Τα είδη των χρωματογραφιών

Παρουσίαση με θέμα: "Τα είδη των χρωματογραφιών"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Τα είδη των χρωματογραφιών

2 Χρωματογραφία χάρτου - Paper Chromatography
Η στατική φάση είναι κάποιο πορώδες χαρτί (διηθητικό/χρωματογραφικό χαρτί, φίλτρο καφέ, εφημερίδα) Μια μικρή σταγόνα δείγματος τοποθετείται με πιπέττα σε σημείο κοντά στην άκρη του χάρτου Το χαρτί τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει μια ποσότητα διαλύτη (κινητή φάση) και σφραγίζεται (νερό, αιθανόλη κ.λπ.) Καθώς ο διαλύτης ανέρχεται μέσω του χαρτιού συναντάει το δείγμα το οποιο ανέρχεται κι αυτό μαζί με το διαλύτη Το χαρτί είναι κυτταρίνη, μια πολική ένωση Μη πολικές ενώσεις διανύουν μεγαλύτερες αποστάσεις στο χαρτί Οι πολικές ενώσεις αλληλεπιδρούν με το χαρτί και δεν διανύουν μεγάλες αποστάσεις

3 Χρωματογραφία χάρτου Μείγματα τα οποία περιέχουν χρωστικές ή σχηματίζουν έγχρωμα προϊόντα μπορούν να αναλυθούν στα συστατικά τους χρώματα Συστατικά του μείγματος με μεγαλύτερη συγγένεια για τη στατική φάση από ότι για την κινητή μετακινούνται με χαμηλότερη ταχύτητα Για το ίδιο δείγμα, ίδια κινητή και ίδια στατική φάση τα χρωματογραφικά αποτελέσματα (patterns) είναι ίδια και σταθερά Μέθοδος ποιοτικού προσδιορισμού συστατικών – εφόσον υπάρχει μέτρο σύγκρισης Δυνατότητα αποκοπής των κηλίδων και επαναιώρησής τους σε κατάλληλο διαλύτη  απομόνωση συστατικού

4 Αλλαγή κινητής φάσης αλλάζει και το αποτέλεσμα της χρωματογραφίας
Επιλογή διαλυτών Αλλαγή κινητής φάσης αλλάζει και το αποτέλεσμα της χρωματογραφίας

5 Λόγος μετώπου ή συντελεστής ανάσχεσης Rf
Είναι χαρακτηριστικός για κάθε ουσία Βοηθά στο καθορισμό του είδους της

6 Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin layer chromatography – ΤLC)
Τεχνική παρόμοια με τη χρωματογραφία χάρτου Αντί για χαρτί ως στατική φάση χρησιμοποιείται ένα λεπτό στρώμα προσροφητικού υλικού πάνω σε μια επίπεδη αδρανή επιφάνεια Πηκτή πυριτίας, αργιλιοξείδιο ή καθαρή κυτταρίνη Είναι γρηγορότερη τεχνικη από τη χρωματογραφία χάρτου και δίνει καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών Στατική φάση: ανόργανο οξείδιο (SiO2 ή Al2O3) Μορφή στατικής φάσης: λεπτή στοιβάδα πάνω σε γυάλινο ή πλαστικό πλακίδιο Κινητή φάση: διαλύτης ή σύστημα διαλυτών

7 GLC HPLC Διήθησης σε πηκτή Ιοντοανταλλαγής Συγγένειας
Χρωματογραφία στήλης GLC HPLC Διήθησης σε πηκτή Ιοντοανταλλαγής Συγγένειας

8 GLC – Gas-liquid chromatography
Η πρώτη χρωματογραφική μέθοδος που αναπτύχθηκε εμπορικά Εύκολη παραγωγή σταθερής ροής και πίεσης για την κινητή φάση (αέριο) Συμπιεσμένο αέριο, ρυθμιστής πίεσης και βαλβίδα Εξάτμιση δείγματος με υψηλές θερμοκρασίες Κατανομή συστατικού μεταξύ στατικής φάσης (υγρή σιλικονούχος ουσία) και κινητης αέριας φάσης (κυρίως ήλιο ή άζωτο) Υψηλή πτητικότητα του συστατικού ευνοεί την συγκέντρωσή του στην κινητή αέρια φάση Υψηλή διαλυτότητα του συστατικού στην στατική φάση εμποδίζει τη γρήγορη μετακίνησή του στη στήλη Από τις πιο διαδεδομένες μεθόδους διαχωρισμού στην αναλυτική χημεία Όχι τόσο στη βιοχημεία διότι οι υψηλές θερμοκρασίες μετουσιώνουν τα βιολογικά μακρομόρια (κυρίως πρωτεΐνες)

9 GLC – Gas-liquid chromatography

10 GLC – Ρύθμιση ροής κινητής φάσης (αερίου)

11 GLC – εισαγωγή δείγματος (sample injection)
Απλή διαδικασία Χρήση συριγγών Λανθασμένη τεχνική εισαγωγής οδηγεί σε λάθη στην ακρίβεια των αποτελεσμάτων Αυτόματη και χειρωνακτική μέθοδος εισαγωγής 0,1-10μl τυπικό μέγεθος δείγματος για υγρά 0,5-5ml τυπικό μέγεθος δείγματος για αέρια

