Στις νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ορισμένοι πληθυσμοί ενηλίκων νευρώνων σταδιακά χάνονται λόγω τοξικού στρες. Οι τέσσερις Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2)

Παρουσίαση με θέμα: "Στις νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ορισμένοι πληθυσμοί ενηλίκων νευρώνων σταδιακά χάνονται λόγω τοξικού στρες. Οι τέσσερις Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2)"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1

2 Στις νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ορισμένοι πληθυσμοί ενηλίκων νευρώνων σταδιακά χάνονται λόγω τοξικού στρες. Οι τέσσερις Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF2) μεταγραφικοί παράγοντες, από το MEF2A μέχρι το MEF2D, έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των διαφόρων τύπων των νευρώνων. Σε κυτταρικά μοντέλα, η αναστολή των MEF2s συμβάλλει στoν νευρωνικό θάνατο.Η ενίσχυση της δραστηριότητας του MEF2 προστατεύει τους νευρώνες από το θάνατο in vitro και στο εσωτερικό της μέλαινας ουσίας στη συμπαγη μοίρα σε ποντικούς με τη νόσου του Parkinson Η αυτοφαγια είναι η αποδόμηση των ενδοκυττάριων συστατικών από λυσοσώματα. Σε σχέση με τη macro και microautophagy, η Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) αποδομεί επιλεκτικά κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, στη συγκεκριμένη περίπτωση τις MEFs. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει δέσμευση των πρωτεινών Hsc70 (που εχουν υποστεί θερμικο σοκ) στο υπόστρωμα μέσω ενως KFERQ-like μοτίβο και την επακόλουθη στόχευση τους σε λυσοσώματα μέσω του λυσοσωμικού μεμβρανικού υποδοχέα Lamp2a. Η δυσλειτουργία της αυτοφαγίας του MEF2D έχει σημαντίκο ρόλο στον νευροεκφυλισμό.

3 Τα επίπεδα της πρωτεΐνης MEF2 είναι κρίσιμα για την επιβίωση των νευρώνων Ετσι ερευνήσαμε το ρόλο της αυτοφαγίας στην αποδόμηση της πρωτεΐνης MEF2D με το φράξιμο της λυσοσωμικής πρωτεόλυσης με χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl) σε μια γραμμή ντοπαμινεργικών προγονικών κυττάρων (SN4741) στο μεσεγκέφαλο ενός ποντικού Το NH4Cl προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα του MEF2D Έτσι, το λυσοσωμικό σύστημα ελέγχει τα επίπεδα της MEF2D στους νευρώνες (με την λυσοσωμικη πρωτεόλυση).

4 Σε ποντίκια που στερούνται τη λυσοσωμική υδρολάση καθεψίνη D ( CDKO), τα επίπεδα της MEF2D αυξήθηκαν στη μέλαινα ουσία και στο φλοιό Κοκκινο: MEF2D

5 Ta SN4741 είναι χρήσιμα για τη μελέτη της νευρονικης αντιδρασης στο στρες και έτσι χρησιμοποιήθηκε ως το κύριο μοντέλο για το υπόλοιπο της μελέτης.

6 Τα λυσοσώματα ρυθμίζουν τις πρωτεΐνες του υποστρώματος στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα, αλλά η MEF2D έχει βρεθεί μόνο στον πυρήνα νευρώνων. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν μετατόπιση της MEF2D στο κυτταρόπλασμα από τον πυρηνα για άμεση αποδόμηση με αυτοφαγία.

7 Η Leptomycin Β (LMB) είναι ένας ειδικός αναστολέας του CRM-1( υποδοχέας που ελέγχει την πυρηνική εξαγωγή) Με την εισαγωγή LMB αυξήθηκε η πυρηνική συγκέντρωση του MEF2D και μειώθηκε η κυτταροπλασματικη.

8 Αναστολή της λυσοσωμικής λειτουργίας (με ΝΗ4CL) μείωσε σταθερά τη πυρηνική MEF2D αλλά προκάλεσε τη ταυτόχρονη συσσώρευση της στο κυτταρόπλασμα

9 Η LMB μετρίασε συσσώρευση της MEF2D λογω του NH4Cl στο κυτταρόπλασμα,γεγονός που υποδηλώνει ότι η MEF2D συνεχώς εξάγεται προς το κυτταρόπλασμα υπο βάσικες συνθήκες για να αποδομηθει απο τα λυσοσωμάτα

10 Για να μελετήσουμε την αποδομηση της MEF2D από αυτοφαγία, ενεργοποιησαμε την CMA με αφαίρεση ορού, η οποία προκάλεσε σημαντική μείωση των επιπέδων του MEF2D.

