Ελένη Πρίφτη Βιοπαθολόγος-κλινική μικροβιολόγος

Παρουσίαση με θέμα: "Ελένη Πρίφτη Βιοπαθολόγος-κλινική μικροβιολόγος"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Καλλιέργεια αίματος: λήψη, υλικά, άμεση αναζήτηση, καλλιέργεια, αξιολόγηση
Ελένη Πρίφτη Βιοπαθολόγος-κλινική μικροβιολόγος Διευθύντρια Μικροβιολογικού Τμήματος Γ.Ν.Α «Αλεξάνδρα»

2 Εισαγωγή Η καλλιέργεια αίματος αποτελεί μία από
τις πλέον σημαντικές εξετάσεις που εκτελεί ένα μικροβιολογικό εργαστήριο διότι: Θέτει την εργαστηριακή διάγνωση της βακτηριαιμίας Συμβάλλει στην επιλογή του κατάλληλου αντιβιοτικού Βοηθά στην μείωση της θνητότητας

3 Ορισμός Βακτηριαιμία ή μυκηταιμία ορίζεται η παρουσία ζώντων βακτηρίων ή μυκήτων στην κυκλοφορία του αίματος

4 Κλινική εμφάνιση βακτηριαιμίας
Κατά σειρά βαρύτητας εκδηλώνεται ως: Σήψη ορίζεται ως το σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (Systematic Inflammatory Response Syndrome-SIRS) που με θετικές αιμοκαλλιέργειες αποδεικνύεται ότι οφείλεται σε λοίμωξη Σοβαρή σήψη είναι η σήψη που συνοδεύεται από δυσλειτουργία τουλάχιστον ενός οργάνου Σηπτικό shock είναι η βαριά σήψη που συνοδεύεται από βαριά υπόταση (<60 mmHg) παρά την χορήγηση υγρών ή/και αγγειοδραστικών παραγόντων Πολλαπλή οργανική δυσλειτουργία με αποτέλεσμα την αδυναμία διατήρησης της ομοιόστασης σε οξέως πάσχοντα ασθενή μετά από σοβαρή σήψη ή σηπτικό shock

5 Διάκριση βακτηριαιμίας
Ανάλογα με την προέλευση του μικροοργανισμού Νοσοκομειακή Εξωνοσοκομειακή Ανάλογα με εντόπιση ή όχι εστίας λοίμωξης Πρωτοπαθής Βακτηριαιμία συνδεόμενη με ενδαγγειακούς καθετήρες Δευτεροπαθής: εντοπισμός εστία λοίμωξης Κατώτερο αναπνευστικό σύστημα Ανώτερο ουροποιητικό σύστημα Γαστρεντερικό σύστημα Οστά και αρθρώσεις Δέρμα και μαλακά μόρια

6 Διάκριση βακτηριαιμίας ανάλογα με την διάρκεια
Παροδική Μετά χειρισμούς σε περιοχές με χλωρίδα Περιοδική Διαλείπουσα απόφραξη του ουροποιητικού συστήματος και των χοληφόρων ενδοκοιλιακό απόστημα που δεν έχει παροχετευτεί Συνεχής Ενδαγγειακές λοιμώξεις (ενδοκαρδίτιδα, θρομβοφλεβίτιδα) Τυφοειδή πυρετό (πρώτες εβδομάδες) Βρουκέλλωση

7 Αίτια βακτηριαιμίας Συχνότερα αίτια βακτηριαιμίας Gram-θετικά βακτήρια
S. aureus CoNS Enterococci spp Gram-αρνητικά βακτήρια E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa Acinetobacter spp Μύκητες Candida spp Αναερόβια βακτήρια Πολυμικροβιακά

8 Εργαστηριακή διάγνωση
Καλλιέργεια αίματος Μη καλλιεργητικές μοριακές τεχνικές LightCycler PCR (SeptiFast Test) MALDI-TOF mass spectrometry Ιn situ hybridization DNA probes

9 Συλλογή δείγματος αιμοκαλλιέργειας
Συνολικός όγκος αίματος Χρόνος λήψης και αριθμός αιμοκαλλιεργειών Αντισηψία δέρματος και φλεβοκέντηση

10 Όγκος αίματος Ηλικία-Βάρος Συνολικός όγκος αίματος Αριθμός φιαλών
Όγκος αίματος Ηλικία-Βάρος Συνολικός όγκος αίματος Αριθμός φιαλών Νεογνά-1 έτος (<4 kg) 0,5-1,5 ml/φιάλη 1 φιάλη με μία φλεβοκέντηση Παιδιά 1-6 ετών 1-6 ml (1ml/έτος) 2 φλεβοκεντήσεις, 1 φιάλη κάθε φορά Παιδιά kg 10-20 ml Λαμβάνεται σε 2 αιμοκαλλιέργειες Ενήλικες ή παιδιά >36 kg 30-40 ml (τουλάχιστον ml)

11 Χρόνος λήψης αιμοκαλλιεργειών
Καταλληλότερος χρόνος για την λήψη είναι πριν ή κατά την άνοδο του πυρετού Τα μικρόβια σε μη συνεχή βακτηριαιμία εισέρχονται στην κυκλοφορία 30 λεπτά έως 1 ώρα πριν την κορύφωση του πυρετού και την εμφάνιση του ρίγους

