγοκυττάρωση από μακροφάγα δεν υπάρχει αντίδραση φλεγμονής

Γιατί μας ενδιαφέρει… Ερευνητές βασικής έρευνας, ιατρικής έρευνας και βιοτεχνολογικής βιομηχανίας ενδιαφέρονται: Πότε και γιατί πεθαίνουν τα κύτταρα; Σε ποια συγκέντρωση κάποια συγκεκριμένη ουσία έχει κυτταροτοξικές ή κυτταροστατικές ιδιότητες; Ποιοι παράγοντες επηρεάζουν το χρόνο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού; Η κατανόηση του κυτταρικού θανάτου καθώς και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού είναι σημαντική για σχεδιασμό και ανάπτυξη νέων θεραπευτικών ουσιών παρεμπόδιση και θεραπεία καρκίνου και για δοκιμασία νέων αντικαρκινικών ουσιών. η απόπτωση συσχετίζεται με αρκετές χρόνιες νευροεκφυλιστικές νόσους όπως η νόσος Alzheimer, η ασθένεια Parkinson’s και η καρδιακή ανεπάρκεια

Επαγωγείς απόπτωσης γ-, X- και UV ακτινοβολία Θερμικό ή ψυκτικό shock Ωσμωτικό stress Ελεύθερες ρίζες Δραστικές μορφές οξυγόνου Μείωση αυξητικών παραγόντων Προσθήκη κυτταροκινών Ισχαιμία και υποξία Προσδέτης Fas Κεραμίδιο Χημειοθεραπευτικά φάρμακα Ιοί

Π ο ι α μ έ θ ο δ ο;

Η ανάπτυξη μεθοδολογίας απαιτεί γνώση για τα: Στάδια απόπτωσης Συρρίκνωση του κυττάρου Απώλεια μεμβρανικής ασυμμετρίας Έκθεση φωσφατιδυλοσερίνης Ρήξη του μιτοχονδρίου και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c Συμπύκνωση της χρωματίνης Κατάτμηση του DNA Θρυμματισμός του πυρήνα Δημιουργία αποπτωτικών σωματιδίων

Επισκόπηση των μηχανισμών κυτταρικού θανάτου Σύντομη περιγραφή των κυτταρικών διαδικασιών που συμμετέχουν στην απόππτωση Επισκόπηση των μηχανισμών κυτταρικού θανάτου (PHAP):tumor suppressor putative HLA-DR-associated proteins

Μερικές σημαντικές διαφορές μεταξύ εξωγενούς και ενδογενούς μονοπατιού απόπτωσης εξωγενές Άμεσος κυτταρικός θάνατος –λίγες ώρες Πρόκειται για καθοδηγούμενη διαδικασία Δεν συνοδεύεται από πρωτεϊνική σύνθεση ενδογενές Απαιτείται χρόνος –μέχρι 24 ώρες για την ολοκλήρωσή του Το μονοπάτι είναι προεπιλεγμένο Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι «απαίτηση» Ενεργοποιείται σε συνθήκες κυτταρικού stress

Η απόπτωση μπορεί να χωριστεί σε τρεις διαφορετικές φάσεις με κριτήρια τις μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές που συμβαίνουν: α) τη φάση έναρξης, κατά την οποία μια αλλαγή στο περιβάλλον του κυττάρου ενεργοποιεί το μηχανισμό απόπτωσης και επαγωγής του σήματος, με αποτέλεσμα τη δημιουργία εγκολπώσεων στην κυτταρική μεμβράνη («φυσσαλιδοποίηση») , β) την ενδιάμεση, εκτελεστική φάση, όπου παρατηρείται απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και ενεργοποίηση των κασπασών και γ) τη φάση αποικοδόμησης, όπου περιλαμβάνει τη διαδοχική ενεργοποίηση και άλλων κασπασών που δρουν καταρροϊκά, την απενεργοποίηση της PARP (poly ADP-ribose polymerase) και τελικά την κατάτμηση του DNA και το σχηματισμό των αποπτωτικών σωματίων

Υποδοχείς θανάτου και εξαρτώμενοι από μιτοχόνδρια μηχανισμοί απόπτωσης: διασύνδεση TNFa Fas L Κυτταρικό stress: οξειδωτικά TNFR1 Fas/CD95 μιτοχόνδρια Death domains Cyt c MPT κασπάση-8 Bax/BcL2 Apaf-1 Cyt c αποπτόσωμα προκασπάση-9 Κασπάσες τελεστές (π.χ. κασπάση-3) κασπάση-9 ΑΠΟΠΤΩΣΗ

