Απόπτωση Βιολογία του κύτταρου-Βιοχημεία ΙΙ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΕΛΟΠΟΝΝΗΣΟΥ Σχολή Επιστημών Ανθρώπινης Κίνησης και Ποιότητας Ζωής Τμήμα Νοσηλευτικής Απόπτωση Βιολογία του κύτταρου-Βιοχημεία ΙΙ Ανδρέα Παόλα Ρόχας Χιλ PhD Επίκουρη Καθηγήτρια Βιολογίας-Βιοχημείας

Απόπτωση ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μία θεμελιώδης διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη όσο και για την άμυνα και διατήρηση της δομής και της οργάνωσης όλων των πολυκύτταρων οργανισμών.

Διαφορές μεταξύ απόπτωσης και νέκρωσης Ο κυτταρικός θάνατος είναι απαραίτητος για τη διατήρηση της ισορροπίας των κυτταρικών πληθυσμών στον ώριμο οργανισμό. Διακρίνουμε δύο διαφορετικές μορφές κυτταρικού θανάτου, τη νέκρωση και την απόπτωση.

Χαρακτηριστικά της νέκρωσης Προσβάλλει ομάδες κυττάρων. Η βλάβη στη μεμβράνη προκαλεί ανεξέλεγκτη εισροή στο κύτταρο ιόντων και Η2Ο, με αποτέλεσμα τη διόγκωση των κυττάρων και των οργανιδίων τους. Στον πυρήνα συμβαίνουν τα εξής : Η χρωματίνη συγκεντρώνεται σε μάζες ασαφούς περιγράμματος. Παρατηρείται αποδόμηση του DNA με τυχαία κατανομή και διάρρηξη της πυρηνικής μεμβράνης (καρυόλυση του πυρήνα). Η απώλεια ακεραιότητας της μεμβράνης οδηγεί σε λύση του κυττάρου, απελευθέρωση κυτταρικών συστατικών στον εξωκυττάριο χώρο και φλεγμονώδη αντίδραση. Είναι φανερό πως η διαδικασία της νέκρωσης δεν υφίσταται καμιά ρύθμιση

REAL-TIME EVENTS OF CELL DEATH APOPTOSIS

Μορφολογικά χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων Αλλαγές στον πυρήνα Συμπύκνωση χρωματίνης: χωρίζεται σε 2 μάζες που συνορεύουν στον πυρηνικό φάκελο. Παρουσία στρογγυλής ή οβάλ κοκκιώδους μάζας : προέρχεται από το κέντρο των πυρηνικών ινιδίων που βρίσκονται δίπλα στην άκρη της συμπυκνωμένης χρωματίνης. Η αναλογία πυρήνα που καταλαμβάνει η χρωματίνη ποικίλλει : είναι υψηλότερη στα λεμφοκύτταρα και χαμηλότερη στα κύτταρα με λιγότερη χρωματίνη.

Το DNA κομματιάζεται από ειδικές ενδονουκλέασες Η πυρηνική μεμβράνη αποδιοργανώνονται λόγω προτεόλυσης των λαμινών Ο πυρήνας κομματιάζεται σε διακριτά σωμάτια (καρυόξη) Αλλαγές στο κυτταρόπλασμα Συμπύκνωση Προεξοχές στην επιφάνεια του κυττάρου Αν υπάρχουν μικρολάχνες εξαφανίζονται

Η πυκνότητα αυξάνεται Σχηματισμός των αποπτωτικών σωματίων Το κύτταρο μικραίνει Η πυκνότητα αυξάνει Τα κυτταροπλασματικά οργανίδια συμπυκνώνονται Η φωσφατιδυλοσερίνη που κανονικά βρίσκεται στην εσωτερική λιπιδική στιβάδα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου, μεταναστεύει στην εξωτερική λιπιδική στιβάδα οπου και δεσμεύεται με υποδοχεις των μακροφάγων