12 Αριθμός αιμοκαλλιεργειών και ανίχνευση βακτηριαιμίας
Με 2 ζεύγη επιτυγχάνεται ανάπτυξη σε % των περιπτώσεων Με 3 σε 96-98% των περιπτώσεων Με 4 σε άνω του 99% των περιπτώσεων Ένα ζεύγος δεν ενδείκνυται για ενήλικες διότι η ευαισθησία είναι χαμηλή (73%) και δεν μπορεί να αξιολογηθεί η ανάπτυξη μικροβίων της χλωρίδας

13 Αριθμός και χρόνος λήψης αιμοκαλλιεργειών
Εξαρτάται από την γενική κατάσταση του ασθενούς Σε οξεία σήψη ή καταστάσεις που χρειάζεται άμεση χορήγηση αντιβιοτικών λαμβάνονται 2-3 καλλιέργειες αίματος με τον μέγιστο όγκο, ταυτόχρονα ή με διαφορά λίγων λεπτών με διαφορετικές φλεβοκεντήσεις πριν την αγωγή Σε κλινικά σταθερό ασθενή ο οποίος ερευνάται για πυρετό άγνωστης αιτιολογίας, υποξεία βακτηριδιακή ενδοκαρδίτιδα ή συνεχή βακτηριαιμία ή μυκηταιμία άλλης αιτιολογίας, λαμβάνονται 3-4 ζεύγη αιμοκαλλιεργειών (σε μεσοδιάστημα 4-6 ωρών) με τον μέγιστο όγκο μέσα σε 24 ώρες Εάν ήδη λαμβάνει αντιμικροβιακή αγωγή η συλλογή γίνεται όταν τα φάρμακα στην κυκλοφορία βρίσκονται στην μικρότερη συγκέντρωση, δηλαδή λίγο πριν την επόμενη δόση

14 Αντισηψία δέρματος Το δέρμα (σε περιοχή περίπου 5 cm) καθαρίζεται με 70% ισοπροπυλική ή αιθυλική αλκοόλη και αφήνεται να στεγνώσει (για sec) Ακολούθως απλώνεται διάλυμα 0,5-2% χλωρεξιδίνης σε ισοπροπυλική αλκοόλη ή βάμμα ιωδίου κάνοντας ομόκεντρους κύκλους γύρω από το σημείο της αιμοληψίας και αφήνεται για 1 min Χρησιμοποιούνται επίσης ιωδοφόρα π.χ. povidone iodine, αλλά χρειάζονται περισσότερο χρόνο (2 min) για να στεγνώσουν Στα παιδιά αποφεύγεται το στάδιο με το ιώδιο και επαναλαμβάνεται 2 επιπλέον φορές ο καθαρισμός με 70% ισοπροπυλική ή αιθυλική αλκοόλη Το πώμα της φιάλης καθαρίζεται με 70% αλκοόλη και αφήνεται να στεγνώσει (1min) Το ιώδιο δεν χρησιμοποιείται για καθαρισμό των φιαλών, εκτός εάν υπάρχουν επιμολύνσεις με βακίλους ή μύκητες

15 Συλλογή αίματος Για κάθε καλλιέργεια επιλέγεται διαφορετικό σημείο λήψης και εάν πρέπει να γίνει στο ίδιο σημείο ακολουθεί δεύτερη φλεβοκέντηση Δεν λαμβάνεται αίμα από φλέβα στην οποία ταυτόχρονα χορηγείται IV διάλυμα Ο αιμολήπτης φορά γάντια και για μεγαλύτερη ασφάλεια χρησιμοποιούνται συσκευές με προστατευμένη βελόνα και κλειστά συστήματα Εάν χρησιμοποιηθεί βελόνα για την λήψη, με την ίδια εμβολιάζονται και οι φιάλες (single-needle method) Ενοφθαλμίζεται πρώτα η αερόβιος φιάλη και ακολούθως η αναερόβιος Εάν υπάρχει δυσκολία στην λήψη και ο ασθενής φέρει αγγειακό καθετήρα, μία καλλιέργεια μπορεί να ληφθεί από αυτόν αλλά απαιτείται δεύτερη από περιφερικό αγγείο Η λήψη από καθετήρα γίνεται από το hub αφού καθαριστεί 2 φορές με 70% αλκοόλη και στεγνώσει (1min). Τα πρώτα 3 ml (ή 0,2 ml σε παιδιά) απορρίπτονται και με άλλη σύριγγα λαμβάνεται το αίμα για καλλιέργεια

16 Λήψη αίματος για καλλιέργεια
Η χρήση κλειστών συστημάτων και η συλλογή του αίματος κατευθείαν στη φιάλη αποτελεί τον ασφαλέστερο τρόπο

17 Υλικά Διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες φιάλες κατάλληλες για καλλιέργεια αερόβιων ή αναερόβιων μικροβίων, μυκήτων και μυκοβακτηριδίων Ποικίλουν ως προς: Την βασική σύνθεση (soybean-casein digest και/ή brain-heart infusion broth) Τα συμπληρωματικά συστατικά Τα αντιπηκτικά Την σύσταση του αέρα μέσα στην φιάλη Τους παράγοντες που αδρανοποιούν τα αντιβιοτικά Τον όγκο του ζωμού