Μηχανισμοί απελευθέρωσης διαφόρων παραγόντων από τα μιτοχόνδρια κατά την απόπτωση, α) μέσω του ΜΡΤΡ και β) μέσω του σχηματισμού διαύλων

Κασπάσες Είναι πρωτεάσες κυστεΐνης, με υψηλή ειδικότητα Συνθέτονται σαν πρόδρομα μόρια Διασπούν μετά από κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος Κύριοι εκτελεστές της απόπτωσης – στη δράση τους οφείλονται οι περισσότερες από τις μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται στα κύτταρα που αποπίπτουν Η οικογένεια των κασπασών περιλαμβάνει 17 γνωστά μέλη πως λειτουργούν οι κασπάσες? – αναστέλλουν πρωτεΐνες που προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση (π.χ. αναστολέα νουκλεασών- CAD) Ρύθμιση των κασπασών : αλληλουχία κασπασών για ενεργότητα, παρουσία συμπαράγοντα (π.χ. FADD), διαμερισματοποίηση, αναστολείς (IAPs)

Οικογένεια των πρωτεινών BcL-2 Στενά συγγενικά μέλη (BcL-2, BcLx) προωθούν την κυτταρική επιβίωση, Bax/Bak είναι προ-αποπτωτικά) BcL-2 εδρεύει στην κυτταροπλασματική πλευρά της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, είναι διμερές με Bax και ο μηχανισμός δράσης της περιλαμβάνει την παρεμπόδιση της έκλυσης του κυτοχρώματος (cytochrome) c; η ρύθμιση της BcL-2: από κυτταροκίνες και άλλα σήματα επιβίωσης/θανάτου - μεταγραφικό και μετα-μεταφραστικό επίπεδο βιολογία καρκίνου: τα προ-επιβιωτικά γονίδια BcL-2 είναι δυνητικά ογκογόνα, ενώ τα προ-αποπτωτικά γονίδια Bax είναι κατασταλτικά όγκων

Ρύθμιση του αποπτωτικού μονοπατιού από πρωτεΐνες της Bcl-2 οικογένειας X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)

Ρύθμιση του αποπτωτικού μονοπατιού από πρωτεΐνες της Bcl-2 οικογένειας Η ανίχνευση πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 στηρίζεται στη χρήση Western blot με προσεκτική θεώρηση της θέσης αλλά και του επιπέδου φωσφορυλίωσής τους

Στάδια απόπτωσης Συρρίκνωση του κυττάρου Απώλεια μεμβρανικής ασυμμετρίας Έκθεση φωσφατιδυλοσερίνης Ρήξη του μιτοχονδρίου και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c Συμπύκνωση της χρωματίνης Κατάτμηση του DNA Θρυμματισμός του πυρήνα Δημιουργία αποπτωτικών σωματιδίων

Τεχνικές μελέτης της απόπτωσης Μορφολογική εκτίμηση Κυτταρομετρία ροής Ειδικοί δείκτες: Annexin V Τρανσλουταμινάση ιστών : επαγωγή, ενεργότητα, προϊόντα Κατάτμηση DNA Μέτρηση βιωσιμότητας Mouse models: genes regulating apoptosis Ποσοτική ανάλυση και ανάλυση εντοπισμού πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση

Καταγραφή μορφολογίας μάρτυρας αποπτωτικό Οπτικό μικροσκόπιο: - Συμπύκνωση, κατάτμηση, αποπτωτικά σωμάτια Ηλεκτρονικό: - EM σάρωσης - Transmission EM

Μικροσκοπική παρατήρηση σε ολόκληρους ιστούς Επιλογή κατάλληλων χρωστικών Αcridine orange :εισέρχεται σε όξινα σωματίδια (λυσοσωμάτια) όπου πρωτονιώνεται και εγκλωβίζεται. Σε χαμηλό pH η χρωστική εκπέμπει πορτοκαλί όταν διεγείρεται με μπλε φως. Έτσι, χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό αποπτωτικών σωματίων Ζώνες απόπτωσης σε Έμβρυο Drosophila: (χρώση Acridine Orange & συνεστιακή μικροσκοπία)