12 GLC – εισαγωγή δείγματος (sample injection)
Ειδικές θύρες (injection port) ή βαλβίδες (injection valve) στον χρωματογράφο Στόχος: να εξατμίσει στιγμιαία το δείγμα και να το εισάγει στη στήλη Θερμοκρασία θύρας > 50oC υψηλότερη από τη θερμοκρασία της στήλης Η εισαγωγή του δείγματος γίνεται διαμέσω ενός διαφράγματος Σταθερό στη θερμοκρασία της θύρας/βαλβίδας Συχνή αλλαγή Επενδεδυμένη επιφάνεια γνωστού εμβαδού για την εξάτμιση του δείγματος Συνήθως γυάλινο ή μεταλλικό Απαραίτητη η αντικατάστασή του ανά τακτά διαστήματα Προϊόντα διάσπασης και μη-πτητικά συστατικά καταλήγουν εδώ

13 GLC – εισαγωγή δείγματος (sample injection)
Βαλβίδα εισαγωγής

14 Ανοξείδωτο ατσάλι ή γυαλί
GLC – στήλες (columns) Κατηγοριοποίηση ανάλογα με τη διάμετρο της στήλης και το υλικό της στατικής φάσης Ανοξείδωτο ατσάλι ή γυαλί Συμβατικές 3-6mm εσωτερική διάμετρος 2-6m μήκος Παρασκευαστικές 6mm εσωτερική διάμετρος >3m μήκος Τριχοειδείς 0,1-0,5mm εσωτερική διάμετρος 10-100m μήκος

15 GLC – στατική φάση GSC: H στατική φάση μπορεί να είναι μια στερεή ουσία Η ανάσχεση τότε είναι μέσω προσρόφησης GLC: Συνήθως είναι σε υγρή μορφή Η ανάσχεση και ο διαχωρισμός γίνεται μέσω διαφορετικής κατανομής των συστατικών Υψηλό σημείο ζέσεως της στατικής φάσης και υψηλή θερμική σταθερότητα σε παρατεταμένες θερμοκρασίες > 200°C Η στατική φάση είναι προσκολλημένη στο εσωτερικό γυάλινου ή μεταλλικού σωλήνα Η στατική φάση συγκρατείται από μια εσωτερική στερεή επένδυση Αφήνει την κινητή φάση να διαπερνά ελεύθερα Μεγάλη επιφάνεια για εξισορρόπηση των φάσεων του δείγματος

16 Η κινητή αέρια φάση εξυπηρετεί το ρόλο του μεταφορέα αερίων ουσιών
GLC – κινητή φάση Η κινητή αέρια φάση εξυπηρετεί το ρόλο του μεταφορέα αερίων ουσιών Αδρανές αέριο – δεν πρέπει να αλληλεπιδρά χημικά με τα συστατικά του αερίου μείγματος προς ανάλυση Ούτε με τη στατική φάση Αντίθετα, η υγρή χρωματογραφία στηρίζεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ του συστατικού και της κινητής φάσης Τα αέρια που χρησιμοποιούνταο συχνότερα στης κινητή φάση είναι He, Ar, N2, H2, CO2 Είναι απαραίτητο να ρυθμίζεται η ροή των αερίων ώστε να παραμένει σταθερή κατά τη διάρκεια της όλης διαδικασίας της χρωματογραφίας

17 GLC – χρωματογράφημα Ιδανικά, κάθε κορυφή (1-6) αντιστοιχεί σε ένα συστατικό Ο χρόνος που αντιστοιχεί στην αιχμή της κορυφής είναι ο χρόνος ανάσχεσης (Rt) Σταθερός για ένα συστατικό υπό τις ίδιες συνθήκες στην ίδια στήλη

18 Ανάλυση μικρών πτητικών συστατικών Ανάλυση λιπαρών οξέων στο αίμα
GLC – εφαρμογές Ανάλυση μικρών πτητικών συστατικών Ανάλυση λιπαρών οξέων στο αίμα (υπό τη μορφή μεθυλεστέρων) Ανάλυση αλκοολών και κετονών στο αίμα (μεθανόλη, αιθανόλη, ακεταλδεΰδη, ακετόνη, ισοπροπανόλη) Διαχωρισμός cis- και trans- ισομερών λιπαρών οξέων Ανάλυση αλκαλοείδών και στεροείδών

19 Υγρή χρωματογραφία – Liquid Chromatography
Η κινητή φάση είναι στην υγρή μορφή Οποιοδήποτε συστατικό μπορεί να αναλυθεί με LC Προσρόφηση Ιοντοανταλλαγή Κατανομή Αποκλεισμός Η στατική φάση είναι σε στερεά μορφή Επίπεδη χρωματογραφία (χάρτου, TLC) Χρωματογραφία στήλης

20 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High pressure liquid chromatography Υπερνικά τις επιπτώσεις της πλάτυνσης των κορυφών με τη χρήση υψηλών πιέσεων και ειδικά διαμορφωμένης στατικής φάσης rpHPLC: Περίπου αντίστροφο χρωματογράφημα Γρηγορότερη τεχνική από την απλή LC

21 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Πολική στατική φάση μη πολική κινητή φάση Πολικά συστατικά εκλούονται τελευταία Αντίστροφη HPLC (reverse phase): Μη πολική στατική φάση πολική κινητή φάση Πολικά συστατικά εκλούονται πρώτα

22 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

23 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Μηχανισμός εισαγωγής δείγματος Δεξαμενή κινητής φάσης Αντλία υψηλής πίεσης Επεξεργαστής Ανιχνευτής Εκτύπωση χρωματογρα-φήματος Συλλέκτης κλασμάτων