18 Αναλογία αίματος:ζωμού
Πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 1:5-1:10 Με την αραίωση εξουδετερώνονται συστατικά του ανθρωπίνου αίματος με αντιμικροβιακή δράση (λευκοκύτταρα, συμπλήρωμα και λυσοζύμη) Αραιώνονται τα τυχόν υπάρχοντα αντιβιοτικά

19 Αντιπηκτικά Αντιπηκτικά προστίθενται επειδή η ανάπτυξη των μικροβίων μειώνεται όταν το αίμα πήξει Συνήθως χρησιμοποιείται sodium polyanetholsulfonate (SPS) σε συγκέντρωση από 0,025% έως 0,05% Αναστέλλει λυσοζύμη, συμπλήρωμα, φαγοκυττάρωση και αντιβιοτικά (κυρίως αμινογλυκοσίδες) Αναστέλλει και την ανάπτυξη ορισμένων μικροβίων όπως Neisseria spp, Peptostreptococcus anaerobius, Streptobacillus moniliformis, Francisella tularensis, Gardnerella vaginals και Mycoplasma hominis Η αναστολή του SPS περιορίζεται με προσθήκη ζελατίνης 1% στο ζωμό

20 Εξουδετέρωση αντιβιοτικών
Χρησιμοποιούνται: Ρητίνες Ενεργός άνθρακας Τα αποτελέσματα είναι καλύτερα στην απομόνωση μυκήτων και σταφυλόκοκκων

21 Επώαση Ατμόσφαιρα επώασης
Οι αερόβιες φιάλες περιέχουν αέρα με διάφορες συγκεντρώσεις CO2 Είναι κατάλληλες για αερόβια και δυνητικά αναερόβια μικρόβια Οι αναερόβιες φιάλες περιέχουν CO2 και άζωτο, όχι οξυγόνο Ευνοούν την ανάπτυξη των αυστηρά αναερόβιων και των δυνητικά αναεροβίων μικροβίων Ανάδευση Αυξάνει την ανάπτυξη και την ταχύτητα ανίχνευσης των αερόβιων μικροβίων, όχι όμως των αναερόβιων και των μυκοβακτηριδίων Όλα τα αυτόματα μηχανήματα διαθέτουν σύστημα ανακίνησης των φιαλών

22 Αυτόματα συστήματα επώασης
BACTEC (Becton Dickinson) Bact/Alert (Biomerieux)

23 Φιάλες αυτόματων συστημάτων
BACTEC (Becton Dickinson) Bact/Alert (Biomerieux)

24 Λειτουργία αυτόματων συστημάτων
Η λειτουργία τους στηρίζεται στην παραγωγή CO2 από τα αναπτυσσόμενα μικρόβια, που μετράται φθοριομετρικά ή χρωματομετρικά ανάλογα με τον ανιχνευτή που χρησιμοποιεί η κάθε εταιρεία στις φιάλες της Η παραγωγή φθορισμού ή η αλλαγή χρώματος μετράται ανά min, μεταφράζεται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και σε θετικό αποτέλεσμα ακολουθεί ηχητικό ή/και οπτικό σήμα Επώαση 5 ημέρες για αερόβιες και αναερόβιες φιάλες, 10 ημέρες για μύκητες και τουλάχιστον 4 εβδομάδες για μυκοβακτηρίδια

25 Πλεονεκτήματα αυτόματων συστημάτων
Ταχύτερη ανάπτυξη Συνεχής παρακολούθηση Μείωση επιμολύνσεων Μείωση φόρτου εργασίας Καταγραφή καμπύλης ανάπτυξης του μικροβίου σε συνάρτηση με τον χρόνο και υπολογισμός του χρόνου θετικοποίησης Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων

26 Μη αυτοματοποιημένα συστήματα αιμοκαλλιεργειών
Το σύστημα Isolator (Wampole Lab) Δεν έχει ζωμό Βασίζεται στην λύση-φυγοκέντρηση του αίματος Χρησιμοποιείται με καλά αποτελέσματα για την απομόνωση μυκήτων (βλαστομυκήτων, δίμορφων), μυκοβακτηριδίων και Bartonella spp.

27 Χειρισμός αιμοκαλλιέργειας που δίδει θετικό σήμα
Χειρισμός αιμοκαλλιέργειας που δίδει θετικό σήμα Νωπό και με Gram χρώση παρασκευάσματα και σε θετικό αποτέλεσμα ενημερώνεται επειγόντως ο κλινικός ιατρός Ανακαλλιέργεια σε προεπιλεγμένα στερεά θρεπτικά υλικά και με βάση την μικροσκοπική εξέταση, την κλινική εικόνα και τα αναμενόμενα παθογόνα προστίθενται και άλλα Άμεσο αντιβιόγραμμα με τη μέθοδο της διάχυσης των δίσκων από τον ζωμό της φιάλης Ακολουθεί ταυτοποίηση του απομονωθέντος στελέχους, επανάληψη του αντιβιογράμματος (εάν χρειάζεται) και προσδιορισμός MICs

