ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5.

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5

2 Η αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος είναι μία διμοριακή αντίδραση παρόμοια με την αλληλεπίδραση ενζύμου-υποστρώματος, με μία σημαντική διαφορά: δεν οδηγεί σε μη αντιστρεπτή χημική τροποποίηση ούτε στο αντίσωμα ούτε στο αντιγόνο. Η σύνδεση ενός αντισώματος και ενός αντιγόνου περιλαμβάνει διάφορες μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του αντιγονικού καθοριστή ή επιτόπου του αντιγόνου και της μεταβλητής περιοχής (VH/VL) του αντισώματος

3 Η ακριβής ειδικότητα των αλληλεπιδράσεων αντιγόνου-αντισώματος έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ποικιλίας ανοσολογικών δοκιμασιών, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση της παρουσίας είτε του αντισώματος είτε του αντιγόνου. Οι ανοσοδοκιμασίες έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στη διάγνωση ασθενειών, στην παρακολούθηση των επιπέδων της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης και στον προσδιορισμό μορίων με βιολογικό ή ιατρικό ενδιαφέρον. Αυτές οι δοκιμασίες διαφέρουν ως προς την ταχύτητα και την ευαισθησία, αφού κάποιες είναι αυστηρά ποιοτικές, ενώ, άλλες είναι ποσοτικές

4 ΙΣΧΥΣ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ - ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ
Οι μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις αποτελούν τη βάση της δέσμευσης αντιγόνου-αντισώματος (Ag-Ab), η οποία περιλαμβάνει δεσμούς, υδρογόνου, ιοντικούς δεσμούς, υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και αλληλεπιδράσεις van der Waals (Εικόνα 6-1).

5

6 ΙΣΧΥΣ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ - ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ
Επειδή αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι ασθενείς (συγκρινόμενες με έναν ομοιοπολικό δεσμό), για τη δημιουργία ισχυρής αλληλεπίδρασης Ag-Ab απαιτείται μεγάλος αριθμός τέτοιων αλληλεπιδράσεων. Επιπλέον, κάθε μία από αυτές τις αλληλεπιδράσεις λειτουργεί σε πολύ μικρή απόσταση, γενικά περίπου 1 Χ 10-7 mm (1 angstrom, Ε). Κατά συνέπεια, μία ισχυρή αλληλεπίδραση Ag-Ab εξαρτάται από την πολύ στενή σύνδεση μεταξύ του αντιγόνου και του αντισώματος. Τέτοιες συνδέσεις απαιτούν υψηλό βαθμό συμπληρωματικότητας μεταξύ του αντιγόνου και του αντισώματος, γεγονός που υπογραμμίζει την υψηλή εξειδίκευση, η οποία χαρακτηρίζει τις αλληλεπιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος.

7 Η ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΝΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ

8 Η συνδυασμένη ένταση των μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ μίας συγκεκριμένης αντιγονικής θέσης δέσμευσης σε ένα αντίσωμα και ενός συγκεκριμένου επιτόπου, είναι η συγγένεια (affinity) του αντισώματος για το συγκεκριμένο επίτοπο. Αντισώματα χαμηλής συγγένειας δεσμεύουν αντιγόνα με ασθενή τρόπο και τείνουν να αποσυνδέονται άμεσα, ενώ αντισώματα υψηλής συγγένειας δεσμεύουν τα αντιγόνα ισχυρά και παραμένουν δεσμευμένα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα

9 . Η αλληλεπίδραση μεταξύ της θέσης δέσμευσης ενός αντισώματος (Ab) και ενός μονοσθενούς αντιγόνου (Ag) μπορεί να περιγραφεί με την εξίσωση: k1 Ag + Ab< > Ag-Ab k–1 όπου k1 είναι η σταθερά σύνδεσης και k-1 είναι η (αντίθετη) σταθερά διάστασης. Σε βιοχημικούς όρους, ο λόγος k1/k-1 είναι η σταθερά αλληλεπίδρασης Κa (association constant) (k1/k-1=Ka), η οποία αποτελεί ένα μέτρο της συγγένειας. Στην ανοσολογία, η Κa ονομάζεται σταθερά συγγένειας (affinity constant).

