ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΑΡΓΥΡΙΟΥ Κλινικός Εμβρυολόγος, PhD

 Ευρωπαϊκά Κράτη : % υπογόνιμα ζευγάρια - 60% ανδρικός παράγοντας  Λοιμώξεις : επίδραση στη γονιμότητα μέσω μηχανισμών, όπως : - αναστολή της σπερματογένεσης - βλάβες στη σπερματική λειτουργία - απόφραξη της σπερματικής οδού

Ορίζεται ως :  Σημαντική βακτηριοσπερμία (> 10 3 βακτήρια / mL εκσπερμάτισης )  Ανίχνευση Neisseria gonorrhoeae, C. trachomatis, Urea urealyticum  Σημαντική παρουσία λευκών αιμοσφαιρίων (> 10 6 θετικά στην περοξειδάση λευκοκύτταρα / mL εκσπερμάτισης )

Γόνιμοι Ανδρες Υπογόνιμοι Ανδρες ( x 1000 /mL) Σύνολο WBC Κοκκώδη Μακροφάγα – Μονοκύτταρα 51,9228 Β Λεμφοκύτταρα ND6,4 T 4 Λεμφοκύτταρα 4,114 Τ Λεμφοκύτταρα 2,217

 Αρρεν Αναπαραγωγικό Σύστημα : ανοσολογικά, προνομιούχο  Αιματορχικός φραγμός ( blood-testis barrier) 1. Προστασία ανωτέρων σταδίων του σπερματικού επιθηλίου και σπερμ / ρίων, τα οποία εκφράζουν μοναδικά αντιγόνα, διεγείροντας αυτο - ανοσολογικές απαντήσεις 2. Ισχυροί δεσμοί μεταξύ κυττάρων Sertoli 3. Φραγμός στην είσοδο λεμφοκυττάρων και αντισωμάτων στη σπερματογενετική σειρά  Λοιμωξιογόνοι μικροοργανισμοί Μετά την είσοδό τους στα σπερματικά σωληνάρια, επιβιώνουν επί μακρόν, διαφεύγοντας την αν o σοκαταστολή

 Βακτηριακή λοίμωξη : - μέσω ουρήθρας - στόχοι : επιδιδυμίδα, προστάτης  Ιική λοίμωξη : - μέσω ουρήθρας ή κυκλοφορίας αίματος - στόχοι : επιθηλιακά κύτταρα (HPV), νευρικά κύτταρα ( ερπητοϊός ), λευκά αιμοσφαίρια (HIV-1, CMV, EBV)  Μέθοδοι Υ. Α.: απομάκρυνση βακτηριακού και ιικού φορτίου από το σπέρμα, κυρίως του DNA/RNA του ιού

 Αίτια νοσημάτων : μικρόβια μέσω σεξουαλικής επαφής  Κλασσικά αφροδίσια νοσήματα : - Βλενόρροια - Σύφιλη - Μαλακόν έλκος - Αφροδίσιο ή βουβωνικό λεμφοκοκκίωμα - Αφροδίσιο ή βουβωνικό κοκκίωμα - Μη γονοκοκκική ουρηθρίτιδα - Οξυτενή κονδυλώματα - Ερπητας γεννητικών οργάνων - Μη ειδικές φλεγμονές της βαλάνου ( βαλανίτιδα ) - Ηπατίτιδα, AIDS - Ψώρα

 Βακτήρια : Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Theponema pallitum Cambylobacter sp Haemophilus ducreyi Calymmatobacterium granulomatis Gardenella vaginalis Mobiluncus cartisii Shigella sp Klebsiella granulomatis Cambylobacter sp Helicobacter cinaedi Mycobacteria spp

 Ιοί HSV I, II CMV HIV, HPV  Ιοί της ηπατίτιδας ( A,B,C)  Πρωτόζωα Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia  Εκτοπαράσιτα Sarcopties scabiei Pediculus pubis  Μύκητες Candida albicans

 Συχνές σε υπογόνιμους άνδρες (WHO, 1987)  Πρόκληση υπογονιμότητας λόγω : - μειωμένης γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων - επίδρασης της λοίμωξης του άρρενος γεννητικού συστήματος στο γυναικείο γεννητικό σύστημα

Υπάρχουν πολλοί μηχανισμοί, οι οποίοι δρώντας συνεργιστικά επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά του σπέρματος ανδρών με λοιμώξεις του γεννητικού συστήματος. Συνέπειες : - ολιγο - ή / και ασθενοσπερμία - σπέρμα φυσιολογικών παραμέτρων, αλλά μειωμένης γονιμοποιητικής ικανότητας