28 Προτεινόμενα υλικά για ανακαλλιέργεια
Αερόβιες φιάλες Σοκολατόχρωμο άγαρ σε 5% CO2, 35οC για ώρες Αιματούχο σε αερόβιες συνθήκες στους 35οC MacConkey άγαρ σε αερόβιες συνθήκες στους 35οC Αναερόβιες φιάλες Αναερόβιο αιματούχο μη εκλεκτικό (χωρίς αντιβιοτικά) με βάση το Brucella agar με αιμίνη και βιταμίνη Κ1 σε αναερόβιες συνθήκες στους 35οC για 5 ημέρες Σοκολατόχρωμο άγαρ σε 5% CO2 MacConkey άγαρ ως διαφοροποιητικό υλικό των δυνητικώς αναερόβιων (προαιρετικά)

29 Μοριακές μέθοδοι ταυτοποίησης
Σύγχρονες μοριακές μέθοδοι (π.χ. FISH με PNA probes) έχουν αναπτυχθεί για την γρήγορη διάκριση των αναπτυσσόμενων μικροβίων από τον ζωμό S. aureus από CoNS Candida albicans από non-Candida albicans ή C. glabrata Έχουν υψηλή ευαισθησία (99%) και ειδικότητα (100%) Δεν εφαρμόζονται ευρέως ακόμη (εμπόδιο το υψηλό κόστος και η δυσκολία εφαρμογής σε εφημερίες)

30 Ασυμφωνία μεταξύ σήματος, άμεσου παρασκευάσματος και καλλιέργειας σε στερεά θρεπτικά υλικά
Οι περιπτώσεις ταξινομούνται σε 3 ομάδες: Θετικό σήμα, θετική Gram χρώση και αρνητική η αρχική καλλιέργεια ρουτίνας Θετικό σήμα, αρνητική Gram χρώση και αρνητική ανακαλλιέργεια Αρνητικό σήμα, θετική Gram χρώση και θετική ανακαλλιέργεια

31 (Ι) Θετικό σήμα, θετική Gram χρώση και αρνητική η αρχική καλλιέργεια ρουτίνας
Υποψιαζόμαστε απαιτητικούς μικροοργανισμούς που δεν αναπτύσσονται στις συνήθεις συνθήκες όπως: Abiotrophia Campylobacter και άλλα καπνόφιλα μικρόβια Brucella Legionella Afipia Francisella spp Βραδέως αναπτυσσόμενα αναερόβια Ανακαλλιέργεια Ειδικά εμπλουτισμένα θρεπτικά υλικά Αναερόβιες (εάν αρχικά δεν έγιναν) ή μικροαερόφιλες συνθήκες Παράταση επώασης

32 (ΙΙ) Θετικό σήμα, αρνητική Gram χρώση και αρνητική ανακαλλιέργεια
Μελέτη της καμπύλης ανάπτυξης που δίδουν τα αυτόματα συστήματα για αναγνώριση του ψευδώς θετικού σήματος Το σύστημα έχει λειτουργικό πρόβλημα Η φιάλη περιέχει μεγαλύτερο όγκο αίματος από τον συνιστώμενο Το αίμα έχει ηυξημένο αριθμό λευκοκυττάρων Εάν η καμπύλη είναι συμβατή με ανάπτυξη μικροβίου Προτείνονται άλλες χρώσεις, όπως Gram χρώση στην οποία ο μεταχρωματισμός γίνεται με φαινικούχο φουξίνη, Giemsa ή Sandifor,s Επανεπωάζεται η φιάλη για να συμπληρωθεί ο χρόνος εάν οι χρώσεις είναι αρνητικές Ανακαλλιέργεια σε επιπλέον υλικά

33 (ΙΙΙ) Αρνητικό σήμα, θετική Gram χρώση και θετική ανακαλλιέργεια
Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών δεν δίδει ή δίδει ασθενώς θετικό σήμα όπως σε: Neisseria spp H. influenzae Brucella spp Legionella spp Francisella spp Με οδηγό την κλινική εικόνα συνιστάται: Χρώσεις άμεσων παρασκευασμάτων Τυφλές ανακαλλιέργειες του ζωμού Χρήση ειδικών στερεών υλικών

34 Σπάνιοι και απαιτητικοί μικροοργανισμοί
Abiotrophia spp Bartonella spp Brucella spp HACEK group Haemophilus parainfluenzae, H. influenzae, H. aphrophilus, H. paraphrophilus Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Eikenella corrodens Kingella spp Legionella spp Streptobacillus moniliformis Histoplasma Malassezia furfur

35 Καλλιέργεια απαιτητικών μικροοργανισμών
Αναπτύσσονται στα αυτόματα συστήματα αιμοκαλλιεργειών Απαιτείται παράταση του χρόνου επώασης των φιαλών Ειδικά θρεπτικά υλικά Ειδικές συνθήκες επώασης

36 Αξιολόγηση θετικών αιμοκαλλιεργειών
Tα πιο σημαντικά στοιχεία που βοηθούν το Εργαστήριο στην διάκριση αληθούς βακτηριαιμίας από επιμόλυνση είναι: Το είδος του μικροοργανισμού Ο αριθμός των θετικών καλλιεργειών στο σύνολο των ληφθέντων Ο τρόπος λήψης