10 Ο ρυθμός με τον οποίο ένα δεσμευμένο αντιγόνο αφήνει τη θέση δέσμευσης ενός αντισώματος (δηλαδή η σταθερά του ρυθμού διάστασης k-1) παίζει σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό της συγγένειας του αντισώματος για ένα αντιγόνο.

11 Η σταθερά συγγένειας Κa, η οποία μέχρι πρότινος ήταν δυνατό να προσδιοριστεί από την ισορροπία διαπίδυσης (equilibrium dialysis), προσδιορίζεται πλέον με πιο σύγχρονες μεθόδους, ειδικότερα με το συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR),. Επειδή η ισορροπία διαπίδυσης επεξηγεί βασικές αρχές και παραμένει, για μερικούς ανοσολόγους, η μέθοδος αναφοράς με την οποία συγκρίνονται όλες οι υπόλοιπες μέθοδοι, περιγράφεται παρακάτω. Στους κατάλληλους προσδέτες περιλαμβάνονται: τα απτένια, οι ολιγοσακχαρίτες και τα ολιγοπεπτίδια.

12 Η ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΔΙΑΠΙΔΥΣΗΣ
Αυτή η διαδικασία χρησιμοποιεί ένα θάλαμο διαπίδυσης ο οποίος περιέχει δύο ίδια τμήματα διαχωρισμένα από μία ημιδιαπερατή μεμβράνη. Το αντίσωμα τοποθετείται στο ένα τμήμα, ενώ ο ραδιενεργά σημασμένος προσδέτης, ο οποίος είναι αρκετά μικρός για να περνά μέσα από την ημιδιαπερατή μεμβράνη, τοποθετείται στο άλλο τμήμα (Εικόνα 6-2).

13 Όταν δεν υπάρχει αντίσωμα, ο προσδέτης που προστίθεται στο τμήμα Β θα εξισορροπηθεί και στις δύο πλευρές της μεμβράνης (Εικόνα 6-2α). Με την παρουσία του αντισώματος, όμως, μέρος του σημασμένου προσδέτη θα δεσμευθεί στο αντίσωμα φτάνοντας σε ισορροπία, με αποτέλεσμα να παγιδεύσει τον προσδέτη στο τμήμα του θαλάμου που περιέχει το αντίσωμα, ενώ ο αδέσμευτος προσδέτης θα μοιραστεί εξίσου και στα δύο τμήματα. Επομένως, η συνολική συγκέντρωση του προσδέτη θα είναι μεγαλύτερη στο τμήμα το οποίο περιέχει το αντίσωμα (Εικόνα 6-2β). Η διαφορά στη συγκέντρωση του προσδέτη στα δύο τμήματα αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του προσδέτη που είναι δεσμευμένος στο αντίσωμα (δηλαδή τη συγκέντρωση του συμπλέγματος Ag-Ab). Όσο υψηλότερη είναι η συγγένεια του αντισώματος, τόσο περισσότερος προσδέτης δεσμεύεται.

14

15 Η ΣΥΝΑΦΕΙΑ ΤΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΕΜΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΗ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΘΕΣΕΩΝ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ

16 Όταν πολύπλοκα αντιγόνα τα οποία περιέχουν πολλαπλούς και επαναλαμβανόμενους αντιγονικούς καθοριστές, αναμιγνύονται με αντισώματα που διαθέτουν πολλαπλές θέσεις δέσμευσης, η αλληλεπίδραση ενός μορίου αντισώματος με ένα μόριο αντιγόνου σε μια θέση δέσμευσης θα αυξήσει την πιθανότητα αντίδρασης μεταξύ των δύο μορίων σε μία δεύτερη θέση δέσμευσης. Η ένταση αυτών των πολλαπλών αλληλεπιδράσεων μεταξύ ενός πολυσθενούς αντισώματος και ενός αντιγόνου ονομάζεται ΣΥΝΆΦΕΙΑ (AVIDITY).