 Αλλαγές στη σύνθεση της μεμβράνης του σπερματοζωαρίου : μείωση ακροσωμικής αντίδρασης και γονιμοποίησης του ωαρίου  Οξειδωτικές βλάβες στο DNA του σπερμ / ρίου : αλλοιώσεις του γενετικού υλικού  Αλλοιώσεις της βιοχημικής σύνθεσης του σπερματικού πλάσματος : μείωση της in vitro γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερμ / ρίων  Βλάβες στον αιματορχικό φραγμό : υπογονιμότητα ανοσολογικής αιτιολογίας  Λειτουργικές και ανατομικές βλάβες : μη αναστρέψιμες μετά από θεραπεία με αντιβιοτικά

Σημαντικός ρόλος στους μηχανισμούς, οι οποίοι :  Ωθούν τα λευκοκύτταρα σε παραγωγή προ - φλεγμονωδών απαντήσεων  Έχουν την δυνατότητα καταστολής της λειτουργίας των φλεγμονωδών κυττάρων

ΛΟΙΜΩΞΗ ΠΑΘΟΓΟΝΟΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗΣ 8 (IL-8) ΜΕΙΩΣΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ

ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΙΣΤΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗΣ 1 (IL-1) ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΩΝ ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ : IL-8, ROS (Reactive oxygen species) ΜΕΙΩΣΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜ / ΡΙΩΝ

ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΙΣΤΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗΣ 1 (IL-1) ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΑΚΡΟΦΑΓΩΝ ΕΚΚΡΙΣΗ : IL-8,HGF (Hepatocyte Growth Factor), IL-6 IL-6 : - αντίδραση με Β - λεμφοκύτταρα - παραγωγή αντισωμάτων εναντίον παθογόνων - βλάβες στη κυτταρική μεμβράνη των σπερμ / ρίων - μείωση της γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερμ / ρίων

HGF IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 TUMOR NECROSIS FACTOR ( TNF)a Υποδοχείς TNF type I,II (sR) Υποδοχείς sR IL-2, sR IL-6, IL-1 receptor antagonist (RA)

Η παραγωγή κατάλληλων κυτοκινών εξαρτάται :  Από την φύση του παθογόνου μικροοργανισμού  Από το γενετικό υπόβαθρο του ατόμου. Ενας σημαντικός αριθμός γονιδίων ελέγχουν την παραγωγή κυτοκινών, γεγονός που καθιστά τα άτομα λιγότερο ή περισσότερο ανθεκτικά σε συγκεκριμένες λοιμώξεις.

 Οξειδωτικό στρες : ανισορροπία μεταξύ παραγωγής ROS (Reactive Oxygen Species) και επαρκούς εξουδετέρωσής τους από τους διαθέσιμους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς  Ευεργετικός ρόλος ROS 1. Συμμετοχή στην άμυνα του οργανισμού ( παραγωγή ROS και ενεργών αζωτούχων παραγόντων από ενεργοποιημένα φαγοκύτταρα ) 2. Συμβολή στην επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων 3. Ρόλος στην αναστολή της γήρανσης, μέσω της διαδικασίας της Ορμησης (Hormesis)

Οξειδωτικό στρες : σημαντικός ρόλος σε παθολογικές καταστάσεις : 1. Συμβολή στην ιστική βλάβη ( λόγω ακτινοβολίας και υπεροξίας ) 2. Συμμετοχή σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες ( νόσος Parkinson, Alzheimer, χορεία Huntington) 3. Συμμετοχή σε καρδιαγγειακές νόσους 4. Ρόλος σε συνέπειες υποξίας στα αγγειακά και στεφανιαία επεισόδια 5. Ρόλος σε νεοπλασίες, παθήσεις συνδετικού ιστού, χρόνιο καταθλιπτικό σύνδρομο, AIDS

Μικρά μόρια με βάση το Οξυγόνο, ιδιαίτερα ενεργά λόγω των μη συζευγμένων ηλεκτρονίων τους. Κυριότερα : 1. Υπεροξειδικό ανιόν ( Ο 2 - ) 2. Υπεροξείδιο του υδρογόνου ( Η 2 Ο 2 ) 3. Υδροξυλικό ιόν 4. Οργανικό υδροπεροξείδιο (ROOH) 5. Αλκόξυ (RO) και περόξυ (ROO) ρίζες 6. Υποχλωρικό οξύ (HOCl) 7. Περοξυνιτρικό ( ΟΝΟΟ -)