Τα μιτοχόνδρια καταστρέφονται και ελευθερώνεται το κυτταρόχρωμα C Τα φαγοκύτταρα εκκρίνουν κυτταροκίνες που αναστέλλουν τη φλεγμόνη Το κύτταρο διασπάται σε κομμάτια που περιβάλλονται από μεμβράνη, τα αποπτωτικά σωμάτια. Τα αποπτωτικά σωμάτια περιλαμβάνουν τμήματα του πυρήνα και των οργανιδίων και προσλαμβάνονται με κυτταροφαγία από γειτονικά κύτταρα και τα μακροφάγα και καταλήγουν στα λυοσώματά τους. Με αυτό τον τρόπο δεν απελευθερώνουν το περιεχόμενο τους ώστε να προκαλέσουν απόκριση φλεγμόνης.

Παραδείγματα απόπτωσης Τα κύτταρα των γαλακτογόνων αδένων Η ούρα του γυρίνου, όταν μεταμορφώνεται σε βάτραχο (χάρη στην αύξηση της θυρεοειδούς ορμόνης στο αίμα) Ο σχηματισμός των δάκτύλων Διατηρεί σταθερό τον αριθμό των κύτταρων στους ιστούς Λειτουργεί ως αμυντικός μηχανισμός Παρεμποδίζει την εξάπλωση των ιών Παρεμποδίζει την εξάπλωση βλαβερών μεταλλαγών

Ο μορφογενετικός κυτταρικός θάνατος Αντιστοιχεί σε απόσυρση κυττάρων που πλεονάζουν κατά τη δημιουργία του σχήματος διαφόρων οργάνων. Παραδείγματα αποτελούν : Η αυλοποίηση του εντέρου κατά την ανάπτυξη του πεπτικού συστήματος στην εμβρυϊκή ζωή.

Η δημιουργία του νευρικού σωλήνα κατά την τρίτη εβδομάδα εμβρυϊκής ανάπτυξης. Από τη νευρική πλάκα, που αποτελεί την καταβολή του νευρικού συστήματος, προκύπτει η νευρική αύλακα. Στα χείλη της νευρικής αύλακας σχηματίζονται οι νευρικές πτυχές, οι οποίες συνενούμενες δίνουν τελικά το νευρικό σωλήνα.

Ο ιστογενετικός κυτταρικός θάνατος Παρατηρείται, όταν αλλάζει ο φαινότυπος στα κύτταρα, που σχηματίζουν έναν ιστό ή ένα όργανο, σε συνδυασμό με τις επαγωγικές αλληλεπιδράσεις κατά την κυτταρική διαφοροποίηση. Για παράδειγμα, ο μετάνεφρος μαζί με τον πρόνεφρο και τον μεσόνεφρο, αποτελούν κατά την εμβρυϊκή ζωή τις τρεις κύριες δομές του ουροποιητικού συστήματος. Στο μετάνεφρο παρατηρείται επιθήλιο-μεσεγχυματική αλληλεπίδραση.

Ο φυλογενετικός κυτταρικός θάνατος Παρατηρείται κατά την εκφύλιση πρόσκαιρων εμβρυϊκών οργάνων και την απομάκρυνση υπολειμματικών δομών ή κυττάρων. Παραδείγματα αποτελούν η απόπτωση των μεσεγχυματικών κυττάρων των βραγχιακών τόξων κατά την ανάπτυξη της στοματικής κοιλότητας και η εκφύλιση της στοματοφαρυγγικής μεμβράνης, η οποία ολοκληρώνεται μετά την τέταρτη εμβρυϊκή εβδομάδα

Απόπτωση νευρικών κυττάρων Απόπτωση νευρικών κυττάρων. Στο ανθρώπινο έμβρυο, 90% από τα νευρικά κύτταρα σε ορισμένες περιοχές του εγκεφάλου, πρέπει να πεθάνουν με τη σωστή σειρά και την κατάλληλη χρονική στιγμή, προκειμένου ο εγκέφαλος να αναπτυχθεί σωστά. Η απόπτωση σε αυτή την περίπτωση, εξισώνει τον αριθμό των αναπτυσσόμενων κυττάρων με τον αριθμό των κυττάρων στόχων, με τα οποία έρχεται σε επαφή.

Πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην απόπτωση Μεμβρανικές πρωτεϊνες Κυτταροπλαματικές πρωτεϊνες Κασπάσες (πρωτεΐνες εκτελεστές της απόπτωσης)

Ο ρόλος των κασπασών στον αποπτωτικό θάνατο Οι κασπάσες είναι μια εξελικτικά συντηρητική πρωτεϊνική οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεασών και διακρίνονται από Α. Την παρουσία κυστείνης στο ενεργό τους κέντρο Β. Την υψηλή συγγένεια σύνδεσης με κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος στα υποστρώματα στόχους Η μετατροπή του προ-ενζύμου σε ενεργό μέσω πρωτεόλυσης αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα γεγονότα έναρξης της απόπτωσης

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΣΠΑΣΩΝ ΜΕΣΩ ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗΣ ΑΝΕΝΕΡΓΟΣ ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ p20 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ p10 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΤΡΟ Asp Asp ΑΥΤΟΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΣΕ ΘΕΣΗ Asp ΕΡΕΘΙΣΜΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ ΤΕΤΡΑΜΕΡΗΣ ENEΡΓΟΣ ΚΑΣΠΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗ

ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA CAD ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑ Bax Η ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ CAD ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΟΝ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA

CASPASE-3 IN CELL CULTURE   in vivo assay CLEAVED AND ACTIVATED CASPASE-3 IN CELL CULTURE

ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΚΑΣΠΑΣΩΝ ΟΝΟΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ PARP (poly-ADP-ribose-polymerase) Πυρηνικό αντιγόνο ICAD (inhibitor of CAD) Αναστολέας DNA νουκλεάσης CAD Bid Μιτοχονδριακή πρωτεΐνη p21Cip1/Waf1 Αναστολέας κυτταρικού κύκλου Γ(κ)ελσολίνη Ρυθμιστής οργάνωσης κυτταροσκελετού ακτίνης Λαμίνες-Α, -Β Πυρηνικά αντιγόνα Πρωτεϊνική Κινάση-Cδ Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών Προ-κασπάση-3 Πρωτεόλυση PARP, ICAD Προ-κασπάση-8 Πρωτεόλυση Bid, προ-κασπάση-3 Προ-κασπάση-9 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΥΠΕΡ-ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Bcl-2 Αντι-αποπτωτική δράση Προ-αποπτωτική δράση Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1 Bad, Bak, Bax, Bid, Bik, Bim

Κατά τη διάρκεια του αποπτωτικού θανάτου έχουμε: Την κατάργηση της διακυτταρικής επικοινωνίας Την αποδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού Την παρεμπόδιση της αντιγραφής και επιδιόρθωσης του πυρηνικού DNA Τον Θρυμματισμό του πυρηνικού DNA

BCL-2 πρωτεΐνες Εμποδίζουν την απόπτωση μη επιτρέποντας την ελευθέρωση του κυττροχρώματος c από τα μιτοχόνδρια Και επομένος την ενεργοποιηση των κασπασών

Μηχανισμοί της απόπτωσης Α) απόπτωση που σηματοδοτείτε από μηνύματα που προέρχονται από το εσωτερικό του κύτταρου Β) απόπτωση που σηματοδοτείτε τους ενεργοποιητές του θανάτου που δεσμεύονται σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (TNF-a, η λεμφοτοξίνη και ο Fas)

Υποδοχείς θανάτου

ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ TNFR

ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΥΠΟΥ FAS APO-1L (FASL) APO-2L (TRAIL) APO-3L TNF FADD FADD FADD FADD TRADD TRADD CASPASE-8/10 CASPASE-8/10 CASPASE-8/10 CASPASE-8/10 DEATH EFFECTOR DOMAIN DEATH DOMAIN ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΥΠΟΥ FAS Πχ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα

Τι προκαλεί την απόπτωση;  Η κυτταρική σηματοδότηση της απόπτωσης συντελείται είτε με έλλειψη σημάτων επιβίωσης (αυξητικοί παράγοντες, ορμόνες), είτε με παρουσία σημάτων θανάτου (ακτινοβόληση, χημειοθεραπευτικά φάρμακα, συνδέτες, όπως Fas-L και υποδοχέας Fas, TNF και TNF-R).