24 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
H στατική φάση στην HPLC είναι silica, alumina (3-10 μm beads) Η κινητή φάση στην  RP-HPLC μπορεί να είναι νερό, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα Η στατική φάση στην RP-HPLC είναι τροποποιημένη silica με δεκαοκτασιλάνιο – octadecylsilane (ODS - C18H37) Υδροφοβη ομάδα  υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τα συστατικά του μείγματος Μίξη διαφορετικών διαλυμάτων κινητής φάσης μπορεί να λάβει χώρα αυτοματοποιημένα για την παραγωγή μιας βαθμίδωσης Η βαθμίδωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σταδιακή έκλουση των συστατικών

25 Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή - GFC
Size exclusion chromatography (SEC) ή gel permeation chromatography (GPC) ή gel filtration chromatography (GFC) Ο διαχωρισμός των συστατικών του μείγματος γινεται με βάση το μοριακό τους βάρος Υδροδυναμική διάμετρος/υδροδυναμικός όγκος/ακτίνα Stokes Τεχνική χαμηλής ανάλυσης Συνήθως το τελευταίο βήμα μιας στρατηγικής απομόνωσης

26 GFC Το μείγμα (συνήθως βιολογικών μακρομορίων) «φορτώνεται» στη στήλη
Η στήλη περιέχει τη στατική φάση, μια πορώδη ρητίνη ή πηκτή Ανάλογα με το υλικό σχηματίζονται και πόροι διαφορετικού μεγέθους Τα μεγάλα μόρια δεν χωρούν να περάσουν μέσα από τους πόρους και ακολουθούν μια πορεία εκτός των σωματιδίων της πηκτής Εκλούονται πρώτα Μόρια ενδιαμέσου μεγέθους διαπερνούν τους πόρους σε διαφορετικό βαθμό Εκλούονται ενδιάμεσα Πολύ μικρά μόρια διαπερνούν εντελώς τους πόσους της πηκτής  Εκλούονται τελευταία

27 GFC

28 GFC Αρχικό μείγμα μεγάλων και μικρών μορίων Ρητίνη διήθησης
(beads = σφαιρώματα, κοκκία) Τα μικρά μόρια περιέχονται (are included) στους πόρους της πηκτής και εκλούονται τελευταία Τα μεγάλα μόρια εξαιρούνται (are excluded) από τους πόρους και εκλούονται πρώτα

29 GFC

30 GFC

31 GFC Τα μόρια που είναι μεγαλύτερα από το μέγεθος των μεγαλύτερων πόρων της πηκτής εξαιρούνται απο αυτούς και εκλούονται σε όγκο ίσο με το Vo (void volume = όγκος εκτός των beads) Τα μόρια που είναι ενδιάμεσα σε μέγεθος διαπερνούν τα beads σε διαφορετική έκταση το καθένα (ανάλογα με το μέγεθος) Εκλούονται σε όγκο Ve (διαφορετικός για κάθε ενδιάμεσο συστατικό) Τα μόρια που είναι μικρότερα σε μέγεθος από τους μικρότερους πόρους της πηκτής εκλούονται σε όγκο ίσο με το συνολικό όγκο εντός κι εκτός των beads Vt = total volume inside (Vi) + outside (Vo) = CV (column volume) Vg = bed volume Ο συντελεστής κατανομής K μπορεί να υπολογιστεί σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση Κ = Ve - Vo Vt - Vo

32 GFC

33 GFC Με τα δεδομένα μπορεί να κατασκευαστεί γραφική παράσταση του Κ ή του όγκου έκλουσης προς το λογάριθμο του ΜΒ Η γραφική παράσταση για ένα σετ πρωτεΐνών με γνωστό ΜΒ δίνει το παρακάτω διάγραμμα Γνωρίζοντας τον όγκο έκλουσης μιας ουσίας μπορεί να βρεθεί το μοριακό της βάρος

34 GFC – στατική φάση Πολυμερή Σακχάρων Δεξτράνης Ακρυλαμιδίου Αγαρόζης

35 GFC – στατική φάση Sephacryl Sephadex

36 Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή
Έκλουση με νερό ή οποιοδήποτε άλλο διαλύτη Ήπια μέθοδος διαχωρισμού, ιδιαίτερα φιλική για πρωτεΐνες Η τεταρτοταγής δομή παραμένει ανέπαφη Δυνατότητα εκτέλεσης διαχωρισμού ακόμα και υπό σκληρές συνθήκες (υψηλή συγκέντρωση αλάτων, ουρίας κ.α.) Δυνατότητα αλλαγής διαλύτη στο δείγμα Αφαλάτωση πρωτεΐνης Προσδιορισμός μοριακού βάρους

37 Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή
+ Πολύ αποδοτική μέθοδος διαχωρισμού + Ευέλικτη όσον αφορά τις αρχικές συνθήκες + Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αλλαγή διαλύματος σε μια πρωτεΐνη ή για αφαλάτωση + Η πηκτή μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί μετά από σωστή πλύση - Χρονοβόρα μέθοδος - Πολύ μεγάλη αραίωση του διαλύματος - Το δείγμα πρέπει να μην έχει όγκο μεγαλύτερο από 5% του όγκου της στήλης - Σχεδόν ποτέ δεν αποτελεί το πρώτο βήμα καθαρισμού