17 ΣΥΓΚΡΙΣΗ Η συγγένεια είναι η σταθερά ισορροπίας που χαρακτηρίζει την αντίδραση μεταξύ μίας μεμονωμένης θέσης δέσμευσης του αντισώματος και του αντιγόνου. Η συνάφεια είναι η σταθερά ισορροπίας, Κeq, που χαρακτηρίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ του άθικτου αντισώματος και του αντιγόνου

18 ΣΥΓΚΡΙΣΗ Η θέση δέσμευσης ενός αντισώματος, που βρίσκεται σε επαφή με ένα μεμονωμένο επίτοπο ενός αντιγόνου, μπορεί να προσανατολίζεται με ιδανικό τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται βέλτιστη προσαρμογή, ενώ η δέσμευση σε πολλαπλούς επιτόπους ενός αντιγόνου είναι δυνατό να απαιτεί κατά κάποιο τρόπο μια τεταμένη γεωμετρία και λιγότερο ιδανικές αλληλεπιδράσεις δέσμευσης. Παρά τους γεωμετρικούς φραγμούς που υψώνονται για την επίτευξη μέγιστων θεωρητικών τιμών συνάφειας, η συνάφεια είναι υψηλότερη από την συγγένεια

19 Η ΥΨΗΛΗ ΣΥΝΑΦΕΙΑ ΣΥΧΝΑ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΝΤΙΣΤΑΘΜΙΣΕΙ ΤΗ ΧΑΜΗΛΗ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ
Για παράδειγμα, η εκκριτική πενταμερής IgM έχει συχνά σημαντικά μικρότερη συγγένεια από τη μονομερή IgG, αλλά η υψηλή συνάφεια της IgM, που απορρέει από το μεγαλύτερο σθένος της, της επιτρέπει να δεσμεύει αποτελεσματικά το αντιγόνο. Πράγματι, στην περίπτωση ενός αντιγόνου, το οποίο διαθέτει πολλούς στενά διατεταγμένους, επαναλαμβανόμενους επιτόπους, όπως στην περίπτωση αυτών που συναντώνται στην επιφάνεια πολλών βακτηρίων και άλλων παθογόνων, μια IgM, με δεσμευτικές θέσεις χαμηλότερης συγγένειας, μπορεί να δεσμεύεται καλύτερα, σε σχέση με μια IgG, που διαθέτει δεσμευτικές θέσεις υψηλότερης συγγένειας

20 ΔΙΑΣΤΑΥΡΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ
αντισώματα που δημιουργούνται έναντι ενός αντιγόνου μπορούν να αλληλεπιδράσουν με ένα μη ειδικό αντιγόνο. Τέτοια διασταυρωτή αντίδραση (cross-reactivity) συμβαίνει αν δύο αντιγόνα μοιράζονται έναν ίδιο ή παρόμοιο επίτοπο. Στη δεύτερη περίπτωση, η συγγένεια του αντισώματος για τον επίτοπο της διασταυρωτής αντίδρασης είναι συνήθως μικρότερη από ό,τι για τον αρχικό επίτοπο

21 ΤΑ ΑΝΤΙΓOΝΑ ΤΩΝ ΟΜAΔΩΝ AIΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤHΜΑΤΟΣ ΑΒΟ (ABO BLOOD-GROUP ANTIGENS

22 ΤΑ ΑΝΤΙΓOΝΑ ΤΩΝ ΟΜAΔΩΝ AIΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤHΜΑΤΟΣ ΑΒΟ (ABO BLOOD-GROUP ANTIGENS
οι μηχανισμοί ανοχής ΑΠΟΤΡΈΠΟΥΝ τη δημιουργία αντισωμάτων εναντίον των αυτόλογων αντιγόνων των ομάδων αίματος.΄Eνα άτομο το οποίο δεν διαθέτει κανένα ή ένα από τα δύο αντιγόνα, θα περιέχει στον ορό του ??? για τα αντιγόνα που λείπουν, τα οποία επάγονται όχι από την έκθεση στα αντιγόνα των ερυθροκυττάρων, αλλά από την έκθεση σε διασταυρωτής αντίδρασης μικροβιακά αντιγόνα, τα οποία είναι παρόντα στα συνήθη βακτήρια της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου.

23 Αυτά τα μικροβιακά αντιγόνα επάγουν τη δημιουργία αντισωμάτων σε άτομα στα οποία λείπουν τα αντίστοιχα αντιγόνα της ομάδας αίματος των ερυθροκυττάρων τους. Τα αντισώματα των ομάδων αίματος, αν και έχουν παραχθεί από μικροβιακά αντιγόνα, αντιδρούν διασταυρωτά με παρόμοιους ολιγοσακχαρίτες των ξένων ερυθροκυττάρων, αποτελώντας τη βάση για τις δοκιμασίες ελέγχου της ομάδας αίματος και καθιστώντας αναγκαία τη χρήση συμβατών ομάδων αίματος κατά τις μεταγγίσεις αίματος.