37 Είδος μικροοργανισμού και αληθής βακτηριαιμία
Η βακτηριαιμία είναι αληθής (>90% των περιπτώσεων) όταν το βακτήριο που απομονώνεται είναι: S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae N. meningitidis S. pyogenes N. gonorrhoeae S. agalactiae H. influenzae Listeria monocytogenes Bacteroides fragilis group E. coli Candida albicans και non-albicans Άλλα Εντεροβακτηριακά Cryptococcus

38 Είδος μικροοργανισμού συχνά συνδεόμενο με επιμόλυνση
CoNS Propionibacterium acnes Corynebacterium spp. Micrococcus spp. Bacillus spp. S. viridans group Καθημερινό πρόβλημα αξιολόγησης αποτελούν οι CoNS διότι: Αποτελούν σημαντικό μέρος της χλωρίδας του δέρματος και συχνά επιμολύνουν τις καλλιέργειες Το 12-15% των θετικών αιμοκαλλιεργειών με CoNS αφορούν αληθείς βακτηριαιμίες (συνδεόμενες με αγγειακούς καθετήρες, προθέσεις ή άλλους παράγοντες)

39 Αριθμός ειδών μικροβίων
Ανάπτυξη περισσοτέρων του ενός μικροβίων συνηγορεί υπέρ της επιμόλυνσης Πολυμικροβιακές είναι το 6-12% των αληθών βακτηριαιμιών

40 Αριθμός θετικών αιμοκαλλιεργειών
Πολλαπλές θετικές καλλιέργειες με ταυτόσημο είδος και αντιβιόγραμμα στο σύνολο των ληφθέντων αυξάνουν την θετική προγνωστική αξία της εξέτασης Όταν μία καλλιέργεια (ένα ζεύγος) από τις δύο που ελήφθησαν ταυτόχρονα είναι θετική συνηγορεί υπέρ της επιμόλυνσης Εάν ελήφθησαν με διαφορά χρόνου ίσως να πρόκειται και για αληθή μη συνεχή βακτηριαιμία

41 Τρόπος λήψης αιμοκαλλιέργειας
Όταν λαμβάνεται από αγγειακό καθετήρα και είναι θετική μπορεί να σημαίνει: Αληθή βακτηριαιμία Αποικισμό του καθετήρα (που μπορεί να οδηγήσει σε βακτηριαιμία) Επιμόλυνση Για να αξιολογηθεί είναι απαραίτητο να συνοδεύεται από μία δεύτερη αιμοκαλλιέργεια η οποία πρέπει να λαμβάνεται από περιφερική φλέβα

42 Απάντηση Για τις θετικές καλλιέργειες αίματος η απάντηση δίδεται σε 3 στάδια: Άμεσα γίνεται προφορική ενημέρωση του θεράποντος ιατρού για το θετικό αποτέλεσμα και περιγράφεται λεπτομερώς η μορφολογία του μικροβίου και εάν είναι Gram-θετικό ή Gram-αρνητικό Γραπτή απάντηση δίδεται όταν το μικρόβιο αναπτυχθεί στα στερεά θρεπτικά υλικά και περιλαμβάνει την προκαταρκτική ταυτοποίηση, το άμεσο αντιβιόγραμμα και τον αριθμό των θετικών καλλιεργειών Η τελική απάντηση περιλαμβάνει την ακριβή ταυτοποίηση, το αντιβιόγραμμα και τις MICs Για τις αρνητικές καλλιέργειες αίματος αναφέρεται και ο χρόνος επώασης π.χ. ουδεμία ανάπτυξη μετά επώαση 5 ημερών Σε περίπτωση που αξιολογείται θετική καλλιέργεια ως επιμόλυνση, η απάντηση αναφέρει το γένος π.χ. Bacillus spp, τον αριθμό των θετικών καλλιεργειών και ότι είναι πιθανή επιμόλυνση Η ταυτοποίηση είναι αδρή και δεν γίνεται αντιβιόγραμμα

43 Συνήθη αίτια κατά ομάδες ασθενών
Ανοσοεπαρκείς ενήλικες E. coli, S. pneumoniae, S.aureus, άλλα εντεροβακτηριακά, N. meningitidis, β-haemolytic streptococci Νοσοκομειακοί ασθενείς CoNS, E. coli, S. aureus, άλλα εντεροβακτηριακά, P. aeruginosa, Enterococci  Παιδιά S. pneumoniae, N. meningitidis, S. aureus, E. coli Νεογνά GBS, CoNS, E. coli, Candida spp.