38 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Ion exchange chromatography - IEX Στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής η στατική φάση είναι φορτισμένη (θετικά ή αρνητικά) Έλξη και πρόσδεση των αντίθετα φορτισμένων συστατικών του μείγματος Συστατικά που είναι φορτισμενα όμοια με τη στατική φάση δεν προσδένονται αλλά διαπερνούν τη στήλη Χρησιμότατη τεχνική στην απομόνωση και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών

39 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Κατιοντοανταλλαγή Κατακράτηση και διαχωρισμός θετικά φορτισμένων συστατικών σε αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια Ανιοντοανταλλαγή Κατακράτηση και διαχωρισμός αρνητικά φορτισμένων συστατικών σε θετικά φορτισμένη επιφάνεια

40 Τροποποίηση με διάφορες φορτισμένες ομάδες
Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – στατική φάση Η στατική φάση (ρητίνη, υλικό πακεταρίσματος) αποτελείται από μια βάση από πολυσακχαρίτη (κυτταρίνη, δεξτράνη) Τροποποίηση με διάφορες φορτισμένες ομάδες DEAE και CM -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2 -O-CH2-COO- 

41 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Αnion exchange chromatography Το matrix είναι φορτισμένο θετικά DEAE (diethyl-amino-ethyl)-cellulose ReSource-S (Amersham/Pharmacia) Cation exchange chromatography Το matrix είναι φορτισμένο αρνητικά CM (carboxy-methyl)-cellulose ReSource-Q (Amersham/Pharmacia)

42 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – στατική φάση
Οι φορτισμένες ομάδες είναι σταθερά και ομοιοπολικά προσδεδεμένες στη ρητίνη Στο εμπόριο υπάρχουν πολλά είδη ρητινών (θετικά ή αρνητικά φορτισμένες) για ιοντοανταλλαγή Σε διάλυμα που περιέχει NaCl τα διιστάμενα ιόντα Na+ και Cl- συνδέονται ασθενώς με τις αντίθετα φορτισμένες ομάδες της ρητίνης Οι θετικά φορτισμένες ομάδες στη ρητίνη συνδέονται με τα Cl- τα οποία ανταλλάσσονται με τα αρνητικά φορτισμενα σωματίδια του μείγματος κατά την φόρτωσή του (ανιοντοανταλλαγή) Οι αρνητικά φορτισμένες ομάδες στη ρητίνη συνδέονται με τα Na+ τα οποία ανταλλάσσονται με τα θετικά φορτισμενα σωματίδια του μείγματος κατά την φόρτωσή του (κατιοντοανταλλαγή)

43 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Η πιο διαδεδομένη μέθοδος στην αναλυτική βιοχημεία Απομόνωση/διαχωρισμός πρωτεϊνών Διαφορά στο φορτίο των πρωτεϊνών Το φορτίο μιας πρωτεΐνης αλλάζει ανάλογα με το pH Υψηλό pH  αρνητικά φορτισμένη πρωτεΐνη Χαμηλό pH  θετικά φορτισμένη πρωτεΐνη Κατεύθυνση φορτίου πρωτεΐνης προς το επιθυμητό σημείο με αλλαγή του pH του διαλύματος στο οποίο βρίσκεται η πρωτεΐνη Αλληλεπίδραση θετικά φορτισμένων πρωτεϊνών με το αρνητικά φορτισμένο υλικό της στήλης (και αντίθετα) Πρόσδεση Οι πρωτεΐνες οι οποίες δεν αλληλεπιδρούν εξέρχονται από τη στήλη

44 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Η ισχύς της πρόσδεσης εξαρτάται από την κατανομή του φορτίου στη επιφάνεια της πρωτεΐνης Μόρια με υψηλό αρνητικό φορτίο προσδένονται πιο ισχυρά στην θετική στήλη Μόρια με χαμηλότερο αρνητικό φορτίο πρoσδένονται λιγότερο ισχυρα Μόρια με θετικό φορτίο δεν προσδένονται

45 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – διαδικασία
Η διαδικασία της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής λαμβάνει χώρα σε τέσσερα βήματα Εξισορρόπηση στήλης Φόρτωμα δείγματος Ξέπλυμα στήλης (Wash) Έκλουση (Gradient) Πολλές φορές ακολουθεί κι ένα πέμπτο βήμα, η αναγέννηση του υλικού της στήλης (στατική φάση)

46 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – εξισορρόπηση στήλης
Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την εξισορρόπηση της στήλης Τα ιόντα που βρίσκονται πακεταρισμένα στη στήλη παρεμβαίνουν και αλληλεπιδρούν με τα ιόντα της κινητής φάσης Διάλυμα το οποίο δεν περιέχει ιόντα (μηδενική ιοντική πυκνότητα) Ελεύθερες όλες οι θέσεις πρόσδεσης Δημιουργία ένα περιβάλλοντος στη στήλη παρόμοιου με το περιβάλλον του μείγματος το οποίο θα φορτωθεί pH, ιοντική ισχύς, συγκέντρωση κινητής φάσης

47 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – φόρτωση δείγματος
Απουσία ιόντων από το διάλυμα του δείγματος pH στο οποίο το δείγμα είναι φορτισμένο ΚΑΙ σταθερό Σε ε΄να μείγμα πρωτεϊνών ~οι μισές θα είναι φορτισμένες θετικά και ~οι μισές αρνητικά Αν το pI της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει είναι πολύ χαμηλό, τότε μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε pH το οποίο θα επιτρέπει την πρόσδεση στη στήλη λιγότερων συστατικών pI pH 3 pH 5 pH 7 pH 9