24 Streptococcus pyogenes
Αντισώματα που παράγονται έναντι των αντιγόνων Μ του στρεπτόκοκκου αντιδρούν διασταυρωτά με διάφορες πρωτεΐνες του μυοκαρδίου και του σκελετικού μυός και έχουν εμπλακεί σε καρδιακές και νεφρικές βλάβες μετά από μόλυνση από στρεπτόκοκκο.

25 Ο ΙΟΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΕΥΛΟΓΙΑ, ΕΜΦΑΝΙΖΕΙ ΕΠΙΤΟΠΟΥΣ ΔΙΑΣΤΑΥΡΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ ΤΟΝ ΙΟ ΠΟΥ ΕΥΘΥΝΕΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΕΜΟΒΛΟΓΙΑ. Ορισμένα εμβόλια, επίσης, εμφανίζουν διασταυρωτή αντίδραση. Για παράδειγμα, εμβόλια του ιού που προκαλεί ευλογιά, εμφανίζουν επιτόπους διασταυρωτής αντίδρασης με τον ιό που ευθύνεται για την ανεμοβλογιά. Αυτή η διασταυρωτή αντίδραση αποτέλεσε τη βάση της μεθόδου του Jenner, ο οποίος χρησιμοποίησε τον ιό της ευλογιάς ως εμβόλιο για να προκαλέσει ανοσία έναντι της ανεμοβλογιάς, όπως αναφέρθηκε και στο Κεφάλαιο 1.

26 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ
Αντισώματα και διαλυτά αντιγόνα που αλληλεπιδρούν σε υδατικά διαλύματα δημιουργούν ένα δίκτυο ή πλέγμα, το οποίο τελικά αναπτύσσει ένα ορατό ίζημα. Αντισώματα τα οποία συσσωματώνουν διαλυτά αντιγόνα ονομάζονται ιζηματίνες (precipitins). Αν και ο σχηματισμός του διαλυτού συμπλέγματος Ag-Ab πραγματοποιείται σε λίγα λεπτά, ο σχηματισμός του ορατού ιζήματος γίνεται πιο αργά και συνήθως χρειάζεται μία ή δύο ημέρες για να ολοκληρωθεί.

27 ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΠΛΕΓΜΑΤΟΣ AG-AB
§ ‑Το αντίσωμα πρέπει να είναι δισθενές. Ίζημα δεν δημιουργείται με μονοσθενή θραύσματα Fab. § ‑Το αντιγόνο πρέπει να είναι είτε δισθενές είτε πολυσθενές. Δηλαδή, πρέπει να έχει τουλάχιστον δύο αντίγραφα του ίδιου επιτόπου, ή να διαθέτει διαφορετικούς επιτόπους, οι οποίοι αντιδρούν με διαφορετικά αντισώματα του πολυκλωνικού αντιορού.

28 ΟΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑΤΑ ΠΑΡΑΓΟΥΝ ΟΡΑΤΕΣ ΓΡΑΜΜΕΣ ΙΖΗΜΑΤΙΝΗΣ
Ανοσοκατακρημνίσεις μπορούν να συμβούν όχι μόνο σε διάλυμα, αλλά και σε πήκτωμα αγαρόζης. Όταν το αντιγόνο και το αντίσωμα διαχυθούν το ένα προς στο άλλο μέσα στην αγαρόζη ή όταν το αντίσωμα είναι ενσωματωμένο μέσα στην αγαρόζη και το αντιγόνο διαχέεται μέσα στο υπόστρωμα που περιέχει το αντίσωμα, σχηματίζεται μία ορατή γραμμή ιζήματος. Όπως και σε μία αντίδραση κατακρήμνισης σε διάλυμα, η ορατή κατακρήμνιση πραγματοποιείται στη ζώνη ισοδυναμίας, ενώ μη ορατό ίζημα δημιουργείται στις περιοχές της περίσσειας είτε του αντιγόνου είτε του αντισώματος

