Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΣΤΗΝ ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Νανοσωματίδια στην διάγνωση του καρκίνου ΒΑΡΣΑΜΙΔΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΥΠΕΥΘ.ΚΑΘ.: Κ. ΜΑΚΡΟΠΟΥΛΟΥ.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Η ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΣΤΗΝ ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Νανοσωματίδια στην διάγνωση του καρκίνου ΒΑΡΣΑΜΙΔΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΥΠΕΥΘ.ΚΑΘ.: Κ. ΜΑΚΡΟΠΟΥΛΟΥ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Η ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΣΤΗΝ ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Νανοσωματίδια στην διάγνωση του καρκίνου ΒΑΡΣΑΜΙΔΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΥΠΕΥΘ.ΚΑΘ.: Κ. ΜΑΚΡΟΠΟΥΛΟΥ

2 Φθορισμός Ένα μόριο ή QD απορροφά ενέργεια από τα φωτόνια που στέλνουμε στον στόχο μας Προκαλείται διέγερση όταν η ενέργεια είναι τουλάχιστον ίσης με το ενεργειακής διαφοράς (βασικής ενεργειακής στάθμης- διεγερμένης ενεργειακής στάθμης) και τότε το ηλεκτρόνιο μεταπίπτει στη διεγερμένη στάθμη Αποδιέγερση μετά από λίγο με επιστροφή του ηλεκτρονίου στην αρχική του θέση με εκπομπή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολία, φωτόνιο Εκπομπή χαμηλότερης ενέργειας (μεγαλύτερου μήκους κύματος) Η ενεργειακή διαφορά απορρόφησης – εκπομπής μετατρέπεται σε ταλάντωση ή θερμότητα Η διαφορά αυτή είναι το Stokes shift

3 Φθορισμός Fluorescence lifetime (χρόνος ζωής της κατάστασης διέγερσης) είναι το χρονικό διάστημα μεταξύ της διεγερμένης κατάστασης μέχρι την εκπομπή της φθορίζουσας ακτινοβολίας στο μόριο (εδώ ns) Fluorescence quantum yield (φθορίζουσα κβαντική απόδοση) είναι μέτρο απόδοσης φθορισμού ενός μορίου και ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των φωτονίων που εκπέμπονται με αυτών που απορροφούνται

4 QDs και Bulk Semiconductors Quantum Dots (κβαντική κηλίδα) είναι ένας μη οργανικός νανοκρυσταλικός ημιαγωγός Ημιαγωγοί είναι υλικά με μεγαλύτερη ηλεκτρική αγωγιμότητα από τους μονωτές και μικρότερη από τα μέταλλα η οποία όμως αυξάνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας

5 QDs και Bulk Semiconductors Το ενεργειακό διάκενο είναι μια παράμετρος των ημιαγωγών που διαχωρίζει την ζώνη σθένους από την ζώνη αγωγιμότητας και εξαρτάται από το υλικό Η παράμετρος αυτή δείχνει την ελάχιστη ενέργεια που χρειάζεται ένα ηλεκτρόνιο για να μεταπηδήσει από την ζώνη σθένους στην ζώνη αγωγιμότητας Το ζευγάρι ηλεκτρονίου και οπής που δημιουργείται ονομάζεται εξιτόνιο

6 QDs και Bulk Semiconductors Quantum Dots είναι ένας μη οργανικός νανοκρυσταλλικός ημιαγωγός Τα QDs αποτελούνται από 100 με 1000 ηλεκτρόνια ή 10 με 50 άτομα σε διάμετρο και έχουν μέγεθος 2 με 10 nm. To σχήμα τους είναι σφαιρικό και το μέγεθός τους είναι συγκρίσιμο με αυτό ενός εξιτονίου ή αλλιώς ίδιας τάξης με το BER (Exciton Radius,εξιτονική ακτίνα του Bohr)

7 QDs και Bulk Semiconductors Σημαντική διαφορά είναι ότι στις QDs μπορούμε να ορίσουμε τα μήκη κύματος που θα εκπέμψουν ενώ στους συμπαγείς είχαμε συνεχές φάσμα Αυτό οφείλεται στο quantum confinement effect (κβαντική παγίδευση), η αρχή δηλαδή που ορίζει τις οπτοηλεκτρονικές ιδιότητες να εξαρτώνται από το μέγεθος του QD