Γ) απόπτωση που σηματοδοτείτε από ενώσεις που περιέχουν ενεργό οξυγόνο Μιτοχονδριακό μονοπάτι Στο μιτοχόνδριο κατά την απόπτωση παρατηρείται κατάρρευση του μηχανισμού μεταφοράς e- (πτώση επιπέδων ΑΤΡ), απελευθέρωση ενεργοποιητών πρωτεϊνικής φύσεως (CYTO-C / AIF) και απελευθέρωση ROS (reactive oxygen species).

Το μιτοχόνδριο αποτελεί πεδίο μάχης, όπου γίνεται προσπάθεια αναστολής της απόπτωσης από πρωτεΐνες της BCL-2 πρωτεϊνικής οικογένειας (Bcl-2 / Bcl-xl).

Η πρωτεΐνη BCL-2 εκφράσετε στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και δεσμεύει την πρωτεΐνη Apaf-1, Παρεμποδίζει την ενεργοποίηση του μονοπατίου της απότωσης. Κάποια βλάβη στο εσωτερικό του κύτταρο προκαλεί την απελευθέρωση της Apaf-1 και την είσοδο στις μιτοχονδριακές μεμβράνες των προ-αποπτωτικών μορίων Bax και Bak

Προκαλείται την εκροή των ενεργοποιτών των κασπασών, όπως του κυτταροχρώματος C (cytC) To CytC και η Apa-1 δεσμεύονται μεταξύ τους και με τη κασπάση 9, μαζί με ATP συγκροτεί το αποπτώσωμα

H αναλογία BAX/BCL-2 καθορίζει την επιβίωση ή το θάνατο ενός κυττάρου H αναλογία BAX/BCL-2 καθορίζει την επιβίωση ή το θάνατο ενός κυττάρου. Τα ομοδιμερή BAX/BAX επάγουν την απόπτωση, ενώ τα ομοδιμερή BCL-2/BCL-2 λειτουργούν ως καταστολείς της.

Το κυτόχρωμα C πυροδοτεί την ενεργοποίηση κασπασών μέσω της δημιουργίας του αποπτωσωματίου (Cyto-C/Apaf-1/Pro-caspace 9/ATP). Το Cyto-C αποτελεί την «εκκίνηση» ενός μηχανισμού ενεργοποίησης ενός μεγάλου αριθμού κασπασών, ο οποίος και τελικά θα οδηγήσει στην απόπτωση.

Ο Παράγοντας AIF (Apoptosis Inducing Factor) προκαλεί συμπύκνωση της χρωματίνης και μεγάλης κλίμακας κερματισμό του DNA. Αναστέλλεται από τον παράγοντα z VAD - fmk. Σημαντικός είναι και ο ρόλος των ROS (Reactive Oxygen Species), Η κατάρρευση της μεταφοράς e- στην αναπνευστική αλυσίδα έχει ως συνέπειες την παραγωγή ROS, την πτώση των επιπέδων του ΑΤΡ, λόγω διάρρηξης της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την νέκρωση. Πχ νευρόνες Είναι ανεξάρτητο από της κασπάσες

Όταν μεγάλο ποσοστό του Cyto C βγεί στο κυτοσόλιο, τότε παρατηρείται μεγάλη πτώση του ΔΨm στο μιτοχόνδριο, αύξηση στην παραγωγή ROS και μεγάλη πτώση των επιπέδων του ΑΤΡ. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η πλήρης διάρρηξη της εξωτερικής μεμβράνης και η νέκρωση του κυττάρου.

Το ενδοκυττάριο Ca+2 πιθανόν αποτελεί το σηματοδοτικό μόριο του θανάτου. Εξωθεί την εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης. Όλα αυτά οδηγούν στον κερματισμό του DNA.