29 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗΣ
Δύο τύποι αντιδράσεων ανοσοδιάχυσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστούν οι σχετικές συγκεντρώσεις αντισωμάτων ή αντιγόνων, να συγκριθούν αντιγόνα ή να προσδιοριστεί η σχετική καθαρότητα ενός δείγματος αντιγόνου: η ακτινωτή ανοσοδιάχυση (radial immunodiffusion, μέθοδος Mancini) και η διπλή ανοσοδιάχυση (double immunodiffusion, μέθοδος Ouchterlony). Και οι δύο πραγματοποιούνται σε ημιστερεό μέσο όπως είναι η αγαρόζη. Στην ακτινωτή ανοσοδιάχυση, ένα δείγμα αντιγόνου τοποθετείται σε ένα φρεάτιο και αφήνεται να διαχυθεί στην αγαρόζη, η οποία περιέχει την κατάλληλη αραίωση αντι­ορού. Καθώς το αντιγόνο διαχέεται στην αγαρόζη, δημιουργείται η ζώνη ισοδυναμίας και ένας δακτύλιος ιζηματίνης γύρω από το φρεάτιο

30 ΑΚΤΙΝΩΤΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ (RADIAL IMMUNODIFFUSION, ΜΈΘΟΔΟΣ MANCINI)
Η περιοχή του δακτυλίου της ιζηματίνης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου. Συγκρίνοντας την επιφάνεια του δακτυλίου της ιζηματίνης με μία πρότυπη καμπύλη (η οποία προκύπτει μετρώντας την επιφάνεια περιοχών ιζηματίνης χρησιμοποιώντας γνωστές συγκεντρώσεις αντιγόνου), μπορούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του δείγματος του αντιγόνου.

31 ΑΚΤΙΝΩΤΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ (RADIAL IMMUNODIFFUSION, ΜΈΘΟΔΟΣ MANCINI), εργ

32 ΔΙΠΛΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ (DOUBLE IMMUNODIFFUSION, ΜΈΘΟΔΟΣ OUCHTERLONY).

33 ΔΙΠΛΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ (DOUBLE IMMUNODIFFUSION, ΜΈΘΟΔΟΣ OUCHTERLONY εργ

34

35 Η ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΥΝΔΥΑΖΕΙ ΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΤΗ ΔΙΠΛΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ
Στην ανοσοηλεκτροφόρηση (immunoelectrophoresis) το μίγμα αντιγόνου ηλεκτροφορείται πρώτα για να διαχωριστούν τα συστατικά του με βάση το φορτίο τους. Η αγαρόζη χαράζεται και δημιουργούνται φρεάτια παράλληλα προς την κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίου, ενώ στη συνέχεια προστίθεται αντιορός στα φρεάτια. Το αντίσωμα και το αντιγόνο διαχέονται το ένα προς το άλλο και δημιουργούν γραμμές ιζήματος όταν συναντώνται στις κατάλληλες αναλογίες

36

37 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ
Η ανοσοηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται στα κλινικά εργαστήρια για την ανίχνευση της παρουσίας ή όχι πρωτεϊνών στον ορό. Ένα δείγμα ορού ηλεκτροφορείται και τα επιμέρους συστατικά του ταυτοποιούνται με αντιορό ο οποίος εμφανίζει ειδικότητα έναντι της συγκεκριμένης πρωτεΐνης ή της τάξης ανοσοσφαιρίνης. Αυτή η τεχνική είναι χρήσιμη για να διαπιστωθεί αν ένας ασθενής παράγει χαμηλές ποσότητες ενός ή περισσοτέρων ισοτύπων, κάτι που αποτελεί χαρακτηριστικό συγκεκριμένων ανοσοανεπαρκειών.

38 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ
Μπορεί, επίσης, να δείξει αν ένας ασθενής υπερπαράγει κάποια πρωτεΐνη του ορού, όπως είναι η αλβουμίνη, οι ανοσοσφαιρίνες ή η τρανσφερίνη. Το πρότυπο της ανοσοηλεκτροφόρησης του ορού από ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα, εμφανίζει μια μεγάλη ποσότητα πρωτεΐνης του μυελώματος. Επειδή η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι μία αυστηρά ποιοτική τεχνική, με την οποία ανιχνεύονται μόνο σχετικά μεγάλες συγκεντρώσεις (μεγαλύτερες από αρκετές εκατοντάδες μg/ml), η χρησιμότητά της περιορίζεται στην ανίχνευση ποιοτικών ανωμαλιών μόνο όταν η απόκλιση από το φυσιολογικό είναι μεγάλη, όπως σε περιπτώσεις ανοσοανεπαρκειών και ανοσοϋπερπλαστικών ανωμαλιών.

