(ανίχνευση DNA του βακτηρίου Brucella σε κλινικά δείγματα) Διαδικασία PCR (ανίχνευση DNA του βακτηρίου Brucella σε κλινικά δείγματα)

Σε τι μας χρειάζεται; Το ανθρώπινο γένωμα συνίσταται από 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων ενώ και η σύσταση του μικροβιακού γενώματος είναι ανάλογη. Συχνά απαιτείται η απομόνωση ενός πολύ μικρού τμήματος αυτού του γενώματος το οποίο επειδή ακριβώς είναι πολύ μικρό χρειάζεται να αντιγραφεί σε πολλά αντίτυπα για να αξιοποιηθεί.

Η μελέτη αυτή μπορεί να αφορά Με την PCR επιτυγχάνεται η σύνθεση δισεκατομμυρίων αντιγράφων του τμήματος DNA που θέλουμε να μελετήσουμε (DNA στόχος). Η μελέτη αυτή μπορεί να αφορά Ανίχνευση γονιδίων που σχετίζονται με ασθένειες Ταυτοποίηση ατόμων Ανίχνευση του DNA παθογόνων μικροοργανισμών

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

Δομικά συστατικά της αντίδρασης Ολιγονουκλεοτίδια εκκινητές (primers): Μικρά τεμάχια DNA που κατασκευάζονται στο εργαστήριο. Σχεδιάζονται έτσι ώστε να είναι συμπληρωματικά στα δύο άκρα της περιοχής που επιδιώκουμε να αντιγράψουμε (περιοχή στόχος). Εκτός του ότι καθορίζουν ποιο κομμάτι DNA θα αντιγραφεί, είναι απαραίτητα και επειδή η DNA πολυμεράση μπορεί να δράσει μόνο αν υπάρχει ήδη ένα νουκλεοτίδιο για να προσκολληθεί.

DNA πολυμεράση Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών που υπάρχει στη φύση για να επιτυγχάνεται η αντιγραφή του DNA του κυττάρου πριν τη μίτωση. Επικολλάται κοντά στην άκρη του εκκινητή και καταλύει την προσθήκη σε αυτόν νουκλεοτιδίων (στη φύση την θέση του εκκινητή έχει ένα ένζυμο που ονομάζεται ολιγονουκλεάση – primase). H ζωική πολυμεράση διασπάται σε θερμοκρασία πολύ κάτω των 95 0C που αποδιατάσσεται το DNA, γι’αυτό χρησιμοποιούμε αυτή του βακτηρίου Thermus aquaticus που ανακαλύφθηκε σε μία θερμή πηγή στο Εθνικό Πάρκο Yellowstone των ΗΠΑ. Αυτό το ένζυμο δεν καταστρέφεται στη θερμοκρασία των 950C ενώ ενεργοποιείται σε θερμοκρασία άνω των 700C.

Νουκλεοτίδια Οι δομικοί λίθοι του DNA. Προσθέτουμε ένα μίγμα (dNTPs) που περιέχει Αδενίνη Θυμίνη Κυτοσίνη Γουανίνη Η DNA πολυμεράση δεσμεύει τα νουκλεοτίδια που βρίσκονται μέσα στο διάλυμα της αντίδραση και τα συγκολλά στον εκκινητή που με αυτόν τον τρόπο προοδευτικά επιμηκύνεται.

Το PCR βασίζεται Στη ψύξη και θέρμανση του διαλύματος. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιούμε Μία ειδική συσκευή που ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής (Thermocycler). Φιαλίδια που είναι ειδικά σχεδιασμένα ώστε να επιτυγχάνεται ομοιόμορφη κατανομή της θερμότητας στο εσωτερικό τους (φιαλίδια PCR – PCR reaction tubes).

Επομένως το διάλυμα της PCR θα περιέχει: Τους εκκινητές (primers) 1 και 2 Τα dNTPs Την DNA πολυμεράση με το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα Νερό

Οι εκκινητές 1 & 2 Επικολλούνται εκατέρωθεν στα τμήματα της αλυσίδας DNA που είναι συμπληρωματικά προς αυτούς. Η πιθανότητα επικόλλησής τους σε μη ειδικές θέσεις είναι πρακτικά ελάχιστη και για το λόγο αυτό ο σωστός σχεδιασμός τους είναι θεμελιώδης παράμετρος ώστε να εξασφαλιστεί για τη συγκεκριμένη αντίδραση PCR υψηλή ειδικότητα ή ευαισθησία;

DNA πολυμεράση Το ένζυμο αυτό προστίθεται τελευταίο στο φιαλίδιο της αντίδρασης PCR κυρίως γιατί είναι υπεύθυνο για την έναρξη της αντίδρασης. Για το λόγο αυτό παραμένει στο ψυγείο μέχρι τη στιγμή της χρήσης του (γιατί θέλουμε να είναι σε θερμοκρασία ψύξης μέχρι να το προσθέσουμε;). Επίσης Έχει μεγάλο κόστος και Προστίθεται σε πολύ μικρή ποσότητα

Αποδιάταξη Το φιαλίδιο τοποθετείται στον θερμικό κυκλοποιητή. Αρχικά η θερμοκρασία ανέρχεται στους 95οC. Επέρχεται πλήρης αποδιάταξη (denaturation) του δίκλωνου DNA.