11 Ομοίως, όταν η CMA διεγέρθηκε με 6- aminonicotinamide (6 - AN), τα επίπεδα της MEF2D μειώθηκαν Έτσι, τα αποτελέσματά αυτα στηρίζουν την CMA ως το κυριο αυτοφαγογικο μοντελο που ελέγχει την αποδόμηση της MEF2D.

12

13 Μείωση του επιπέδου της Hsc70 από υπερέκφραση του antisense RNA σε SN4741 κύτταρα αυξησε τα επίπεδα της MEF2D

14 Μείωση της πρωτεΐνης Lamp2a με υπερέκφραση του antisense RNA αύξησε επίσης τα επίπεδα της MEF2D( καθως είναι απαραίτητη για την αυτοφαγια CMA όπως αναφέραμε πριν ) Αντίθετα, υπερέκφραση του Lamp2a μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της MEF2D

15 Η α-synuclein αποτελεί έναν παράγοντα κινδύνου της νόσου του πάρκινσον και ασκεί σημαντική επίδραση στο παράγοντα MEF2D Η α-synuclein εξασθενησε την αποδομηση του MEF2D που είχε συσσωρευτεί από στέρηση ορού και από το 6-ΑΝ Όπως φαινεται σε παρουσια α-syn το MEF2D αυξανεται

16 Επιπλέον, τα κυτταροπλασματικά επίπεδα της MEF2D στο φλοιό των A53T-α- συνουκλεΐνη διαγονιδιακων ποντικών ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στα wild-type ποντίκια τα οποια ηταν τα ποντικια ελέγχου (υγιή).

17 Τα επίπεδα της MEF2D ήταν σημαντικά υψηλότερα στους εγκεφάλους των παρκινσονικών ασθενών σε σχέση με τους υγιείς το οποιο σχετιζεται φυσικα με τα υψηλά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στους εγκεφάλους των ασθενών

18 Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η συσσωρευμένη MEF2D είναι λειτουργική, καθορίσαμε τη δραστηριότητα του δεσμου MEF2D-DNA με ηλεκτροφορητική δοκιμή μετατόπισης κινητικότητας (EMSA) Για τη μελέτη αυτή κουράραμε κύτταρα με NH4Cl Επιβεβαιώσαμε την αύξηση της MEF2D και επωάσαμε κυτταρικά λύματα με ένα σημασμενο ανιχνευτή DNA για MEF2. Η MEF2D στα κυτταρικά λύματα έλεγχου δεσμεύτηκε ειδικά στους DNA ανηχνευτές. Η συσσωρευμένη MEF2D στα δείγματα με NH4Cl ή σε δείγματα που έγινε μείωση της Hsc70 δεσμεύτηκε στους ανιχνευτές DNA σε πολύ χαμηλότερο ποσοστό από ό, τι στα δείγματα ελέγχου

19 Κατά συνέπεια δεν είναι λειτουργική

20 Παρόμοια λοιπον με το NH4Cl, η α-συνουκλεΐνη επισης αναστέλει τη λειτουργία της MEF2D Και προκάλεσε απώλειες σε ποσοστό 40% στη νευρωνική βιωσημότητα

21 Οι μελέτες μας συνδέουν τη CMA άμεσα με τον πυρηνικό μηχανισμό επιβίωσης. Τα ευρήματά μας, ότι δηλαδή: η α-συνουκλεΐνη διαταράσσει την αποδόμηση του MEF2D από την CMA ένα βήμα πριν από την υπόστρωματικη πρόσληψη εξηγούν τις τοξικές επιδράσεις της τόσο στα wild-type όσο και στα μεταλλαγμένα με α-συνουκλεΐνη (καθώς λογω της μη αποδόμησης του οι νευρώνες οδηγούνται στο θάνατο). Η έκφραση της Hsc70 καταστέλλει τη τοξικότητα της α-συνουκλεΐνης σε ένα μοντέλο Drosophila με τη νόσο του πάρκινσον, το όποιο συμφωνεί με τα ευρήματα μας ότι η διατήρηση της λειτουργικότητας της MEF2 μειώνει το θάνατο των νευρώνων που προκαλείται από την α-συνουκλεΐνη. Μπλοκάρισμα της CMA συνοδεύεται από μια σαφή παψη της λειτουργιάς του MEF2. Οι MEF2s παίζουν διαφορετικούς ρόλους σε μη νευρικά συστήματα υπό φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Τα ευρήματά μας εγείρουν τη πιθανότητα ότι η αποδόμηση των πρωτεϊνών MEF2s από την CMA μπορεί να λειτουργήσει και σε άλλες διαδικασίες