ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΜΔΕ: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Οι μέθοδοι αλληλούχισης DNA Maxam-Gilbert και Sanger. Αυτοματοποίηση τεχνικών. Επιμέλεια:Καρακίτσου Μαρία-Σοφία Υπεύθυνος καθηγητής:Ροδάκης Γεώργιος

Μέθοδος Maxam – Gilbert(Chemical degradation method) Walter Gilbert ( γεν. 21Μαρτίου 1932) Βραβείο Νόμπελ 1980 Προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA Χημικές τεχνικές

. Insect Molecular Genetics, Second Edition

Ανάλυση της μεθόδου  Πέψη αλυσίδας DNA με ένζυμα περιορισμού.  Απομόνωση θραυσμάτων σε πηκτή αγαρόζης  Επισήμανση 5’ ακραίου νουκλεοτιδίου με ραδιοϊσότοπο με τη χρήση πολυνουκλεοτιδικής κινάσης. Molecular Cell Biology, Lodish, Berk, Darnell

Molecular Biology, Philip C. Turner, Alexander McLennan, Andy Bates, Mike White

 Το επισημασμένο δείγμα χωρίζεται σε τέσσερα μικρότερα και υπόκειται σε τέσσερις διαφορετικές σειρές χημικών αντιδράσεων  Μετασχηματισμός θέσης νουκλεοτιδίων σε θραύσματα διαφορετικού μήκους.  Διασπάσεις δίπλα στην Α και G μέσω κατεργασίας με θειικό διμεθύλιο.  Μεθυλίωση αδενίνης στο Ν 3Ν 3  Μεθυλίωση γουανίνης στο Ν 7.  Η γουανίνη μεθυλιώνεται πέντε φορές ταχύτερα από την αδενίνη  Θυμίνη (T) και κυτοσίνη (C) δεν αντιδρούν

Οργανική Χημεία, τόμος 2, John McMurry

Insect Molecular Genetics, Second Edition

Base specificity Chemical used for base alteration Chemical used for altered baseremoval Chemical used for strandcleavage GDimethylsulphatePiperidine A+GAcid Piperidine C+THydrazinePiperidine CHydrazine + alkaliPiperidine A>CAlkaliPiperidine  Διάσπαση μεθυλιωμένων νουκλεοτιδίων με χρήση πιπεριδίνης (αμίνη)  Διάσπαση αλυσίδας στα πυριμιδινικά κατάλοιπα με υδραζίνη.  Κατεργασία ακολουθούμενη από θέρμανση σε υδατικό διάλυμα πιπεριδίνης.

 Διαχωρισμός σε πηκτή πολυακριλαμίδης  Έκθεση του ηλεκτροφορήματος σε φωτογραφική πλάκα.  Εμφάνιση σκοτεινής ζώνης σε κάθε επισημασμένο τμήμα με 32 Ρ

Μειονεκτήματα μεθόδου  Προσδιορισμός περιορισμένου μήκους αλληλουχιών  Χρήση χημικών ουσιών ιδιαίτερα τοξικών  Πολυδάπανη  Χρονοβόρα  Όχι απόλυτα επαναλήψιμη  Τεχνικά προβλήματα

ΜΕΘΟΔΟΣ SANGER  Ενζυμική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας  Μετασχηματισμός θέσης νουκλεοτιδίων σε θραύσματα διαφορετικού μήκους.  Βραβείο Νόμπελ 1958 (ανάλυση της αλληλουχίας της ινσουλίνης)  Βραβείο Νόμπελ 1980 (ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων )

Κλασσική μέθοδος απαιτεί: Μονόκλωνο DNA Εκκινητές (primers) DNA πολυμεράση Τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dNTPs) Τριφωσφορικά διδεοξυριβονουκλεοτίδια (ddNTPs) Κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα httptml

Πιο αναλυτικα: Κλωνοποίηση της υπό μελέτη περιοχής σε πλασμίδιο Κοπή με ένζυμα περιορισμού Θερμική αποδιάταξη του δίκλωνου DNA στους 96 Μείωση θερμοκρασίας για υβριδοποίηση εκκινητή Το δείγμα χωρίζεται σε 4 μέρη που περιέχουν: Και τα 4 dNTPs (dATP, dGTP, d CTP, d TTP) Εκκινητές DNA πολυμεράση

Σήμανση εκκινητή ή ενός από τα dNTPs με ραδιενέργεια. Xρήση 32 P Χρόνος ημίσειας ζωής 14 ημέρες Έντονο σήμα Παραγωγή δευτερογενών ηλεκτρονίων Έντονη σκέδαση Ζώνες όχι καλά διακριτές

Χρήση 33 Ρ Πιο «αιχμηρές» ζώνες Εναλλακτική χρήση 35 S Παίρνει τη θέση ενός οξυγόνου από τη φωσφορική ομάδα και προκύπτει θειοφωσφορικό Μεγαλύτερος χρόνος ημίσειας ζωής (87 ημέρες) Μεγαλύτερη διάρκεια διατήρησης υποστρώματος «Αιχμηρές» ζώνες

ΑΛΛΑ……. Σε κάθε καθεμιά από τις 4 αντιδράσεις προστίθεται ένα από τα 4 ddNTPs(ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) Πολυμερισμός Σύνθεση συμπληρωματικού κλώνου μέχρι τυχαία ενσωμάτωση στο DNA κάποιου ddNTP Δημιουργία θραυσμάτων με διαφορετικό μέγεθος ανάλογα με τη θέση ενσωμάτωσης του ddNTP Θέρμανση παρουσία φορμαμιδίου (αποδιάταξη) Ανάλυση σε πηκτή πολυακριλαμίδης παρουσία ουρίας(αποδιατακτικός παράγοντας) Αυτοραδιογραφία Επαλήθευση με τη χρήση του άλλου κλώνου