Επικόλληση (annealing) Το διάλυμα ψύχεται αυτόματα εντός του θερμικού κυκλοποιητή στους 50οC - 65οC. Σε αυτή τη θερμοκρασία μονόκλωνο τμήματα DNA εκδηλώνουν την τάση να επικολλούνται στα συμπληρωματικά τους. Επειδή υπάρχει μεγάλη ποσότητα από τους εκκινητές και μόνο μία αλυσίδα στόχος, οι εκκινητές συσσωρεύονται απέναντι από τις συμπληρωματικές τους θέσεις μέχρι τυχαία, ένα από αυτά τα μόρια να ολοκληρώσει την επικόλληση.

Θερμοκρασία επικόλλησης = ειδικότητα ή ευαισθησία Όσο μεγαλύτερη είναι η θερμοκρασία επικόλλησης, τόσο μεγαλύτερη είναι η κινητικότητα των μορίων των εκκινητών απέναντι από τις συμπληρωματικές τους θέσεις. Άρα όσο μεγαλύτερη (μέχρι ενός ορίου) είναι η θερμοκρασία επικόλλησης τόσο μικρότερη η πιθανότητα να “ταιριάξει” o εκκινητής σε μία θέση που δεν είναι 100% συμπληρωματική. Επομένως αυξάνοντας το ύψος της θερμοκρασίας αυτού του σταδίου αυξάνω την ειδικότητα της αντίδρασης. Για το λόγο αυτό οι μέθοδοι που αποσκοπούν στην ενίσχυση τμημάτων DNA μικροβίων που βρίσκονται σε κλινικά υλικά έχουν συνήθως θερμοκρασία επικόλλησης κοντά στο ανώτερο όριο (πχ 65οC).

Επέκταση (extension) O θερμικός κυκλοποιητής θερμαίνει το διάλυμα της αντίδρασης στους 72οC. Σε αυτή τη θερμοκρασία ενεργοποιείται η DNA πολυμεράση η οποία όταν ανιχνεύσει εκκινητή προσκολλημένο σε μονόκλωνη αλυσίδα ξεκινάει να του προσθέτει συμπληρωματικά νουκλεοτίδια από αυτά που υπάρχουν διαθέσιμα στο διαλυμα. Αυτό συνεχίζεται μέχρι το πέρας της αλύσου, οπότε και το ένζυμο αποπίπτει Τότε ολοκληρώνεται ο πρώτος κύκλος της αντίδρασης

2ος κύκλος της αντίδρασης Στο τέλος του 1ου κύκλου έχουμε 2 μόρια δίκλωνου DNA καθένα από τα οποία αποτελείται από μία ολόκληρη μητρική αλυσίδα και από μία θυγατρική η οποία ξεκινά από την αρχή του εκάστοτε εκκινητή και ολοκληρώνεται θεωρητικά στο πέρας της μητρικής. Στον 2ο κύκλο ακολουθεί ξανά αποδιάταξη του DNA, επικόλληση, και επέκταση.

3ος κύκλος Στο τέλος επομένως του 2ου κύκλου έχουμε 4 μόρια δίκλωνου DNA: τα 2 μόρια συνίστανται από αλύσους όμοιες με αυτές του προηγούμενου σταδίου (2ο κύκλο) ενώ τα άλλα 2 δίκλωνα μόρια αποτελούνται από μία αλυσίδα που επεκτείνεται από την αρχή του ενός έως το τέλος του άλλου εκκινητή και μία που επεκτείνεται από την αρχή του εκάστοτε εκκινητή έως το πέρας της μητρικής αλύσου. Στο τέλος του 3ου κύκλου έχουμε 8 μόρια δίκλωνου DNA.

Στο τέλος του 3ου κύκλου συντίθεται για πρώτη φορά το DNA στόχος το οποίο αποτελείται από 2 αλύσους καθεμία από τις οποίες επεκτείνεται από την αρχή του ενός εκκινητή έως το πέρας του άλλου. Στους επόμενους κύκλους η ποσότητα του DNA στόχου (ο αριθμός των αντιγράφων του συγκεκριμένου μορίου) αυξάνεται συνεχώς. Στο τέλος των 30 κύκλων έχουμε 1 δισεκατομμύριο αντίγραφα της περιοχής στόχου και μόνο 8 αντίγραφα από τα μεγαλύτερα μόρια.