39 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΡΟΥΚEΤΑΣ (rocket electrophoresis)

40

41 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ περιορισμός της ηλεκτροφόρησης ρουκέτας είναι η ανάγκη το αντιγόνο να είναι αρνητικά φορτισμένο, έτσι ώστε να επιτυγχάνεται ηλεκτροφορητική κίνηση μέσα στο πήκτωμα της αγαρόζης. Μερικές πρωτεΐνες, οι ανοσοσφαιρίνες για παράδειγμα, δεν είναι επαρκώς φορτισμένες για να αναλυθούν ποσοτικά με την ηλεκτροφόρηση ρουκέτας και ούτε είναι δυνατή η ταυτόχρονη μέτρηση των επιπέδων αρκετών αντιγόνων σε ένα μίγμα.

42 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ
Η αντίδραση μεταξύ αντισώματος και συγκεκριμένου αντιγόνου οδηγεί σε μία ορατή μάζα και ονομάζεται συγκόλληση (agglutination). Αντισώματα που προκαλούν τέτοιες αντιδράσεις ονομάζονται συγκολλητίνες (agglutinins). Οι αντιδράσεις συγκόλλησης είναι παρόμοιες ως προς τη βασική αρχή με τις αντιδράσεις κατακρήμνισης και εξαρτώνται από την αντίδραση πολυσθενών αντιγόνων. Όπως η περίσσεια αντισώματος αναστέλλει τις αντιδράσεις κατακρήμνισης, με τον ίδιο τρόπο η ίδια περίσσεια μπορεί να αναστείλει τις αντιδράσεις συγκόλλησης: αυτή η αναστολή ονομάζεται φαινόμενο προζώνης (prozone effect) μπορεί να συναντηθεί σε πολλούς τύπους ανοσοδοκιμασιών

43 ΦΑΙΝOΜΕΝΟ ΠΡΟΖΩΝΗΣ (prozone effect).
μηχανισμοί που μπορούν να προκαλέσουν το φαινόμενο προζώνης υψηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων. Ο διαθέσιμος αριθμός των θέσεων δέσμευσης των αντισωμάτων μπορεί να είναι πολύ μεγαλύτερος από τον αριθμό των επιτόπων με αποτέλεσμα, τα περισσότερα αντισώματα δεσμεύουν αντιγόνα μόνο με μονοσθενή αντί πολυσθενή τρόπο.

44 ΦΑΙΝOΜΕΝΟ ΠΡΟΖΩΝΗΣ (prozone effect).
Σε υψηλές συγκεντρώσεις IgG, ατελή αντισώματα δεσμεύουν τις περισσότερες αντιγονικές περιοχές, παρεμποδίζοντας την πρόσβαση στα αντισώματα της τάξης Μ, που αποτελούν καλές συγκολλητίνες. Αυτό το φαινόμενο δεν παρατηρείται με μονοκλωνικά αντισώματα

45

46 Η αιμοσυγκόλληση χρησιμοποιείται για την τυποποίηση των ομάδων αίματος
Αν τα αποτελέσματα είναι ασύμφωνα και οι δοκιμασίες συγκόλλησης υποδεικνύουν ότι ο δότης διαθέτει αντισώματα που αντιδρούν με τα δικά του αντιγόνα ΑΒΟ, τότε είτε υφίσταται κάποιο τεχνικό πρόβλημα (ο κυτταρικός προσδιορισμός ή ο προσδιορισμός αντισώματος είναι λάθος), είτε ο δότης παράγει αντισώματα εναντίον του εαυτού του, κάτι που αποτελεί ένδειξη αυτοανοσίας.

