Μέθοδοι μέτρησης κυτταροτοξικότητας

Παρουσίαση με θέμα: "Μέθοδοι μέτρησης κυτταροτοξικότητας"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Μέθοδοι μέτρησης κυτταροτοξικότητας

2 Κυτταρικός Θάνατος Κυτταρικός θάνατος είναι η μη αντιστρεπτή απώλεια δομής ή και λειτουργίας κυττάρου. Bασικό φαινόμενο απαραίτητο για την κανονική ανάπτυξη, όπως π.χ. στην οργανογένεση των εμβρύων, τη διατήρηση του σχήματος ιστών και την ανανέωση κυττάρων μπορεί να αποτελεί παθολογική διεργασία ως απάντηση σε διάφορους τραυματισμούς.

3 Κυτταρικός Θάνατος Υπάρχουν 2 μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου βάσει της μορφολογίας των κυττάρων που πεθαίνουν: Απόπτωση (κανονικός ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) είναι η φυσιολογική διαδικασία με την οποία άχρηστα κύτταρα εξουδετερώνονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και άλλων βιολογικών διεργασιών. Νέκρωση (τυχαίος κυτταρικός θάνατος) είναι η παθολογική διαδικασία που λαμβάνει χώρα όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε ισχυρό μηχανικό ή χημικό ερέθισμα.

4 νέκρωση: παθητικός κυτταρικός θάνατος
αφορά ομάδα κυττάρων έλλειψη οξυγόνου ή τροφής απελευθέρωση ενζύμων δημιουργεί φλεγμονή φθορά κυτταρικής μεμβράνης εξάντληση ΑΤΡ στο κύτταρο απόπτωση: ενεργητική αυτοκαταστροφή αφορά μεμονωμένο κύτταρο έναρξη προγραμματισμένου θανάτου φαγοκύτωση από γειτονικά κύτταρα κατάτμηση του κυττάρου σε κυστίδια ενδοκυτταρικό μονοπάτι σηματοδότησης (κασπάσες)

5 Μηχανισμοί νέκρωσης και απόπτωσης
Κατά τη νέκρωση ο κυτταρικός μεταβολισμός χαλάει, το κύτταρο διογκώνεται και οι κυτταρικές μεμβράνες αποσυντίθεται. Κατά την απόπτωση, το κύτταρο στρογγυλοποιείται και συρρικνώνεται, το DNA κομματιάζεται συστηματικά. Σε αντίθεση με τη νέκρωση, το περιεχόμενο του αποπτωτικού κυττάρου στοιβάζεται σε μεμβρανικά κυστίδια και απορροφάται από γειτονικά κύτταρα μέσω φαγοκύττωσης.

6 Μέθοδοι απόπτωσης Κατάτμηση DNA Ενεργοποίηση αποπτωτικών κασπασών.
Η οικογένεια αυτή πρωτεασών ενεργοποιεί καταρράκτες που απενεργοποιούν πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες. Διαφορές στην ασυμμετρία της μεμβράνης. Η φωσφατιδύλοσερίνη μεταναστεύει από το κυτταρόπλασμα στην εξωκυτταρική πλευρά της μεμβράνης. Απελευθέρωση του κυτοχρώματος C στο κυτταρόπλασμα από τα μιττοχόνδρια.

7 Κατάτμηση DNA (DNA laddering)
αρχή μεθόδου: το DNA που προέρχεται από απόπτωση προσδένεται γρήγορα σε γυάλινα νημάτια παρουσία χαοτροπικού άλατος (γουανιδινικό ΗCl). Μετά από πλύσιμο ώστε να απομακρυνθούν οι ακαθαρσίες, το DNA απομακρύνεται από τα νημάτια με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας. Το DNA “τρέχει αργά” σε πήκτωμα αγαρόζης και εμφανίζεται η χαρακτηριστική εικόνα του DNA laddering.

8 Κατάτμηση DNA

9 Κασπάσες αρχή μεθόδου: ανοσοφθορισμός
Μετά την έναρξη απόπτωσης, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται και στη συνέχεια λύνονται. Πιατάκια ELISA επικαλύπτονται με αντι-κασπάση 3 και στη συνέχεια καλύπτονται οι μη ειδικές θέσεις (blocking). Τα δείγματα προστίθενται στο πιατάκι, όπου προσδένονται αφού έχει ενεργοποιηθεί η κασπάση 3 Μετά από πλύσεις προστίθεται φθορίζον υπόστρωμα της κασπάσης, το οποίο πρωτεολυτικά κόβεται από την κασπάση και απελευθερώνεται η φθορίζουσα ουσία. Μετρείται το ποσό φθορισμού με φθορισμομετρία.

10 Κασπάσες φθορίζουσα ουσία υπόστρωμα κασπάσης 3 δείγμα που περιέχει
ενεργοποιημένη κασπάση 3 αντι-κασπάση 3 πιάτο ELISA

11 Κασπάσες Κύτταρα που εκτέθηκαν σε 4μg/ml καμπτοθεσίνης για διαφορετικά χρονικά διαστήματα στους 37οC.

12 Κυτταροτοξικότητα Η ιδιότητα θανάτωσης κυττάρων είτε από κάποια χημική ουσία (όπως τρόφιμα, καλλυντικά ή φαρμακευτικές ουσίες) είτε από κάποιο κύτταρο (π.χ. κυτταροτοξικό Τ κύτταρο). Σε αντίθεση με τη νέκρωση και την απόπτωση, ο όρος κυτταροτοξικότητα δεν προσδιορίζει συγκεκριμένο μηχανισμό κυτταρικού θανάτου.

13 Μέθοδοι Κυτταροτοξικότητας
ΜΤΤ ή ΧΤΤ στηρίζεται στο ότι τα νεκρά κύτταρα δε μπορούν να μεταβολίσουν διάφορα άλατα τετραζολίου. διαρροή μεμβράνης --LDH στηρίζονται στο ότι η διαφοροποίηση της κυτταρικής μεμβράνης οδηγεί σε διαρροή συστατικών στο υπερκείμενο υγρό.

14 MTT or XTT αρχή μεθόδου: τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να ανάγουν άλατα τετραζολίου (ΜΤΤ ή ΧΤΤ) σε χρωματιστά σύμπλοκα φορμαζάνης ενώ τα νεκρά κύτταρα δεν μπορούν. Μέθοδος ELISA. Αφού ένας κυτταροτοξικός παράγοντας μειώνει την αναγωγή των αλάτων τετραζολίου η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για να μετρήσει είτε κυτταροτοξικότητα που επάγεται από τον συγκεκριμένο παράγοντα είτε γενικότερα νέκρωση.

15 ΜΤΤ Σε πιάτο ELISA καλλιεργούνται κύτταρα, τα οποία επωάζονται με ΜΤΤ για 4 ώρες. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να μετατρέψουν το ΜΤΤ σε φορμαζάνη. Μετρείται με χρωμομετρία η ποσότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου φορμαζάνης.

16 ΜΤΤ μέθοδος Μέτρηση της επίδρασης κυτταροτοξικού παράγοντα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.

17 LDH (lactate dehydrogenase)
Το ένζυμο αυτό είναι σταθερό κυτταροπλασματικό ένζυμο το οποίο άμεσα εκκρίνεται στο υπερκείμενο μόλις καταστραφεί η μεμβράνη. ELISA αρχή μεθόδου: διάσπαση άλατος τετραζολίου από την LDH. φυγοκέντρηση κυττάρων  απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού  ELISA με το άλας τετραζολίου ΙΝΤ.

18 Π ο ι α μ έ θ ο δ ο;