Molecular Cell Biology (Lodish, Berk, Zipurski, Darnell)

Κλειδί της μεθόδου: αναλογία dNTPs και ddNTPs 100:1 Μια ένθεση ανά μόριο

Μειονεκτήματα Μικρές αποστάσεις μεταξύ δύο ζωνών που αντιπροσωπεύουν κάθε βάση Κίνδυνος για λάθος διάβασμα των βάσεωνΜειωμένη ακρίβεια Χρονοβόρος διαδικασία Δυσκολία στην αλληλούχιση περιοχών πλούσιων σε G-C(δημιουργία υπερμοριακών δομών – αλλαγή κινητικότητας) Δυνατότητα αλληλούχισης μέχρι 500 βάσεων σε ένα gel. Αρκετά δαπανηρή

ΟΜΩΣ….  Δυνατότητα αυτοματισμού της μεθόδου (ανάλυση εκατομμυρίων βάσεων)  Πλεονεκτεί από τη Μaxam –Gilbert λόγω αποφυγής χρήσης χημικών τοξικών ουσιών  Πιο απλή  Πιο εύκολη

Αυτοματοποιήση μεθόδου Sanger

 Η καινούρια τεχνολογία χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές (χρωμοφόρα).  Όλα τα απαραίτητα στοιχεία της αντίδρασης σε ένα σωληνάκι  Ο ραδιενεργά σημασμένος εκκινητής αντικαθίσταται από εκκινητη που είναι σημασμένος με χρωστική.  Εναλλακτικά γίνεται προσθήκη διδεοξυριβονουκλεοτιδίων σημασμένων με διαφορετικά χρώματα  Κατάλληλα ρομποτικά συστήματα όπου αναλύουν τα δεδομένα και εμφανίζουν χρωμογραφήματα με έγχρωμες κορυφές

Αυτόματοι αναλυτές προσδιορισμού αλληλουχίας νουκλεοτιδίων

Πλακέτα για 96 δείγματα

Στο εσωτερικό του sequencer … Τριχοειδείς σωλήνες Δείγμα για ανάλυση αντιδραστήρια

χρωμογράφηματα

DNA sequencing – wikipedia the free encyclopedia Σύγκριση ανάλυσης αλληλουχίας με τη χρήση αυτοραδιογραφίας και φλουορεσκείνης

Genomes 3, Terence A. Brown Θερμοανθεκτική πολυμεράση Χρήση δίκλωνου DNA Μικρή ποσότητα δείγματος Διεξαγωγή όπως και η PCR Χρήση όμως ενός μόνο εκκινητή THERME CYCLE SEQUENCING

 Μονόκλωνο DNA  Εκκινητές  Ένζυμα:DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase  Υποστρώματα ενζύμων adenosine 5' phosphosulfate (APS) και luciferin PYROSEQUENCING Υβριδοποίηση ανιχνευτή Προσθήκη dNTP DNA polymerase καταλύει ενσωμάτωση των dNTP Απελευθέρωση πυροφωσφορικού σε ποσότητα ίση με εκείνη του ενσωματωμένου νουκλεοτιδίου

. ATP sulfurilase μετατρέπει το Ppi σε ATP με τη βοήθεια του υποστρώματος του APS Τα ATP ενεργοποιούν τη luciferase που μετατρέπει τη luciferin σε oxyluciferin, η οποία εκπέμπει ορατό φως Το φώς ανιχνεύεται με CCD κάμερα και εμφανίζεται σα μια κορυφή στο πυρόγραμμα (pyrogram). Η apyrase συνεχώς αποδομεί τα μη ενσωματωμένα dNTPs και ATP. Όταν η αποικοδόμηση ολοκληρωθεί τότε προστίθεται ένα άλλο dNTP και η αντίδραση συνεχίζεται. Το φώς ανιχνεύεται με CCD κάμερα και εμφανίζεται σα μια κορυφή στο πυρόγραμμα (pyrogram). Βήμα 4 ο : Η apyrase συνεχώς αποδομεί τα μη ενσωματωμένα dNTPs και ATP. Όταν η αποικοδόμηση ολοκληρωθεί τότε προστίθεται ένα άλλο dNTP και η αντίδραση συνεχίζεται. Το φώς ανιχνεύεται με CCD κάμερα και εμφανίζεται σα μια κορυφή στο πυρόγραμμα (pyrogram). Βήμα 4 ο : Η apyrase συνεχώς αποδομεί τα μη ενσωματωμένα dNTPs και ATP. Όταν η αποικοδόμηση ολοκληρωθεί τότε προστίθεται ένα άλλο dNTP και η αντίδραση συνεχίζεται. Κάθε φορά προστίθεται και ένα dNTP. Καθώς η σύνθεση συνεχίζεται, το θυγατρικό DNA δημιουργείται και η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων προσδιορίζεται από τις κορυφές του πυρογράμματος

Insect Molecular Genetics, Second Edition. An introduction to Principles and Application, 2003, pages DNA sequencing and the Evolution on the “Omics “ Molecular Biology, Philip C. Turner, Alexander McLennan, Andy Bates, Mike White – 2005 Methods in molecular Biology,volume 23, dna sequencing protocols, edited by Griffin Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας, Alberts Οργανική Χημεία, McMurry Ncbi books Recombinant DNA Genomes 3, Terence A. Brown ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Molecular Cell Biology, Lodish, Berk, Darnell echnology/lec3/sanger.html echnology/lec3/sanger.html sequencer-works/ sequencer-works/ Wikipedia