47 Η βακτηριακή συγκόλληση χρησιμοποιείται για τη διάγνωση λοιμώξεων
Μία βακτηριακή λοίμωξη, συνήθως, επάγει την παραγωγή αντισωμάτων με ειδικότητα έναντι επιφανειακών πρωτεϊνών των βακτηριακών κυττάρων. Η παρουσία τέτοιων αντισωμάτων μπορεί να ανιχνευθεί με αντιδράσεις βακτηριακής συγκόλλησης Οι αντιδράσεις συγκόλλησης αποτελούν και έναν τρόπο τυποποίησης των βακτηρίων. Για παράδειγμα, διαφορετικά είδη βακτηρίων Salmonella μπορούν να διακριθούν με αντιδράσεις συγκόλλησης χρησιμοποιώντας μία ευρεία κλίμακα αντιορών τυποποίησης.

48 Η παθητική συγκόλληση είναι χρήσιμη για τα διαλυτά αντιγόνα
Η ευαισθησία και η απλότητα των αντιδράσεων συγκόλλησης μπορεί να επεκταθεί και στα διαλυτά αντιγόνα με την τεχνική της παθητικής αιμοσυγκόλλησης. προετοιμάζονται ερυθροκύτταρα ευαισθητοποιημένα με αντιγόνα, με την ανάμιξη ενός διαλυτού αντιγόνου και ερυθροκυττάρων τα οποία έχουν υποστεί επεξεργασία είτε με ταννικό οξύ είτε με χλωριούχο χρώμιο, τα οποία επάγουν την προσρόφηση του αντιγόνου στην επιφάνεια του ερυθροκυττάρου. Ο ορός που περιέχει τα αντισώματα αραιώνεται διαδοχικά σε φρεάτια μικροπλακών και, στη συνέχεια, τα επικαλυμμένα με το αντιγόνο ερυθροκύτταρα προστίθενται σε κάθε φρεάτιο. Η συγκόλληση εκτιμάται από το μέγεθος του χαρακτηριστικού προτύπου διάχυσης της συγκόλλησης των ερυθροκυττάρων στην επιφάνεια των φρεατίων, ίδιο με αυτό που παρατηρείται στις αντιδράσεις συγκόλλησης

49

50 Τα τελευταία χρόνια, τα ερυθροκύτταρα έχουν αντικατασταθεί από συνθετικά σωματίδια και συγκεκριμένα, σφαιρίδια από latex, ως υπόβαθρο για τις αντιδράσεις συγκόλλησης. Όταν το αντιγόνο έχει δεσμευθεί στα σφαιρίδια από latex, αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή να αποθηκευθούν για περαιτέρω χρήση.

51 Στην αναστολή συγκόλλησης, η απουσία συγκόλλησης είναι διαγνωστική για την ύπαρξη του αντιγόνου
Μία τροποποίηση της αντίδρασης συγκόλλησης, ονομάζεται αναστολή συγκόλλησης (agglutination inhibition) και αποτελεί μία δοκιμασία υψηλής ευαισθησίας για μικρές ποσότητες αντιγόνου

52

53 Στην αναστολή συγκόλλησης, η απουσία συγκόλλησης είναι διαγνωστική για την ύπαρξη του αντιγόνου
Δοκιμασίες αναστολής συγκόλλησης χρησιμοποιούνται ευρέως σε κλινικά εργαστήρια για να προσδιοριστεί αν ένα άτομο έχει εκτεθεί σε συγκεκριμένους τύπους ιών, οι οποίοι προκαλούν συγκόλληση των ερυθροκυττάρων. Αν ο ορός ενός ατόμου περιέχει συγκεκριμένα αντι-ιικά αντισώματα, τότε τα αντισώματα θα δεσμεύσουν τον ιό και θα παρεμποδίσουν την αιμο­συγκόλληση από τον ιό. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται συνήθως σε προγαμιαίες εξετάσεις για τον προσδιορισμό της ανοσολογικής κατάστασης της γυναίκας, σε σχέση με τον ιό της ερυθράς. Η αντίστροφη τιμή της τελευταίας αραίωσης του ορού η οποία προκαλεί αναστολή της αιμοσυγκόλλησης της ερυθράς, είναι και ο τίτλος του ορού. Τίτλος μεγαλύτερος από 10 (δηλαδή αραίωση 1:10) είναι ένδειξη ότι μία γυναίκα εμφανίζει ανοσία στην ερυθρά, ενώ τίτλος μικρότερος από 10 είναι ενδεικτικός έλλειψης ανοσίας και ότι υπάρχει ανάγκη ανοσοποίησης με εμβόλιο έναντι της ερυθράς.

54