ROS: παράγονται σε μεγάλες ποσότητες, από : 1. Μακροφάγα 2. Ουδετερόφιλα 3. Σπερματοζωάρια 4. Αλλους τύπους κυττάρων, σε παθολογικές συνθήκες

 Οξειδωτικές βλάβες συμβαίνουν σε πολλά μόρια, όπως : - πρωτεϊνες - λιπίδια - νουκλεϊκα οξέα - υδατάνθρακες  « Θύματα » οξειδωτικού στρες θεωρούνται : - πρωτεϊνες ( δομικές ή / και κυτταροπλασματικές ) - μεμβράνες ( κυτταρικές, πυρηνικές ή / και μιτοχονδριακές ) - υδατανθρακικά σύμπλοκα

 Αναστολή αντιοξειδωτικών ενζύμων : μείωση προστασίας έναντι βλαβερής επίδρασης ριζών  Αναστολή άλλων ενζύμων : κυτταρική δυσλειτουργία  Αναστολή μεμβρανικών καναλιών : διαταραχή ιοντικής ισορροπίας  Συνάθροιση πρωτεϊνών : σχηματισμός Lewy bodys στα νευρικά κύτταρα  Βλάβη στο DNA: βλάβη γονιδιώματος και κυτταρικός θάνατος  Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία : δημιουργία μιτοχονδριακών οξειδωτικών μέσων και ελευθέρων ριζών  Εντονότερη φλεγμονώδης απάντηση

« Το παράδοξο του οξυγόνου »: - οξυγόνο : απαραίτητο για την ζωή, αλλά - μεταβολίτες του οξυγόνου ( π. χ.ROS): α ) τροποποίηση κυτταρικών λειτουργιών β ) κίνδυνος για επιβίωση του κυττάρου Επομένως : Είναι απαραίτητο να γίνεται συνεχής απενεργοποίηση των ROS, ώστε να εξασφαλίζεται η φυσιολογική κυτταρική λειτουργία, χάρη στους αντιοξειδωτικούς παράγοντες

 Ενζυματικοί 1. Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) 2. Καταλάση 3. Περοξειδάση της γλουταθειόνης (GPX)  Μη ενζυματικοί 1. Βιταμίνες C, E 2. Ρεσβερατρόλη ( βοτανικό αντιοξειδωτικό ) 3. Μελατονίνη 4. Λιποκαλίνες ( απομάκρυνση προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων )

Τρεις γραμμές άμυνας : 1. Πρόληψη 2. Αποφυγή – Παρεμπόδιση 3. Επιδιόρθωση : οι οξειδωτικοί παράγοντες επιφέρουν βλάβες που επιδιορθώνονται. Όμως : τα σπερματοζωάρια δεν διαθέτουν τα απαραίτητα ένζυμα και επομένως, η βλάβη δεν αποκαθίσταται. Συνέπεια : σπερματοζωάρια ευαίσθητα στην οξειδωτική προσβολή.

Α. Πηγές δημιουργίας 1. Ιδιοπαθής Μορφολογικά ανώμαλα σπερματοζωάρια : αυξημένη παραγωγή ROS και μειωμένη αντιοξειδωτική δυνατότητα 2. Ιατρογενής Τεχνικές Υ. Α. ( φυγοκέντριση, κρυοσυντήρηση ) προκαλούν αύξηση παραγωγής ROS

3. Τρόπος ζωής Κάπνισμα : - αύξηση 48% λευκοκυττάρων στο σπέρμα - αύξηση 107% των ROS - μείωση αντιοξειδωτικών μέσων - αύξηση οξειδωτικού στρες στα σπερμ / ρια Υπερβολική πρόσληψη αλκοόλ Ψυχολογικό στρες 4. Περιβαλλοντική Τοξικές ουσίες περιβάλλοντος : - οξειδωτικό στρες στον όρχι - δυσλειτουργία σπερματογένεσης - οξείδωση DNA σπερματοζωαρίων

5 - Κιρσοκήλη - Κρυψορχία ( υψηλά επίπεδα ROS και κατακερματισμός DNA, σε ασθενείς με ορχεοπηξία σε μικρή ηλικία ) - Συστροφή σπερματικού τόνου ( παρατεταμένη περίοδος ισχαιμίας, εισροή ενεργοποιημένων λευκοκυττάρων στους όρχεις, αύξηση ROS, νέκρωση γεννητικών κυττάρων, υπογονιμότητα ) 6 – Χρόνια νοσήματα - Σακχαρώδης διαβήτης : κατακερματισμός DNA - Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια - Αιμοσφαιρινοπάθειες ( π. χ. β - θαλασσαιμία )