8 QDs και Bulk Semiconductors Προσθαφαιρώντας άτομα στα QDs ->μεταβάλλεις το ενεργειακό διάκενο ->ελέγχεις το μήκος εκπομπής ή μεταβάλλοντας το μέγεθος στα QDs ->μεταβάλλεις το ενεργειακό διάκενο ->ελέγχεις το μήκος εκπομπής Όσο μικρότερη είναι η κηλίδα τόσο πιο μπλε είναι το φωτόνιο εκπομπής και αντίστοιχα όσο πιο μεγάλη είναι τόσο πιο κόκκινη είναι η εκπομπή Το εύρος εκπομπής των QDs εκτείνεται από το υπεριώδες μέχρι το υπέρυθρο ( nm)

9 Στις βιολογικές εφαρμογές Μέχρι πρόσφατα χρησιμοποιούσαν οργανικές χρωστικές (dyes) και φθορίζουσες πρωτεΐνες. Η χρήση των QDs είναι καινούρια τεχνολογία Στην ‘βιολογική’ τους μορφή είναι κολλοειδή με μέγεθος όμοιο με μεγάλες πρωτεΐνες

10 Tα πλεονεκτήματα των QDs 1)Απορροφούν και εκπέμπουν φως με μεγάλη απόδοση, επιτρέποντας υψηλή ευαισθησία στην ανίχνευση. Molar extinction coefficient-μοριακός συντελεστής απορρόφησης) (0.5-2x10^6 /M cm για QDs) (5-10x10^4/ M cm για οργανικές χρωστικές-organic dyes) 2)Το σήμα (εκπομπής) τους είναι 10 με 20 φορές πιο φωτεινό (έντονο), επιτρέποντας την ανίχνευση και σε περίπτωση χαμηλής συγκέντρωσης καρκινικών ‘σημαδιών’ 3)Χίλιες φορές πιο ανθεκτικό στο φαινόμενο της φωτολευκότητας (photobleaching), έτσι παρακολουθούμε για μεγαλύτερο χρόνο τα βιολογικά συστήματα 4)Multicolor QDs χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό πολλών μοριακών στόχων ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΑ

11 Φωτολευκότητα (photobleaching) Το φαινόμενο στο οποίο τα μόρια χάνουν την ικανότητα φθορισμού και επανεκπομπής ακτινοβολίας

12 Multiplexing of QDs signals(πολυχρωματικά σήματα με κβαντικές κηλίδες) Είναι εφικτά εξαιτίας του ευρέως φάσματος απορρόφησης και τoυ στενού φάσματος εκπομπής (σχεδόν μονοχρωματικά, περίπου nm full width at half maximum). Το ευρύ φάσμα ‘ενεργοποίησης’ των κηλίδων μας επιτρέπει την διέγερση τους με μια πηγή φωτός χαμηλού μήκους κύματος.->απλοποιεί την διάταξη, αυξάνει την ταχύτητα ανίχνευσης και μειώνει το κόστος. Οι οργανικές χρωστικές και οι φθορίζουσες πρωτεΐνες σε αντιπαραβολή έχουν στενά φάσματα απορρόφησης και πλατιά φάσματα εκπομπής.

13 Αutofluorescent (Αυτοφθορισμός ουσιών του δείγματός μας) Το φαινόμενο αυτό οφείλεται σε χρωστικές του οργανισμού ή στο δείγμα που προκαλούν θόρυβο στο σήμα μας επηρεάζοντας αρνητικά την ευαισθησία ανίχνευσης. Πιο έντονο στο μπλε και πράσινο χρώμα Τα QDs ξεπερνάνε το πρόβλημα αυτό ρυθμίζοντάς τα να εκπέμπουν σε μήκη κύματος στο κόκκινο και υπέρυθρο όπου ο αυτοφθορισμός ελαχιστοποιείται. Τα QDs εκμεταλλεύονται το ευρύ φάσμα απορρόφησης-διέγερσης. Ενώ οι οργανικές χρωστικές έχουν φάσμα εκπομπής κοντά στο φάσμα διέγερσης.