48 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – φόρτωση δείγματος
Φορτώνεται το διάλυμα με τις πρωτεΐνες (loading) Oι πρωτεΐνες που δεν προσδένονται φεύγουν απευθείας (flow-through) Το flow-through συλλέγεται και αναλύεται παράλληλα με τα υπόλοιπα κλάσματα Συνθήκες ώστε η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει να φεύγει στο flow-through

49 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – Ξέπλυμα στήλης
H στήλη πλένεται με διάλυμα μηδενικής ιοντικής πυκνότητας Συνήθως είναι το ίδιο διάλυμα με το οποίο έχει γίνει η εξισορρόπηση Αποδεσμεύεται οτιδήποτε έχει μείνει πάνω στη στήλη χωρίς να είναι ιοντικά προσδεδεμένο (wash)

50 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής – Έκλουση συστατικού
Τα συστατικά που προσδέθηκαν στη στήλη πρέπει να εκλουσθούν [άλας] (NaCl) αυξάνεται σταδιακά (σπάνια έκλουση με αλλαγή του pH) Τα ιόντα Na+ ή Cl- ανταγωνίζονται για τις θέσεις πρόσδεσης εκτοπίζοντας πρώτα τις πρωτεΐνες που είναι ασθενέστερα συνδεδεμένες με το matrix (elution) Σταδιακά εκλούονται πρωτεΐνες που έχουν πιο ισχυρούς δεσμούς με το matrix και ακολουθούν οι ισχυρότερα συνδεδεμένες Η μέθοδος μπορεί να βελτιστοποιηθεί με ρύθμιση του pH Σταδιακή αύξηση της ιοντικής ισχύος (stepwise elution) Γραμμική αύξηση (gradient elution)

51 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Φόρτωση δείγματος loading Εξισορρόπηση Equilibration Πρόσδεση δείγματος Flow through Wash & elution + ++ + + + ++ + - + ++ + + + ++ + ++ + + + ++ + - + ++ + + + ++ + - + ++ + + + ++ + - + ++ + + + ++ -

52

53 Σταδιακή άυξηση (stepwise gradient) Γραμμική αύξηση (Linear gradient)
Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής - χρωματογράφημα Συγκέντρωση άλατος (mM NaCl) Σταδιακή άυξηση (stepwise gradient) Γραμμική αύξηση (Linear gradient) flow-through elution wash Απορρόφηση στα 280nm Αριθμός κλάσματος

54 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
+ Ίσως η πιο χρήσιμη μέθοδος διαχωρισμού + Χοντρικά, οι μισές πρωτεΐνες απομακρύνονται λόγω αντίθετου φορτίου (δεν προσδένονται στη στήλη) και οι υπόλοιπες διαχωρίζονται βάσει ισχυρότητας πρόσδεσης + Πρώτο βήμα διαχωρισμού + Η αύξηση της συγκέντρωσης του άλατος μπορεί να είναι σταδιακή ή γραμμική χωρίς να ακολουθεί απαραίτητα σταθερή γραμμικότητα + Δυνατότητα επιλογής matrix ή συνθηκών pH ώστε η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει να προσδεθεί ή όχι + Η πηκτή μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί μετά από σωστή πλύση + Εύκολη ρύθμιση και αυτοματοποίηση με αντλίες και συλλέκτες κλασμάτων - Απουσία άλατος από το αρχικό διάλυμα - Παρουσία άλατος στο τελικό διάλυμα - Αλλαγή διαλύματος πριν και μετά την χρωματογραφία

55 Hydrophobic interaction chromatography – HIC
Χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων Hydrophobic interaction chromatography – HIC Παρόμοια με την rpHPLC αλλά για βιολογικά μακρομόρια Οι πρωτεΐνες περιέχουν υδρόφοβα και υδρόφιλα αμινοξέα Υδρόφοβα συνήθως στον πυρήνα της πρωτεΐνης, μακριά από μόρια του νερού Κάποια υδρόφοβα αμινοξέα στην επιφάνεια της πρωτεΐνης Οι πλευρικές αλυσίδες των επιφανειακών υδρόφοβων αμινοξέων συνήθως δεν είναι εκτεθειμένες Τα υδρόφιλα αμινοξέα ελκύουν μόρια νερού τα οποία περιβάλλουν όλη την πρωτεΐνη

56 Χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων
Σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος οι υδρόφοβες αλυσίδες εκτίθενται Μπορούν να προσδεθούν σε υδρόφοβα μόρια μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων Το matrix περιέχει υδρόφοβα μόρια, συνήθως μικρού μήκους λιπαρά οξέα (butyl-bonded [C4] πυριτία) Η έκλουση γίνεται με σταδιακή μείωση της συγκέντρωσης του άλατος Χάνονται σταδιακά οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Η έκλουση λαμβάνει χώρα κατά σειρά αύξουσας υδροφοβικοτητας (τα υδρόφιλα μόρια εκλούονται πρώτα, τα υδρόφοβα τελευταία)

57 Χρωματογραφία υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων
+ Το αρχικό υλικό πρέπει να βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος, γεγονός που επιτρέπει τη μέθοδο να χρησιμοποιηθεί μετά από χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής + Το τελικό διάλυμα περιέχει χαμηλότερη συγκέντρωση άλατος + Δεν χρειάζεται αλλαγή διαλύματος πριν και μετά τη χρωματογραφία για να απομακρυνθεί το άλας - Όχι πολύ ειδική, σχεδόν πάντα χρειάζεται ένα τουλάχιστον βήμα ακόμα για να καθαριστεί η πρωτεΐνη