Β. Μηχανισμός πρόκλησης βλάβης Αρρεν αναπαραγωγικό σύστημα ( φυσιολογία ): - ισορροπία μεταξύ παραγωγής και αποδόμησης ROS - ελάχιστη συγκέντρωση ROS για τα σπερματοζωάρια, ώστε να αποκτήσουν την γονιμοποιητική ικανότητα 1. Χαμηλά επίπεδα ROS, απαραίτητα στα σπερματοζωάρια : α ) αντίδραση ακροσώματος β ) υπερενεργοποίηση γ ) βελτίωση κινητικότητας δ ) επαγωγή διαντίδρασης με το ωάριο Διαντίδραση σπερματοζωαρίου - ωαρίου : α ) αύξηση ενδοκυττάριου Ca, ROS, κινάσης της τυροσίνης β ) πρόκληση αύξησης cAMP γ ) υπερενεργοποίηση σπερματοζωαρίου

2. Αυξημένα επίπεδα ROS: α ) καταστολή αντιοξειδωτικών μηχανισμών του σπερματοζωαρίου β ) πρόκληση οξειδωτικού στρες γ ) εν δυνάμει στόχοι : λιπίδια, πρωτεϊνες, νουκλεϊκά οξέα και υδατάνθρακες κυττάρου δ ) σπερματοζωάρια : ιδιαίτερα ευαίσθητα στις βλάβες λόγω οξειδωτικού στρες

Α. Υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης - Λιπίδια : πλέον ευαίσθητα μακρομόρια - Μεμβράνες σπερματοζωαρίων : πλούσιες σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs) - Κυτταρόπλασμα σπερματοζωαρίων : περιέχει χαμηλές ποσότητες αποικοδομητικών ενζύμων - Επίθεση ROS στα PUFAs, προκαλώντας την λιπιδική υπεροξείδωση - Ο βαθμός βλάβης εξαρτάται από : α ) την ποιότητα και την φύση των ROS β ) την χρονική στιγμή και την διάρκεια έκθεσης σε ROS γ ) εξωκυττάριους παράγοντες ( θερμοκρασία, συγκέντρωση οξυγόνου, σύσταση μικροπεριβάλλοντος σε ιόντα, πρωτεϊνες και αποικοδομητές ROS)

Β. Βλάβη στο DNA του σπερματοζωαρίου Προστασία DNA σπερματοζωαρίου από οξειδωτικό στρες : α ) ισχυροί δεσμοί μεταξύ των αλυσίδων του DNA β ) παρουσία αντιοξειδωτικών παραγόντων στο σπέρμα Η βλάβη στο DNA εμφανίζεται ως : α ) απαλοιφή γονιδίων β ) άνισος επιχιασμός γ ) τροποποίηση στις βάσεις του DNA δ ) μετακίνηση του πλαισίου ανάγνωσης ε ) κατατμήσεις στη μία ή και τις δύο αλυσίδες του DNA στ ) μεταλλάξεις στα γονίδια ( σημειακές, πολυμορφισμοί ) Αποτέλεσμα : - βλάβες στις παραμέτρους του σπέρματος - μείωση γονιμοποιητικής ικανότητας

Τεχνικές Υ. Α.: - πρόκληση οξειδωτικού στρες - αύξηση βλαβών στο DNA  Ενδομητρική σπερματέγχυση - κλασσική IVF: Οι ανωτέρω κίνδυνοι εκμηδενίζονται, γιατί η συνυπάρχουσα βλάβη της μεμβράνης του σπερματοζωαρίου δεν ευνοεί την γονιμοποίηση του ωαρίου από σπερματοζωάριο με βλάβη στο DNA.  Μέθοδος ICSI: Η βλάβη στη μεμβράνη του σπερματοζωαρίου ( φυσικός φραγμός ) δεν υφίσταται και επομένως, ένα σπερματοζωάριο με αλλοιωμένο DNA εισέρχεται στο εσωτερικό του ωαρίου

Ανώριμο σπερματοζωάριο Αυξημένη έκκριση κυτταροπλασματικών ενζύμων NADPH A υξημένη παραγωγή Ο 2 - Η 2 Ο 2 Υπεροξειδική βλάβη Βλάβη στο DNA ώριμων σπερματοζωαρίων

Γ. Βλάβη στην κινητικότητα του σπερματοζωαρίου Αυξημένη παραγωγή ROS: μείωση κινητικότητας Α ’ Υπόθεση Αύξηση παραγωγής ROS Μείωση φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών του σπερματοζωαρίου και ακινητοποίηση Ελάττωση της ρευστότητας της μεμβράνης ( απαραίτητη για σπερματο - ωαριακή σύντηξη )