14 Αutofluorescent (Αυτοφθορισμός)

15 Σύνθεση Φτιάχνονται από τα στοιχεία της ομάδας ΙΙ και VI (π.χ. CdSe,CdTe) ή ομάδα ΙΙΙ και V (π.χ. InP,InAs) του περιοδικού πίνακα. Η πιο συνηθισμένη QD είναι το CdSe (core) καλυπτόμενο από το ZnS (shell) το οποίο σταθεροποιεί τις χημικές και οπτικές ιδιότητες του πυρήνα. Η κβαντική κηλίδα προστατεύεται και παράλληλα προστατεύει τον οργανισμό από την τοξικότητά του με την χρήση του συνδέτη (ligand) TOPO (tri-n- octylphosphine oxide) Το νανοσωματίδιο καλύπτεται από μια μονοστοιβάδα, ένα στρώμα δηλαδή οργανικών συνδετών (ligands) που είναι διαλυτοί μόνο σε υδροφοβικά διαλύματα.

16 Σύνθεση

17 Στις βιοιατρικές εφαρμογές χρειαζόμαστε κηλίδες διαλυτές στο νερό Δυο στρατηγικές:α) ανταλλάσουμε τον υδροφοβικό συνδέτη (ligand) με υδρόφιλο -> μείωση της ικανότητας φθορισμού και αύξηση η τοξικότητας. β) προσθέτουμε αμφίφιλα πολυμερή όπου το υδρόφοβο τμήμα (κυρίως υδροξύλια) ενώνεται με το ΤΟΡΟ προστατεύοντάς το από την υδρόλυση, ενώ το υδρόφιλο τμήμα (polyethylene glycol, PEG) καθιστά το QD διαλυτό στο νερό(water soluble) Το τελικό μας προϊόν διατηρεί τις οπτικές ιδιότητες (absorption spectra, emission spectra, fluorescence quantum yields)

18 Σύνθεση Τέλος ενώνουμε το polymer-coated QDs με βιοσυγγενής συνδέτες (affinity ligands)

19 QDs

20 Διάγνωση καρκίνου In vitro διάγνωση = δείγμα ιστού, αίματος ή άλλου υγρού που τοποθετείται σε βάση και μελετάται ο φθορισμός του με μικροσκόπιο In vivo διάγνωση = η διαδικασία στόχευσης και απεικόνισης του καρκίνου γίνεται μέσα στο ζωντανό οργανισμό

21 In vitro διάγνωση Ανίχνευση πρωτεϊνών Ανίχνευση νουκλεϊκών αλυσίδων Πολλαπλή ανίχνευση νουκλεϊκών αλυσίδων

22 Ανίχνευση πρωτεϊνών ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)->>χρονοβόρα, πολύπλοκη, όχι πολλαπλή ανίχνευση, ακριβή QDs μεγαλύτερη ευαισθησία, γρήγορη και εύκολη διαδικασία, φτηνή, ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών πρωτεϊνών, εκμεταλλεύονται την απουσία photobleaching ( φωτολευκότητας) ->συνεχή απεικόνιση του σήματος

23 Ανίχνευση πρωτεϊνών Συγκεκριμένες πρωτεΐνες δηλώνουν την παρουσία καρκίνου Το QD λειτουργεί σαν διακόπτης φθορισμού Ενώνεται με μία άλλη ουσία που δεν παρέχει φθορισμό (μη χρωστική)

24 Ανίχνευση πρωτεϊνών Ακτινοβολούμε το QD (δότης) και το μήκος κύματος εκπομπής του απορροφάται από την ουσία (nonfluorescence dye, αποδέκτης)->>FRET (Fluorescence resonance energy transfer) Η παρουσία της πρωτεΐνης σπάει τον δεσμό και επιτρέπει την ανίχνευση του φθορισμού (60% αποτελεσματικότητα) του QD

25 FRET ( Fluorescence resonance energy transfer, φθορίζουσα μεταφορά ενέργειας ) H απόδοση (Ε) εξαρτάται από την απόσταση δότη- αποδέκτη (donor-acceptor), την αλληλοεπικάλυψη του φάσματος εκπομπής του δότη και του φάσματος απορρόφησης του αποδέκτη. r= απόσταση δότη-αποδέκτη (donor-acceptor), R o η απόσταση για 50% απόδοση τ' D και τ D είναι του δότη fluorescence lifetimes (χρόνος ζωής της κατάστασης διέγερσης) για παρουσία και απουσία δέκτη αντίστοιχα