Κυτταρομετρία ροής Αρχή «σκέδαση φωτός» Scattered light: παρέχει πληροφορίες για το κυτταρικό μέγεθος και τη δομή λόγω της ετερογένειας στη σκέδαση του φωτός από κάθε κύτταρο, εκθετική κλίμακα (logarithmic amplifiers) για την ανάλυση Cell size: συσχετίζεται με την ένταση του σκεδασμένου φωτός στην κατεύθυνση της δέσμης (Forward scatter) κοκκίωση, διαθλαστικότητα από ενδοκυτταρικές δομές: συσχετίζεται με την ένταση του σκεδασμένου φωτός σε κατεύθυνση κάθετη (90o) προς τη δέσμη (side scatter) οι μορφολογικές αλλαγές ( διόγκωση, συρρίκνωση, ρήξη της πλασματικής μεμβράνης, συμπύκνωση χρωματίνης, κατάτμηση πυρήνα, αποκοπή των αποπτωτικών σωματίων) μεταβάλλουν την σκέδαση

Μορφολογική εκτίμηση Ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής αλλαγών στο μέγεθος των κυττάρων και την κοκκίωση Side scatter: shows a decrease in granularity Forward scatter: shows a decrease in cell size

Ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων: ποσότητα DNA χρώση DNA με PI ή DAPI μείωση του φθορισμού DAPI (forward light scatter) συσχετίζεται με μικρού μοριακού βάρους DNA από αποπτωτικά κύτταρα SubGo

Annexin V: ειδικός δείκτης απόπτωσης Αρχή: η phosphatidylserine (PS) μετατίθεται στην πλασματική μεμβράνη και η Annexin V προσδένει επιλεκτικά την PS η μετάθεση της PS στην εξωτερική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης προκαλεί χρονοεξαρτώμενη αύξηση του φθορισμού annexinV-FITC ποσοτικοποίηση

Κυτταρομετρία ροής Χρώση PI & annexin V Propidium iodide B- αυθόρμητη απόπτωση C- actinomycin D D- ιονοφόρο ασβεστίου Quandrants 1 – ζωντανά κύτταρα 2 – πρώιμη απόπτωση, έκθεση PS, ακέραιη μεμβράνη 3 – καθυστερημένη απόπτωση, έκθεση PS, ρήξη μεμβράνης 4 – νέκρωση; Ρήξη και απώλεια μεμβράνης 4 3 Propidium iodide 1 2 Annexin V-FITC

Τρανσγλουταμινάση ιστών Η στρατολόγηση και ενεργοποίηση της τρανσγλουταμινάσης των ιστών είναι μέρος του προγράμματος απόπτωσης και τελεστής της διαδικασίας θανάτου : καταλύει την ασβεστιο-εξαρτώμενη διασταυρούμενη σύνδεση γλουταμικού και λυσίνης Χρήσιμη μέθοδος για διαπίστωση απόπτωσης in vivo Εντοπισμός tTG mRNA: με in situ hybridization tTG πρωτεΐνη: με Western blotting και ανοσοϊστοχημεία Μέτρηση της of δραστικότητας - ενζυματικά - ELISA enzyme-linked immunoabsorbent assay

Κατάτμηση DNA (DNA laddering) αρχή μεθόδου: το DNA που προέρχεται από απόπτωση προσδένεται γρήγορα σε γυάλινα νημάτια παρουσία χαοτροπικού άλατος (γουανιδινικό ΗCl). Μετά από πλύσιμο ώστε να απομακρυνθούν οι προσμίξεις, το DNA απομακρύνεται από τα νημάτια με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας. Το DNA “τρέχει αργά” σε πήκτωμα αγαρόζης και εμφανίζεται η χαρακτηριστική εικόνα του DNA laddering.

Κατάτμηση DNA DNA που απομονώθηκε από αποπτωτικά κύτταρα αναλύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και βάφεται με βρωμιούχο εθίδιο. Χαρακτηριστικό πρότυπο DNA με μέγεθος πολλαπλάσιο των 180 bp Μειονεκτήματα: μειωμένη ευαισθησία, μη-ποσοτική μέθοδος [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid]

In situ end-labeling: TUNEL TUNEL: Τerminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP-biotin Νick-Εnd Labeling Αρχή: Επειδή η θραύση του DNA γίνεται σε δια-νουκλεοσώματα, τα νουκλεοτίδια –που έχουν σημανθεί με digoxigenin- ενσωματώνονται στα ελεύθερα άκρα των τμημάτων DNA από την τελική δεοξυ νουκλεοτιδυλική μεταφοράση (TdT) Η ανίχνευση στηρίζεται στη χρησιμοποίηση Ab anti-digoxigenin, peroxidase και υποστρώματος χρωμογόνου