44 Επιδημιολογία Στατιστικά δεδομένα από τις ΗΠΑ δείχνουν ότι:
Οι βακτηριαιμίες αποτελούν την 10η αιτία θανάτου Οι νοσοκομειακές βακτηριαιμίες ξεπερνούν το 50% του συνόλου Συχνότερη αιτία νοσοκομειακής νοσηρότητας και θνητότητας Η επίπτωση των νοσοκομειακών βακτηριαιμιών υπολογίζεται σε περιπτώσεις /έτος Η θνητότητα κυμαίνεται από 16% έως 50% Στους ασθενείς των μονάδων εντατικής θεραπείας υπολογίζεται περίπου στο 35% Στην Ευρωπαϊκή μελέτη SOAP για όλους τους ασθενείς με σήψη ανέρχεται στο 36%

45 Κλινική εμφάνιση βακτηριαιμίας (Ι)
Κατά σειρά βαρύτητας εκδηλώνεται ως: Σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (Systematic Inflammatory Response Syndrome-SIRS) είναι η απάντηση του ξενιστή σε λοιμώδεις ή μη παράγοντες (τραύμα, έγκαυμα κ.λπ.) και χαρακτηρίζεται από την παρουσία 2 ή περισσοτέρων από τα ευρήματα: Θερμοκρασία >38οC ή <36οC Ταχυκαρδία >90 σφίξεις /min Ταχύπνοια >20 αναπνοές/min ή paCO2 < 4,3 KPa Λευκά αιμοσφαίρια στο περιφερικό αίμα >12.000/μl ή <4.000/μl ή >10% άωρες μορφές

46 Προδιαθεσικοί παράγοντες
Υποκείμενες χρόνιες νόσοι (κακοήθειες, διαβήτης, εκκολπωματίτις, χολοκυστίτις, αλκοολισμός) Ακραίες ηλικίες (ηλικιωμένοι άνδρες, νεογνά, βρέφη, παιδιά) Θεραπεία με κυτταροτοξικά ή στεροειδή Νοσηλεία σε νοσοκομείο Τμήμα νοσηλείας Διάρκεια νοσηλείας Παρουσία ουροκαθετήρα Παρουσία κεντρικών αγγειακών καθετήρων Ολική παρεντερική διατροφή

47 Πηγή βακτηρίων Η εστία λοίμωξης στην δευτεροπαθή βακτηριαιμία
εντοπίζεται στο: Κατώτερο αναπνευστικό σύστημα Ανώτερο ουροποιητικό σύστημα Γαστρεντερικό σύστημα Οστά και αρθρώσεις Δέρμα και μαλακά μόρια

48 Μη αυτοματοποιημένα συστήματα αιμοκαλλιεργειών
Ο παλαιότερος τρόπος Χωρίς ιδιαίτερο εξοπλισμό Επιλέγονται 2 διαφορετικοί ζωμοί για την αερόβια και αναερόβια φιάλη Ανακαλλιέργειες σε στερεά θρεπτικά υλικά γίνονται την 2η, 3η και την 7η ημέρα επώασης ή όταν παρατηρηθούν σημεία ανάπτυξης μικροβίων όπως αιμόλυση, θολερότητα, παραγωγή αερίου, θρόμβος, υμένιο ή ορατές αποικίες Φιάλες με ειδικό σχεδιασμό Τύπου Castaneda με διφασικό υλικό, άγαρ σε μία επιφάνεια και ζωμό Φιάλες που φέρουν στο πώμα συσκευή με την οποία άμεσα ανιχνεύεται η παραγωγή αερίου (Signal-Oxoid) Το σύστημα Isolator (Wampole Lab) Δεν έχει ζωμό Βασίζεται στην λύση-φυγοκέντρηση του αίματος Χρησιμοποιείται με καλά αποτελέσματα για την απομόνωση μυκήτων (βλαστομυκήτων, δίμορφων), μυκοβακτηριδίων και Bartonella spp.

49 Μη αυτοματοποιημένα συστήματα αιμοκαλλιεργειών
Ο παλαιότερος τρόπος Χωρίς ιδιαίτερο εξοπλισμό Επιλέγονται 2 διαφορετικοί ζωμοί για την αερόβια και αναερόβια φιάλη Ανακαλλιέργειες σε στερεά θρεπτικά υλικά γίνονται την 2η, 3η και την 7η ημέρα επώασης ή όταν παρατηρηθούν σημεία ανάπτυξης μικροβίων όπως αιμόλυση, θολερότητα, παραγωγή αερίου, θρόμβος, υμένιο ή ορατές αποικίες Φιάλες με ειδικό σχεδιασμό Τύπου Castaneda με διφασικό υλικό, άγαρ σε μία επιφάνεια και ζωμό Φιάλες που φέρουν στο πώμα συσκευή με την οποία άμεσα ανιχνεύεται η παραγωγή αερίου (Signal-Oxoid) Το σύστημα Isolator (Wampole Lab) Δεν έχει ζωμό Βασίζεται στην λύση-φυγοκέντρηση του αίματος Χρησιμοποιείται με καλά αποτελέσματα για την απομόνωση μυκήτων (βλαστομυκήτων, δίμορφων), μυκοβακτηριδίων και Bartonella spp.