26 Ανίχνευση νουκλεικών αλυσίδων Η διάγνωση του καρκίνου μπορεί να συνδέεται με την ύπαρξη μεταλλαγμένων γονιδίων λόγω π.χ. κληρονομικής προδιάθεσης

27

28 Ανίχνευση νουκλεικών αλυσίδων Ο ένας κλώνος της αλυσίδας DNA ενός γονιδίου ενώνεται με τις συμπληρωματικές αλυσίδες ανίχνευσης (capture probe και reporter probe) Διεγείρουμε το QD με ακτινοβολία στα 488nm και η εκπομπή που παίρνουμε είναι στα 605 nm Όταν υπάρχει η μεταλλαγμένη αλυσίδα τότε η φθορίζουσα ουσία μπορεί να ενεργοποιηθεί από το μήκος εκπομπής του QD λόγω του FRET Εκμεταλλευόμαστε ότι το acceptor reporter dye δεν διεγείρεται από μικρά μήκη κύματος Ανιχνεύουμε με μεγάλη ευαισθησία μικρές διαφορές ανάμεσα σε αλυσίδες καθώς και την ποσότητά τους

29 Πολλαπλή ανίχνευση νουκλεικών αλυσίδων Τα QDs συνδυάζονται σε αλυσίδες (microbeads) - >>κωδικός Με 6 QDs χρώματα(m) εκπομπής και 10 QDs επίπεδα έντασης(n) έχουμε 1 εκατομμύριο συνδυασμούς (n^m-1 συνδυασμοί) Εδώ χρήση τριών χρωμάτων.

30 Πολλαπλή ανίχνευση νουκλεικών αλυσίδων

31 Κάθε microbead είναι συνδεδεμένο με μια ακολουθία νουκλεοτιδίων (20 νουκλεοτίδια) Τα μόρια του DNA έχουν ‘σημαδευτεί’ με μια φθορίζουσα ουσία Όταν υπάρχουν συμπληρωματικές αλυσίδες αυτές ενώνονται Με οπτική φασματοσκοπία παίρνουμε δύο σήματα (όταν υπάρχει η συμπληρωματική αλυσίδα DNA ), του κωδικού και του στόχου για κάθε microbead O κώδικας προσδιορίζει την ακολουθία του DNA ενώ το target signal φανερώνει την παρουσία της συγκεκριμένης αλυσίδας καθώς και το πλήθος της (ανάλογα πόσες φορές παίρνουμε τον συγκεκριμένο συνδυασμό).

32 In vivo διάγνωση Οι κλινικές μέθοδοι απεικόνισης του καρκίνου στον άνθρωπο που χρησιμοποιούμε σήμερα είναι Ultrasound CT, X-Ray CT, PET (SPECT), MRI Εκτός των άλλων μειονεκτημάτων, δεν δίνει πληροφορίες σε μοριακό επίπεδο και δεν έχουν την δυνατότητα ανίχνευσης στα πολύ αρχικά στάδια του καρκίνου Η οπτική (φθορίζουσα) απεικόνηση παρέχει διακριτική ικανότητα (θεωρητικά) της τάξεως nm, αλλά το μεγάλο πρόβλημα-μειονέκτημα της είναι η πολύ μικρή διεισδυτικότητά της ορατής ακτινοβολίας στους βιολογικούς ιστούς Υπάρχει όμως ένα οπτικό παράθυρο στο κοντινό υπέρυθρο που επιτρέπει την οπτική απεικόνιση μεγάλου βάθος (deep-tissue optical imaging) (χιλιοστά-λίγα εκατοστά)

33 In vivo διάγνωση Αυτό οφείλεται στην σκέδαση Rayleigh που μειώνεται με την αύξηση του μήκος κύματος (Rayleigh cross section αντιστρόφως ανάλογο του λ^4 (~λ^-4) και στο γεγονός ότι τα θηλαστικά εμφανίζουν ένα ελάχιστο στην απορρόφηση από τους ιστούς σ’αυτό το παράθυρο Οι οργανικές ουσίες που εκπέμπουν σ’αυτό το μήκος κύματος είναι ελάχιστες και επίσης πάσχουν από το φαινόμενο της φωτολευκότητας ( photobleaching effect) Αυτό που γίνεται στα QDs είναι ότι τα κύματα εκπομπής ‘ενεργοποιούνται’ από το κοντινό υπέρυθρο (ΝΙR)