Θετικός και αρνητικός μάρτυρας Θετικός μάρτυρας: περιέχει DNA του μικροβίου που θέλουμε να ανιχνεύσουμε μαζί με όλα τα συστατικά της αντίδρασης. Αρνητικός μάρτυρας: περιέχει νερό (από την ίδια πηγή με αυτό που χρησιμοποιούμε στην αντίδραση) μαζί με όλα τα συστατικά της αντίδρασης.

Θετικός μάρτυρας Η χρήση του αποσκοπεί στη διερεύνηση της επάρκειας της διαδικασίας προετοιμασίας αντίδρασης δηλ. αν όλα τα αντιδραστήρια έχουν συμπεριληφθεί στην αντίδραση στη σωστή ποσότητα και είναι ενεργά, τότε αφού έχει προσθέσει DNA του μικροβίου που επιθυμώ να ανιχνεύσω, λογικά θα πρέπει το αποτέλεσμα της αντίδρασης του θετικού μάρτυρα να είναι θετικό.

Αν όχι; Υπάρχει κάποιο διαδικαστικό λάθος με Τα αντιδραστήρια (όχι σωστή ποσότητα ιδίως αναφορικά με τι; Όχι ενεργό, ιδίως αναφορικά με τι;) Το DNA που πρόσθεσα (κατακερματισμένο;) Ο θερμικός κυκλοποιητής (αρρύθμιστος)

Αν επομένως ο θετικός μάρτυρας δεν αντιδράσει θετικά και το αποτέλεσμα της αντίδρασης του δείγματος που θέλω να ελέγξω είναι Αρνητικό, τότε το θεωρώ το αποτέλεσμα για το δείγμα μου ψευδώς αρνητικό Θετικό, τότε το θεωρώ αληθές (μάλλον το αίτιο του αρνητικού αποτελέσματος της αντίδρασης του θετικού μάρτυρα είναι ο κατακερματισμός του DNA;)

Αρνητικός μάρτυρας Η χρήση του αποσκοπεί στη διερεύνηση της επιμόλυνσης των συστατικών της αντίδρασης δηλ. αν όλα τα αντιδραστήρια είναι μη-επιμολυσμένα, αφού έχει προσθέσει αντί του DNA του μικροβίου που επιθυμώ να ανιχνεύσω νερό, τότε λογικά θα πρέπει το αποτέλεσμα της αντίδρασης του αρνητικού μάρτυρα να είναι αρνητικό.

Αν όχι; Δηλαδή αν δω προϊόν ενίσχυσης DNA ίδιου ή άλλου μεγέθους από αυτό που προσπαθώ να αντιγράψω, τότε Κάποιο από τα συστατικά της αντίδρασης έχει επιμολυνθεί με DNA από προηγούμενες αντιδράσεις ανίχνευσης του ίδιο ή διαφορετικού στόχου.

Αν επομένως ο αρνητικός μάρτυρας δεν αντιδράσει αρνητικά και το αποτέλεσμα της αντίδρασης του δείγματος που θέλω να ελέγξω είναι Αρνητικό, μάλλον είναι αληθές (θα πρόκειται για επιμόλυνση που εισήγαγα στη διαδικασία αφού έκλεισα το φιαλίδιο της αντίδρασης του δείγματός μου). Θετικό, τότε το θεωρώ ψευδώς θετικό.

Ερωτήσεις αυτό-αξιολόγησης Ποια είναι τα κύρια συστατικά της αντίδρασης PCR Και ποια τα 3 θερμικά στάδια της κυκλοποίησης. Τι ονομάζουμε ζεύγος βάσεων; Τι είναι η DNA πολυμεράση. Ποιο ειδικό χαρακτηριστικό έχει η Taq Πολυμεράση; Η ιδιότητα των εκκινητών να επικολλούνται στην απολύτως συμπληρωματική τους περιοχή προσδίδει στην αντίδραση υψηλή ευαισθησία ή ειδικότητα; Γιατί κρατάμε το ένζυμο πολυμεράση στο ψυγείο μέχρι να το προσθέσουμε στην αντίδραση; Ο λόγος αφορά σε ευαισθησία ή ειδικότητα; Υψηλότερη θερμοκρασία επικόλλησης αυξάνει ή μειώνει την ειδικότητα ή την ευαισθησία, γιατί; Τι ονομάζουμε στην PCR “κύκλο αντίδρασης”; Τι περιέχουν οι μάρτυρες; Γιατί χρησιμοποιώ θετικό και γιατί αρνητικό μάρτυρα; Δείγμα θετικό και αρνητικός μάρτυρας θετικός, τι σημαίνει;

Επι-γενωμική: http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/intro/