Κασπάσες αρχή μεθόδου: ανοσοφθορισμός Μετά την έναρξη απόπτωσης, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται και στη συνέχεια λύνονται. Πιατάκια ELISA επικαλύπτονται με αντι-κασπάση 3 και στη συνέχεια καλύπτονται οι μη ειδικές θέσεις (blocking). Τα δείγματα προστίθενται στο πιατάκι, όπου προσδένονται αφού έχει ενεργοποιηθεί η κασπάση 3 Μετά από πλύσεις προστίθεται φθορίζον υπόστρωμα της κασπάσης, το οποίο πρωτεολυτικά κόβεται από την κασπάση και απελευθερώνεται η φθορίζουσα ουσία. Μετρείται το ποσό φθορισμού με φθορισμομετρία.

Κασπάσες φθορίζουσα ουσία υπόστρωμα κασπάσης 3 δείγμα που περιέχει ενεργοποιημένη κασπάση 3 αντι-κασπάση 3 πιάτο ELISA

Κασπάσες Κύτταρα που εκτέθηκαν σε 4μg/ml καμπτοθεσίνης για διαφορετικά χρονικά διαστήματα στους 37οC.

Κυτταροτοξικότητα- Βιωσιμότητα Η ιδιότητα θανάτωσης κυττάρων είτε από κάποια χημική ουσία (όπως τρόφιμα, καλλυντικά ή φαρμακευτικές ουσίες) είτε από κάποιο κύτταρο (π.χ. κυτταροτοξικό Τ κύτταρο). Σε αντίθεση με τη νέκρωση και την απόπτωση, ο όρος κυτταροτοξικότητα δεν προσδιορίζει συγκεκριμένο μηχανισμό κυτταρικού θανάτου.

ΜΤΤ [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] Η μέθοδος προσδιορισμού κυτταροτοξικότητας με ΜΤΤ στηρίζεται στο ότι τα νεκρά κύτταρα δε μπορούν να μεταβολίσουν διάφορα άλατα τετραζολίου.

MTT or XTT αρχή μεθόδου: τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να ανάγουν άλατα τετραζολίου (ΜΤΤ ή ΧΤΤ) σε χρωματιστά σύμπλοκα φορμαζάνης ενώ τα νεκρά κύτταρα δεν μπορούν. Αφού ένας κυτταροτοξικός παράγοντας μειώνει την αναγωγή των αλάτων τετραζολίου η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για να μετρήσει είτε κυτταροτοξικότητα που επάγεται από τον συγκεκριμένο παράγοντα είτε γενικότερα νέκρωση.

LDH (lactate dehydrogenase) Το ένζυμο αυτό είναι σταθερό κυτταροπλασματικό ένζυμο το οποίο άμεσα εκκρίνεται στο υπερκείμενο μόλις καταστραφεί η μεμβράνη. «ELISA» φυγοκέντρηση κυττάρων  απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού  ELISA με το άλας τετραζολίου.

ΜΤΤ Σε πιάτο ELISA καλλιεργούνται κύτταρα, τα οποία επωάζονται με ΜΤΤ για 4 ώρες (τελευταίες). Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να μετατρέψουν το ΜΤΤ σε φορμαζάνη. Μετρείται με χρωμομετρία η ποσότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου φορμαζάνης.

Περίληψη: μορφολογικά χαρακτηριστικά Single cells are usually affected. Nuclear heterochromatin becomes tightly condensed, often in a crescentic mass against the nuclear envelope. Cytoplasmic condensation and cellular rounding occur. Apoptotic cells detach from neighbouring cells. Apoptotic cells lose surface villi, especially in luminal structures. Cells become convoluted as fluid is actively removed. Cellular organelles are preserved. Membrane-bound cellular ‘blebs’ (apoptotic bodies) form. Apoptotic bodies may or may not have condensed nuclear chromatin masses contained within them. Membrane integrity of apoptotic cells or bodies is maintained until phagocytosis. Phagocytic cells are macrophages, or normal surrounding tissue cells that change their ‘non- phagocytic’ phenotype to take up and digest the apoptotic products. Lysosomes fuse with and degrade apoptotic bodies to leave small amounts of residual debris within the phagocytes. Apoptotic bodies formed in lining epithelium may be shed into lumina and escape phagocytosis.

Π ο ι α μ έ θ ο δ ο;