58 Χρωματογραφία συγγένειας
Πρωτοχρησιμοποιήθηκε το 1910 Πρώτη δημοσίευση το 1967 (Axen et al.): Cyanogen bromide method for the immobilisation of ligands on agarose O Ohlson το 1978 έδειξε την χρησιμοποίησή της σαν εργαστηριακή μέθοδο Η αρχή της βασίζεται στην εξειδικευμένη αλληλεπίδραση κάποιων μορίων με τον προσδέτη τους Εκμεταλλεύεται τη μοριακή δομή των πρωτεϊνών που τους επιτρέπει πρόσδεση με συγκεκριμένα μόρια Η αρχή της είναι αντιπαραθέσιμη με την χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Μηχανισμός ανταλλαγής

59 Χρωματογραφία συγγένειας – στατική φάση
Η στατική φάση περιλαμβάνει το μόριο-προσδέτη το οποίο είναι ακινητοποιημένο σε ένα στρώμα πολυμερούς μέσω ενός spacer

60 Απόλυτα εξειδικευμένοι
Χρωματογραφία συγγένειας – μόρια προσδέτες Δύο είδη προσδετών Απόλυτα εξειδικευμένοι Πρόσδεση μόνο σε ένα συγκεκριμένο μόριο (αντιγόνο-αντίσωμα) Γενικοί Πρόσδεση σε συγκεκριμένη ομάδα Μπορεί να προσδεθεί σε πολλά μόρια αρκεί να φέρουν την ομάδα Προσδέτης Μόριο πρόσδεσης Ένζυμα Υπόστρωμα, αναστολέας, συμπαράγοντας Αντισώματα Αντιγόνο, ιός, κύτταρο Λεκτίνες Πολυσακχαρίτες, γλυκοπρωτεΐνες, υποδοχείς Νουκλεϊκά οξέα Συμπληρωματική αλληλουχία, ιστόνες, πολυμεράση... Ορμόνες Υποδοχείς

61 Χρωματογραφία συγγένειας - spacer
Ανθρακική αλυσίδα μεταξύ του προσδέτη και του στρώματος της στατικής φάσης Ένα μεγάλο spacer μπορεί να αλληλεπιδράσει με το δείγμα μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων Ένα πολύ μικρό spacer μπορεί να μην αφήνει το σημείο πρόσδεσης εύκολα προσβάσιμο Μπορεί να παραλειφθεί αν το σημείο πρόσδεσης έιναι εύκολα προσβάσιμο Βελτιστοποίηση spacers σε εμπορικά προϊόντα χρωματογραφίας

62 Χρωματογραφία συγγένειας – στατική φάση/στρώμα
Το στρώμα στο οποίο είναι ακινητοποιημένος ο προσδέτης Σταθερή και άκαμπτη Μεγάλη επιφάνεια Κυρίως αγαρόζη (sepharose) Πολυμερές D-γαλακτόζης και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζης Πίεση < 1psi, pH 4-9 Διακλαδώσεις για αύξηση της σταθερότητας σε υψηλότερες πιέσεις Κυτταρίνη, δεξτράνη και πολυακρυλαμίδιο χρησιμοποιούνται επίσης

63 Χρωματογραφία συγγένειας – ακινητοποίηση προσδέτη
Διαδικασία δύο βημάτων Ενεργοποίηση στρώματος Προσθήκη προσδέτη

64 Λαμβάνει χώρα σε τέσσερα βήματα
Χρωματογραφία συγγένειας – διαδικασία Η διαδικασία της χρωματογραφίας συγγένειας είναι παρόμοια με τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Λαμβάνει χώρα σε τέσσερα βήματα Εξισορρόπηση στήλης Φόρτωμα δείγματος Ξέπλυμα στήλης (Wash) Έκλουση Πολλές φορές ακολουθεί κι ένα πέμπτο βήμα, η αναγέννηση του υλικού της στήλης (στατική φάση)

65 Χρωματογραφία συγγένειας – διαδικασία
Η εξισορρόπηση γίνεται με το ιδιο διάλυμα στο οποίο περιέχεται το μείγμα προς διαχωρισμό Πρέπει να σιγουρευτούμε ότι η χωρητικότητα της στήλης έιναι επαρκής για την ουσία που θέλουμε να απομονώσουμε

66 Χρωματογραφία συγγένειας – loading
Το δείγμα εισέρχεται στη στήλη λόγω βαρύτητας ή με τη χρήση αντλίας Συνεχόμενη σταθερή ροή Τα μόρια που έχουν συγγένεια προσδένονται στη στήλη Τα περισσότερα μόρια που δεν προσδένονται εξέρχονται από το κάτω μέρος της στήλης Μερικά μόρια μπορεί να παραμείνουν στη στήλη μέσω μη-ειδικών αλληλεπιδράσεων

67 Χρωματογραφία συγγένειας – washing
Αυτά τα μόρια απομακρύνονται από τη στήλη με το στάδιο του ξεπλύματος Αρκετά Column Volumes διαλύματος (κινητής φάσης) περνούν μέσα από τη στήλη Οι μη-ειδικές αλληλεπιδράσεις είναι αρκετά ασθενείς δεσμοί Καταστρέφονται έυκολα σε αντίθεση με τις ισχυρές δυνάμεις συγγένειας Απομάκρυνση μη-ειδικών μορίων