50 Φιάλες αιμοκαλλιεργειών
Φιάλες τύπου Castaneda Φιάλες Signal Σύστημα Isolator

51 Συμπληρωματικοί παράγοντες Αναπτυσσόμενα βακτήρια
Είδος φιάλης Βασική σύνθεση Συμπληρωματικοί παράγοντες Αναπτυσσόμενα βακτήρια Αερόβιων μικροβίων Soybean-casein digest broth ή Brain heart infusion Yeast extract, Αμινοξέα, SPS, Ρητίνες ή Ενεργός άνθρακας, Βιταμίνες Αερόβια Δυνητικά αναερόβια Βλαστομύκητες Αναερόβιων μικροβίων Yeast extract, Αμινοξέα, SPS, Ρητίνες ή Ενεργός άνθρακας, Γλυκόζη, Sodium citrate, Βιταμίνες Αυστηρά αναερόβια Παιδιατρική φιάλη Yeast extract, Animal tissue digest, Δεξτρόζη, Σακχαρόζη, Αιμίνη, Μεναδιόνη, SPS, Βιταμίνη B6, Ρητίνες ή Ενεργός άνθρακας Μυκήτων Brain heart infusion broth, Soybean-casein digest broth Yeast extract, SPS, citrate, Δεξτρόζη, Σακχαρόζη, Ινοσιτόλη, Chl, Τob Υφομύκητες Μυκοβακτηριδίων 7H9 Middlebrook broth base, Brain heart infusion Casein hydrolysate, Supplement H, Ινοσιτόλη, Γλυκερόλη, Βιταμίνη B6 Μυκοβακτηρίδια Υφομύκητες H. capsulatum N. asteroides

52 Ταυτοποίηση σταφυλοκόκκων
Ο σταφυλόκοκκος είναι το συχνότερα αναπτυσσόμενο βακτήριο Άμεσα εκτελείται η δοκιμασία της συνδεδεμένης κοαγκουλάσης σε πλάκα και διαχωρίζεται ο S. aureus από τους CoNS Επειδή θετική ανευρίσκεται και σε άλλα είδη πλην του S. aureus (S. intermidius, S. schleferi, S.lugdunensis), συμπληρώνεται με την δοκιμασία ελεύθερης κοαγκουλάσης σε σωληνάριο και την παραγωγή DNAse Ο S. aureus κατά κανόνα δίδει θετικές και τις τρεις δοκιμασίες

53 Είδος μικροοργανισμού και αληθής βακτηριαιμία
Η βακτηριαιμία είναι αληθής (>90% των περιπτώσεων) όταν το βακτήριο που απομονώνεται είναι: S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae N. meningitidis S. pyogenes N. gonorrhoeae S. agalactiae H. influenzae Listeria monocytogenes Bacteroides fragilis group E. coli Candida albicans και non-albicans Άλλα Εντεροβακτηριακά Cryptococcus

54 Άλλα κριτήρια αξιολόγησης
Χρόνος θετικοποίησης Δεν αποτελεί σταθερό κριτήριο αληθούς βακτηριαιμίας (τα αποτελέσματα σχετικών μελετών ποικίλουν) Συνδυασμός κλινικών και εργαστηριακών δεδομένων Κλινικά κριτήρια Πυρετός ή υποθερμία Υπόταση Αριθμός λευκών (>20.000/μl ή <4.000/μl) Αύξηση της τιμής της CRP εντός 24 ωρών από την 1η θετική αιμοκαλλιέργεια

55 Αλγόριθμος εργασίας πιθανά επιμολυσμένων αιμοκαλλιεργειών
Δεδομένα Ενέργειες Ελήφθησαν ≥2 καλλιέργειες αίματος και η μία ανέπτυξε CoNS, Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp. (πλήν B. anthracis) ή Streptococcus viridans group Δεν ταυτοποιείται το είδος και δεν γίνεται αντιβιόγραμμα. Αναφέρεται ως πιθανή επιμόλυνση Ελήφθη 1 καλλιέργεια αίματος και ανέπτυξε CoNS, Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp. (πλήν B. anthracis) ή Streptococcus viridans group Δεν ταυτοποιείται το είδος και δεν γίνεται αντιβιόγραμμα. Αναφέρεται ότι η σημασία του βακτηρίου δεν μπορεί να εκτιμηθεί ≥2 καλλιέργειες αίματος που ελήφθησαν μέσα σε 24 ώρες ανέπτυξαν CoNS, Corynebacterium spp, Micrococcus spp, Bacillus spp (πλήν B. anthracis) ή Streptococcus viridans group Ταυτοποιείται το είδος και γίνεται αντιβιόγραμμα Εάν ανήκουν στο ίδιο είδος και έχουν ταυτόσημα αντιβιογράμματα, αναφέρεται η ταυτοποίηση και το αντιβιόγραμμα Εάν είναι διαφορετικά δεν αναφέρεται το είδος και το αντιβιόγραμμα. Αναφέρονται ως διαφορετικά στελέχη και ως πιθανή επιμόλυνση

56 Abiotrophia spp Αναπτύσσεται στις συνήθεις φιάλες που περιέχουν κυστεΐνη σε 2-3 ημέρες Ανακαλλιεργείται σε: Αιματούχο άγαρ εμπλουτισμένο με πυριδοξάλη ή L-κυστεΐνη ή ταυτόχρονη καλλιέργεια με S. aureus Επώαση 48 ωρών σε 5-10 % CO2 Οι αποικίες είναι μικρές, α-αιμολυτικές ή μη αιμολυτικές και στην Gram χρώση παρουσιάζουν ποικιλομορφία ως προς την μορφή και το χρώμα