34 Στόχευση και απεικόνιση όγκων Πολυλειτουργικά QDs περικλείονται από αμφίφιλα triblock copolymer (ΤΟΡΟ) για in vivo προστασία, συνδέτες (ligands) για καρκινική στόχευση και PEG (polyethylene glycol) για να βελτιώσουν την βιοσυμβατότητα και την κυκλοφορία (διάρκεια ζωής) Τα QDs μεταφέρονται στους καρκινικούς όγκους είτε παθητικά είτε ενεργά

35 Στόχευση και απεικόνιση όγκων

36 Παθητικά :Tα νανοσωματίδια συσσωρεύονται στους όγκους μέσω της ενισχυμένης διαπερατότητας των αγγειακών τοιχωμάτων που προκαλείται από Angiogenic tumors->> διαρροή μακρομορίων και μικρών σωματιδίων. Επίσης στερείται ενός αποτελεσματικού λεμφαδενικού συστήματος Ενεργά : χρήση συγγενών αντισωμάτων για στόχευση του PSMA (prostate specific membrane antigen)το οποίο έχει αναγνωριστεί από πριν ως υπεύθυνο του προστάτη H παθητική στόχευση είναι πιο αργή από την ενεργή αλλά πιο εύκολη Υψηλή συγκέντρωση QDs σε μία περιοχή σημαίνει καρκίνος

37 Αγγειακή απεικόνηση QDs χρησιμοποιούνται για παθητική απεικόνιση αγγειακών συστημάτων Με την τεχνική Two-photon excitation (διέγερση δύο φωτονίων) τα QDs διεγείρονται από το διεισδυτικό NIR και εκπέμπουν στο ορατό φάσμα παρόλο την ισχυρή απορρόφηση και σκέδαση του ορατού από τους ιστούς Ιδανικό NIR emitting QDs ( εκπομπή στο κοντινό υπέρυθρο) O circulating lifetime (χρόνος ζωής κυκλοφορίας) εξαρτάται από το μέγεθος και της χημικές ιδιότητες. Organic dyes πολύ γρήγορα απομακρύνονται από το κυκλοφορικό σύστημα (min,λεπτά) ενώ τα QDs είναι αρκετά μεγάλα για να καθαριστούν από τα νεφρά, έτσι απομακρύνονται από φαγοκύτταρα του RES (reticuloendothelial system) που βρίσκονται στο συκώτι, στον σπλήνα και στους λεμφαδένες (48-72h)

38 Ενεργή στοχοποίηση Δύο ποντίκια ένα υγιές και ένα με καρκίνο QDs-PSMA Ab έχει εγχυθεί a) η αυθεντική απεικόνιση Με αλγόριθμους: b) αυτοφθορισμός background (autofluorescent) c) QDs σήμα d) η σύνθεση των δύο πάνω

39 Προβλήματα για το μέλλον Μικρή διεισδυτικότητα (λόγω απορρόφησης και σκεδάσεων) της ακτινοβολίας στους ιστούς Τοξικότητα των QDs που μας απαγορεύει προς το παρόν την κλινική χρήση

40 Βιβλιογραφία Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer Andrew M Smith, Shivang Dane, Shuming Nie,Lawrence True and Xiahu Gao Expert Rev (2006) In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots Xiaohu Gao1, Yuanyuan Cui2, Richard M Levenson3, Leland W K Chung2 & Shuming Nie1 Article Nature Biotechnology 22, (2004) Application of nanotechnology to biotechnology Jennifer L West and Naomi J Halas Current Opinion in Biotechnology (2000) Quantum-dot-target microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules Mingyong Han, Xiaohu Gao, Jack Z Su and Shuming Nie Nature Publishing Group (2001) Quantum Dots paper Magda-Batista Carver (2006) Going small for big advances NCI (National cancer institute) article (2004)


Κατέβασμα ppt "Η ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΣΤΗΝ ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Νανοσωματίδια στην διάγνωση του καρκίνου ΒΑΡΣΑΜΙΔΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΥΠΕΥΘ.ΚΑΘ.: Κ. ΜΑΚΡΟΠΟΥΛΟΥ."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google