68 Χρωματογραφία συγγένειας – elution
Το συστατικό που έχει προσδεθεί ισχυρα στη στήλη πρέπει τώρα να εκλουσθεί Πρέπει να καταστραφούν οι ειδικές αλληλεπιδράσεις που συγκρατουν το συστατικό στον προσδέτη Συνήθως η έκλουση λαμβάνει χώρα με το πέρασμα μιας άλλης ουσίας στη στήλη η οποία συναγωνίζεται το συστατικό ή τον προσδέτη για τις θέσεις πρόσδεσης Δομή παρόμοια με τη δομή του συστατικού ή του προσδέτη Ένζυμο – Υπόστρωμα – Συναγωνιστικός αναστολέας Υψηλή συγκέντρωση του αναστολέα μετατοπίζει το υπόστρωμα από το ενεργό κέντρο του ενζύμου Το υπόστρωμα είναι πλέον ελέυθερο και εξέρχεται από το κάτω μέρος της στήλης

69 Χρωματογραφία συγγένειας

70

71 Χρωματογραφία συγγένειας
flow-through elution wash Απορρόφηση στα 280nm Αριθμός κλάσματος

72 Χρωματογραφία συγγένειας
Παράδειγμα: Καθαρισμός γλυκοπρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας σε λεκτίνες Οι λεκτίνες έχουν συγγένεια για τις γλυκοπρωτεΐνες και όχι για τις υπόλοιπες πρωτεΐνες Συγκεκριμένα, προσδένονται στους υδατάνθρακες των γλυκοπρωτεϊνών Το matrix έχει προσδεδεμένα μόρια λεκτινών τα οποία δεσμεύουν τις γλυκοπρωτεΐνες και αφήνουν όλα τα υπόλοιπα μόρια να περάσουν Η έκλουση των προσδεδεμένων πρωτεϊνών γίνεται με υψηλή συγκέντρωση κάποιου σακχάρου ή υδατάνθρακα που ανταγωνίζεται με τη γλυκοπρωτεΐνη για τη θέση πρόσδεσης πάνω στη λεκτίνη Αποδέσμευση γλυκοπρωτεΐνης από τη λεκτίνη

73 Χρωματογραφία συγγένειας – τα συν
+ Ισχυρότατη τεχνική για τον καθαρισμό μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από μείγμα + Τις περισσότερες φορές η μοναδική πρωτεΐνη που εκλούεται είναι αυτή που θέλουμε, χωρίς προσμίξεις + Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί πρωτεΐνη με αλληλουχία σήμανσης συνήθως δεν χρειάζεται δεύτερο βήμα απομόνωσης – η πρωτεΐνη είναι ήδη καθαρή σε ικανοποιητικό βαθμό + Με τη χρήση αντισωμάτων δε χρειάζεται να εισαχθεί αλληλουχία σήμανσης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πρωτεΐνες απευθείας από ζωικούς ιστούς

74 Χρωματογραφία συγγένειας – τα πλην
Ακριβή τεχνική, χρησιμοποιείται στο τέλος της όλης διαδικασίας απομόνωσης Δεν είναι εύκολο να βρεθούν ειδικά μόρια προσδέτες για όλες τις πρωτεΐνες Για τη σήμανση χρειάζεται φορέας με την κατάλληλη αλληλουχία, τρόπος να αφαιρεθεί η αλληλουχία από την πρωτεϊνη (πρωτεόλυση) καθώς και τρόπος απομάκρυνσης της ανάλογης πρωτεάσης  επιπρόσθετα βήματα Η εύρεση αντισώματος για μια πρωτεΐνη μπορεί να αποδειχθεί δύσκολη διαδικασία – ομοίως και η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων - Ενδέχεται η πρωτεΐνη να προσδεθεί τόσο ισχυρά που να χρειάζονται σκληρές συνθήκες για την αποδέσμευσή της που ίσως μετουσιώσουν την πρωτεΐνη

75 FPLC – fast protein liquid chromatography
Αυτοματοποίηση της συνολικής διαδικασίας χρωματογραφίας Τρόπος εισαγωγής δείγματος Αντλία Διοχέτευση διαλυμάτων και παρασκευή βαθμιδώσεων Υποδοχή για τη στήλη Φόρτωση δείγματος, ξέπλυμα στήλης, έκλουση και αναγέννηση στατικής φάσης Προγραμματισμός για σταδιακή ή γραμμική άυξηση συγκέντρωσης του διαλύματος έκλουσης Συλλέκτης κλασμάτων UV/vis φωτομετρία Δημιουργία χρωματογραφήματος

76 FPLC – fast protein liquid chromatography
Ελάχιστη ανθρώπινη παρέμβαση παρά μόνο στη συναρμολογηση της συσκευής και στην παρασκευή των διαλυμάτων

77 Χρωματογραφία σε δύο διαστάσεις (βήματα)
Μερικές φορές μια μόνο χρωματογραφική διαδικασία δεν είναι αρκετή για το διαχωρισμό των συστατικών και την απομόνωση της ουσίας που μας ενδιαφέρει Κορυφές χωρίς υψηλή ανάλυση Δεύτερη, διαφορετική χρωματογραφική διαδικασία σε επιλεγμένα κλάσματα ή κορυφές Διαχωρισμός με βάση διαφορετική ιδιότητα