Β ’ Υπόθεση Αύξηση παραγωγής ROS Παραγωγή Η 2 0 2, διάχυση στα κύτταρα Αναστολή δράσης ενζύμων (G-6-PDH) Μειωμένη διαθεσιμότητα NADPH Αθροιση οξειδωμένης και ανηγμένης γλουταθειόνης Μείωση αντιοξειδωτικής άμυνας σπερματοζωαρίου Αύξηση υπεροξείδωσης μεμβρανικών φωσφολιπιδίων

Απόπτωση : κυτταρικός θάνατος, σε σημαντικές φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες, όπως : 1. Προγραμματισμένη καταστροφή κυττάρων κατά την εμβρυογένεση ( οργανογένεση, εξελικτική εκφύλιση ) 2. Ορμονοεξαρτώμενη φυσιολογική εκφύλιση ( ενδομήτριο κατά την Ε. Ρ.) 3. Κυτταρική απαλοιφή σε πολλαπλασιαζόμενους πληθυσμούς ( κυτταρικός θάνατος σε όγκους ) 4. Απαλοιφή αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων στο θύμο αδένα ή κυτταρικός θάνατος από κυτταροτοξικά Τα κύτταρα

Σηματοδοτείται από παράγοντες, όπως : 1. Ακτινοβολία γ και UV 2. Ανεπάρκεια αυξητικών παραγόντων 3. Χημειοθεραπευτικοί παράγοντες 4. Στέρηση θρέψης 5. Διαμεμβρανικά σήματα σε υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης ( π. χ. TNFR)

Πραγματοποιείται με την : 1. Εξωγενή οδό (Death receptor pathway) Ενεργοποίηση από την σύνδεση μελών της TNF οικογένειας (Fas, TNFa, TRAIL) με υποδοχείς στην κυτταρική μεμβράνη και την επαγωγή της δράσης κασπασών. 2. Ενδογενή οδό (Stress pathway) Ενεργοποίηση από : α ) βλάβη στο DNA β ) ανεπάρκεια κάποιου αυξητικού παράγοντα γ ) ογκογονίδια

Οι δύο οδοί της απόπτωσης ( εξωγενής και ενδογενής ) είναι ανεξάρτητες ( εκτός κάποιων κυττάρων, όπως τα ηπατοκύτταρα ). Μοριακός έλεγχος της απόπτωσης : γονίδια bcl-2, bax, bag, bad, p53. H σχετική αναλογία έκφρασης των γονιδίων bax και bcl-2 καθορίζει τον κυτταρικό θάνατο

 Φυσιολογική σπερματογένεση Απόπτωση : - απώλεια 25-75% ώριμων σπερμ / ρίων - ρύθμιση από ενδορχικά ανδρογόνα και γοναδοτροπίνες - ενεργοποίηση από ουσίες ( πρωτεϊνες της κυτταρικής μεμβράνης )  Σπερματογένεση υπό οξειδωτικό στρες Υψηλά ROS: - διάσπαση μιτοχονδριακών μεμβρανών - απελευθέρωση κυτοχρώματος C - ενεργοποίηση ενζύμων ( κασπάσες 9,3) - συχνές κατατμήσεις στις αλυσίδες DNA - απόπτωση

Στην ανδρική υπογονιμότητα : 1. Το οξειδωτικό στρες 2. Η βλάβη στο DNA του σπερματοζωαρίου 3. Η απόπτωση συνιστούν έναν ΕΝΙΑΙΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ

1. Μειωμένη κινητικότητα 2. Τερατοσπερμία 3. Αυξημένος αριθμός φλεγμονωδών κυττάρων στο σπέρμα 4. Αυξημένο ιξώδες 5. Χαμηλό % γονιμοποίησης σε κλασσική IVF 6. Χαμηλό % κινητικότητας μετά από επώαση με ωάρια 7. Χαμηλό % σχηματισμού βλαστοκύστεων, όταν δεν ενοχοποιείται το θήλυ φύλο ( π. χ. αυξημένη ηλικία )

Λοιμωξιακός παράγοντας Αύξηση λευκοκυττάρων Οξειδωτική έκρηξη Αύξηση προφλεγμονωδών κυτοκινών Αύξηση προ - και αντι - οξειδωτικών ROS Οξειδωτικό στρες Αύξηση υπεροξείδωσης λιπιδίων στο σπέρμα Μείωση ποιότητας σπέρματος και γονιμοποιητικής ικανότητας Υπονιμότητα