57 Bartonella spp Για καλλιέργεια αίματος καταλληλότερο έχει αποδειχθεί το σύστημα Isolator Στα αυτόματα συστήματα αιμοκαλλιεργειών αναπτύσσεται αλλά μπορεί να μην δοθεί θετικό σήμα Σε κλινική υποψία την 8η ημέρα να γίνονται: Άμεσα νωπά παρασκευάσματα → μικρόβια με στριφογυριστή κίνηση Χρωματισμένα με τροποποιημένη Gram χρώση (παρατεταμένος μεταχρωματισμός με σαφρανίνη ή χρησιμοποίηση φαινικούχου φουξίνης) → μικρά Gram-αρνητικά καμπύλα βακτηρίδια Καλλιεργείται σε: Σοκολατόχρωμο άγαρ με διπλάσια ποσότητα υλικού ανά τρυβλίο Heart infusion agar ή Columbia agar με 5% αίμα κονίκλου Επώαση στους 37οC, σε ατμόσφαιρα 5% CO2 με αυξημένη υγρασία, για 2-6 εβδομάδες. Οι αποικίες είναι μικρές και στερεά προσφυόμενες στο υλικό Η τελική ταυτοποίηση γίνεται με ειδικά φθορίζοντα αντισώματα, μοριακές δοκιμασίες ή ανάλυση των λιπαρών οξέων του κυττάρου

58 Brucella spp Η καλλιέργεια αίματος ή μυελού των οστών γίνεται σε αυτοματοποιημένα συστήματα με παράταση της επώασης σε 7-10 ημέρες (συνήθως θετικοποιείται σε 3-4 ημέρες) Σε κλινική υποψία εάν δεν δοθεί θετικό σήμα γίνεται ανακαλλιέργεια την 10η ημέρα Για τις ανακαλλιέργειες χρησιμοποιούνται: Brucella agar Σοκολατόχρωμο ή αιματούχο άγαρ με βάση brain heart infusion Επώαση σε 5-10% CO2 για τουλάχιστον 72 ώρες

59 HACEK group Η ομάδα περιλαμβάνει τα είδη
Haemophilus parainfluenzae, H. influenzae, H. aphrophilus, H. paraphrophilus Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Eikenella corrodens Kingella spp Αναπτύσσονται στα αυτόματα συστήματα αιμοκαλλιεργειών και σε αρνητικό αποτέλεσμα παρατείνεται η επώαση Ανακαλλιέργεια σε εμπλουτισμένα θρεπτικά υλικά Σοκολατόχρωμο άγαρ για τους αιμοφίλους Αιματούχο άγαρ με αίμα προβάτου για τα άλλα είδη Επώαση στους 35-37οC, σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2, για 2-3 ημέρες

60 Legionella spp Συνιστάται η χρήση του συστήματος Isolator
Αναπτύσσεται στα αυτόματα συστήματα αλλά πρέπει να γίνονται περιοδικές τυφλές ανακαλλιέργειες, διότι η ανάπτυξη δεν δίδει θετικό σήμα Στερεό θρεπτικό υλικό για ανακαλλιέργειες το εκλεκτικό buffered charcoal yeast extract agar (BCYE) Επώαση σε αερόβιες συνθήκες, στους 35οC, με υγρασία 50-70%, για 5-15 ημέρες

61 Streptobacillus moniliformis
Για καλλιέργεια αίματος ενοφθαλμίζεται διπλάσια ποσότητα αίματος από την καθορισμένη σε φιάλες ή σε σωληνάρια με θειογλυκολικό ζωμό (2 ml αίματος σε 10 ml ζωμό) Κατάλληλα υλικά είναι: Αγαρ (brain heart infusion, trypticase soy ή heart infusion) με 20% ορό κονίκλου (ή αλόγου ή μόσχου) Θειογλυκολικός ζωμός με 20% ορό κονίκλου ή αλόγου ή μόσχου Επώαση σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2 με υψηλή υγρασία Δεν αναπτύσσεται στο MacConkey

62 Histoplasma Αναπτύσσεται στις φιάλες των αυτόματων συστημάτων με ευνοϊκότερη ανάπτυξη σε φιάλες για μυκοβακτηρίδια, οι οποίες επωάζονται για 3-4 εβδομάδες Συνιστάται το σύστημα Isolator με το οποίο επιτυγχάνεται γρηγορότερη ανάπτυξη και έχει μεγαλύτερη ευαισθησία Κατάλληλα στερεά θρεπτικά υλικά είναι το Sabouraud και το brain heart infusion άγαρ με 10% αίμα προβάτου Επώαση στους 30οC, σε υγρασία 10% μέχρι 3 εβδομάδες

63 Malassezia furfur Απομονώνεται σε βακτηριαιμία που συνδέεται με καθετήρα σε νεογνά που λαμβάνουν παρεντερική διατροφή πλούσια σε λιπίδια Τα αυτόματα συστήματα αιμοκαλλιεργειών μπορεί να μην δώσουν θετικό σήμα Προτείνεται να ληφθούν λίγα ml αίματος από το hub, να γίνει λεπτή επίστρωση και Gram χρώση και να καλλιεργηθεί σε αιματούχο άγαρ ή σε υλικό για μύκητες (χωρίς ανασταλτικούς παράγοντες) προσθέτοντας μία σταγόνα ελαιολάδου στο ενοφθάλμισμα

64 Σας ευχαριστώ