78 Χρωματογραφία σε δύο διαστάσεις (βήματα)
Χρωματογραφία χάρτου Τοποθέτηση δείγματος στο χαρτί και τοποθέτηση χαρτιού σε κινητή φάση 1 Διαχωρισμός συστατικών με βάση την στατική φάση και την κινητή φάση 1 Περιστροφή χαρτιού κατα 90ο και τοποθέτησή του σε κινητή φάση 2 Τα ήδη διαχωρισμένα συστατικά διαχωρίζονται περαιτέρω

79 Χρωματογραφία σε δύο διαστάσεις (βήματα)
Μείγμα πρωτεϊνών pI ΜΒ Α 4,9 17,7kD Β 5,2 25,6kD Γ 8,7 18,1kD Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή Χρωματογραφία κατιοντοανταλλαγής στην κορυφή 2 σε pΗ 6,5 2 Γ Α 1 Β Α, Γ

80 Assay - Δοκιμασία Έστω ότι το μείγμα που εισάγουμε στη στήλη είναι από ομογενοποίημα κυττάρων Μέσα σε ένα κύτταρο παράγονται χιλιάδες πρωτεΐνες Πώς θα αναγνωρίσουμε ότι καθαρίζουμε την πρωτεΐνη που θέλουμε; Χρειαζόμαστε ένα τεστ/δοκιμασία που να είναι ειδικό για την πρωτεΐνη μας

81 Υποδοχέας  μόριο προσδέτης (ligand) Ένζυμο  υπόστρωμα
Assay Assay - δοκιμασία Μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού συγκεκριμένης πρωτεΐνης με βάση μια ιδιότητα της πρωτεΐνης για την οποία ενδιαφερόμαστε Αντίσωμα  αντιγόνο Υποδοχέας  μόριο προσδέτης (ligand) Ένζυμο  υπόστρωμα Εκμεταλλεύεται κάποια μετρήσιμη ποσότητα

82 Μετρήσιμη ποσότητα Αλλαγή στην απορρόφηση σε ένα μήκος κύματος (π.χ. εξαιτίας της παραγωγής NADH σε μια συζευγμένη αντίδραση) Αλλαγή στο μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης που πρωτεολύεται σταδιακά Μετακίνηση ενός σημασμένου μορίου DNA ή RNA σε πηκτή Η μετατροπή μιας χημικής ουσίας με συγκεκριμένη φυσική ιδιότητα σε άλλη με διαφορετική φυσική ιδιότητα (στροφή πολωμένου φωτός, φθορισμός) Η ικανότητα να διεγείρει συγκεκριμένες μεταβολικές/μεταγωγικές πορείες (κυτταρική διαίρεση, απόπτωση, διαφοροποίηση) …και πολλά άλλα

83 Assay Π.χ. γαλακτική αφυδρογονάση LDH
Γαλακτικό + NAD+ Πυροσταφυλικό + NADH H αντίδραση μπορεί να μελετηθεί ποσοτικά μετρώντας την ποσότητα του NADH Το NADH απορροφά στα 340nm Μεγαλύτερη απορρόφηση Περισσότερη ποσότητα NADH  Περισσότερη ποσότητα πυροσταφυλικού Mεγαλύτερη δραστικότητα γαλακτικής αφυδρογονάσης  Περισσότερη ποσότητα ενζύμου

84 Ειδική δραστικότητα  Πόση ποσότητα συνολικής πρωτεΐνης έχουμε
 Πόση από αυτήν την ποσότητα είναι η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει Ειδική δραστικότητα ο λόγος της ποσότητας της πρωτεΐνης που θέλουμε προς την συνολική πρωτεΐνη που περιέχεται στο διάλυμα Assay ειδικό για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει (ένζυμο) Ένα γενικό assay για πρωτεΐνες (Lowry, Bradford) θα μας δείξει πόση είναι η συνολική πρωτεϊνη To ειδικό assay θα μας δείξει πόση δραστικότητα υπάρχει μέσα στο διάλυμά μας – ιδιότητα που αποδίδεται μόνο στο ένζυμο που μας ενδιαφέρει

85 Η μονάδα δραστικότητας (unit) ορίζεται αυθαίρετα
Ειδική δραστικότητα Η μονάδα δραστικότητας (unit) ορίζεται αυθαίρετα π.χ. 0,1 αύξηση απορρόφησης στα 340nm σε κυψελίδα 1cm, σε συγκεκριμένο pH και θερμοκρασία και μπορεί να υπολογιστεί η ποσότητα του ενζύμου μας Ποσότητα ενζύμου (unit) προς ολική πρωτεϊνη = units/(mg/ml) ή units/mg = ειδική δραστικότητα – αυξάνεται όσο αυξάνεται η καθαρότητα Τα assays πρέπει να είναι ειδικά, γρήγορα, ευαίσθητα, επαναλήψιμα και απλά

86 Μετά από κάθε βήμα Τα κλάσματα που περιέχονται σε μια κορυφή συνήθως συγκεντρώνονται σε ένα ενιαίο κλάσμα Το assay θα διεξαχθεί σε κάθε ενιαίο κλάσμα Το κλάσμα που έχει δραστικότητα θα κρατηθεί και θα προχωρήσει σε περαιτέρω βήματα καθαρισμού Η πιο συνηθισμένη μέθοδος παρακολούθησης της όλης χρωματογραφικής διαδικασίας είναι με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Φασματομετρικές (φασματομετρία μάζας) και ανοσολογικές (western blotting και ELISA) τεχνικές μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν