R-Biopharm AG ფერმენტაციული ბიოანალიზი

Παρουσίαση με θέμα: "R-Biopharm AG ფერმენტაციული ბიოანალიზი"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 R-Biopharm AG ფერმენტაციული ბიოანალიზი
2011

2  შაქრები მჟავები სპირტები და სხვა...
ფერმენტული ანალიზი ეს არის შუალედური კატაბოლური პროდუქტების ანალიზი ფერმენტების საშუალებით.  შაქრები მჟავები სპირტები და სხვა... 2011

3 1954წ. - დაიწყო ფერმენტების გამოყენება კლინიკო-ქიმიურ ლაბორატორიებში.
1954წ. - დაიწყო ფერმენტების გამოყენება კლინიკო-ქიმიურ ლაბორატორიებში. 1970წ. - დაიწყო ფერმენტების გამოყენება კვებით დიაგნოსტიკაში. 1975წ. - პირველად გამოჩნდა Boehringer Mannheim-ის ტესტ კომპლექტები საკვები პროდუქტებისა და ცხოველთა საკვების ანალიზისათვის. 2011

4 ფერმენტული მეთოდები კანონმდებლებობით:
2011

5 ნორმირებული ეტალონ-მეთოდები
2011

6 საერთაშორისო ორგანიზაციების რეკომენდაციები
2011

7 Roche-ს ტესტები დღეისთვის ითვლება ეტალონურ ტესტებად
ტესტები გადის დეტალურ შემოწმებას ლაბორატორიათაშორის კვლევებში. შედეგები გამოქვეყნებულია. ეტალონ მეთოდებად აღიარებულია არამარტო სახელმწიფო, არამედ საერთაშორისო ორგანიზაციების მიერ. ხელმისაწვდომია 31 სახის ტესტი. 2011

8 ძირითადი პრინციპები ფერმენტები წარმოადგენენ
ადამიანის ყველაზე მნიშვნელოვან ცილებს ჯერ აკატალიზებს რეაქციებს ხარჯის გარეშე აკატალიზებს რეაქციებს. მკაცრად სპეციფიურებია 2011

9 ტესტირების პრინციპი ფერმენტები აკატალიზებს გარკვეული სუბსტრატის გარდაქმნის სპეციფიურ რეაქციას კოფერმენტი ძირითადად NAD (P) და მოქმედებს როგორც H+ აქცეპტორი წარმოქმნილი NADH რაოდენობა სინჯში სუბსტრატის რაოდენობისტ ექვივალენტურია დეჰიდროგენაზა სუბსტრატი კოფერმენტი+ პროდუქტი კოფერმენტი 2011

10 ფერმენტი და კოფერმენტი
2011

11 ოთახის ტემპერატურის 100-ით მატება ზრდის რეაქციის სიჩქარეს ორჯერ
ოთახის ტემპერატურის 100-ით კლება ამცირებს რეაქციის სიჩქარეს ორჯერ რეაქციის სიჩქარის ტემპერატურული ოპტიმუმი -370C (ამის ზევით სიჩქარე კვლავ მცირდება) 2011

12 კოფერმენტი NAD ან NADP - ნიკოტინამიდ-ადენინ-დინუკლეოტიდი (ფოსფატი)
2011

13 NADH და NAD+-ის შთანთქმა
2011

14 გაზომვის პრინციპი 2011

15 სარეაქციო მრუდი NAD NADH
2011

16 სარეაქციო მრუდი NADH NAD
2011

17 აურიეთ, გაზომეთ A 1, იწყება რეაქცია სტარტულიფერმენტი 0.020ml
დატანის სქემა უჯრედი ბლანკი სტანდარტი სინჯი ბუფერი, მარილები 1.000ml - 0.100ml წყალი 2.000ml 1.900ml აურიეთ, გაზომეთ A 1, იწყება რეაქცია სტარტულიფერმენტი 0.020ml რეაქციის დასასრული, აიღეთ A2 ანათვალი 2011

18 სარეაქციო ბლანკი (სუფთა)
2011

19 ლამბერტ-ბერის კანონი სადაც: 2011 c - კონცენტრაციაა g/l
V - საბოლოო მოცულობა ml v - სინჯის მოცულობა ml M - საკვლევი ნიმუშის მოლეკულური მასა g/mol d - ოპტიკური გზა cm ε - NADH-ის შთანთქმის კოეფიციენტი, 6.3 (l x mmol -1 x cm -1) 340nm-ზე სინჯის დიდი მოცულობის შემთხვევაში შეცვალეთ ფორმულა! 2011

20 გაანგარიშება ნიმუში: გლუკოზა c = F x ΔA ხაზოვანი გრაფიკი F ფაქტორით
C = x ΔA (340nm) 2011

21 სინჯის განზავება ან მოცულობის გაზრდა
უნდა შესრულდეს ლამბერტ-ბერის კანონი Δ A<1.0 (A) სიგნალი უნდა იყოს ძლიერი, რომ გამოირიცხოს შეცდომები გაზომვისას ΔA>0.1 (A) ΔA> ganazaveT sinji ΔA< gazrdeT sinjis moculoba 2011

22 ქრომოგენური ტესტები შემდეგ ტესტებში კოფერმენტის NAD(P) ნაცვლად გამოყენებულია ქრომოგენი ყურდღება! ქრომოგენი ძალიან მგრძნობიარეა, ამიტომ რეაქცია უნდა მიმდინარეობდეს სიბნელეში! 2011

23 ტესტ კომპლექტის შემადგენლობა
კომპლექტის შეიცავს ყველა საჭირო რეაგენტებს ფერმენტებს და კოფერმენტებს (გაწმენდილი) ბუფერულ ხსნარებს მარილებს (ხანდახან საჭიროა როგორც აქტივატორები) უმეტესობა შეიცავს საკონტროლო ნიმუშს არ არის აუცილებელი ხსნარის მომზადებისას ძლიერი შენჯღრევა, საკმარისია ფრთხილად არევა და ცოტა ხნით დაყოვნება! 2011

24 ხარისხის კონტროლი ყოველი ცდის გაშვებისას უნდა ტესტირდეს მინიმუმ ერთი კონტროლი ძირითადად კონტროლები თან ახლავს კომპლექტს, მხოლოდ აცეტალდეჰიდისა და ასკორბინის მჟავას და სულფიტის შემთხევევაში მათი არასტაბილურობის გამო კონტროლები ცალკეა შესაკვეთი. კონტროლის აღდგენა - 100±5% თუ აღნიშნული შედეგი არ მიიღწევა შეამოწმეთ ტესტირების პროცედურა. იკრძალება შედეგების გადათვლა კონტროლის მაჩვენებლის მაგ. 14%-იანი გადახვევისას. 2011

25 მოწყობილობა ფერმენტული ტესტების კომპლექტი ფოტომეტრი
განცალკევებადი უჯრედები და ჩარჩო ჩასამაგრებლად შპატელები პიპეტები დისტ. წყალი მნიშვნელოვანია რეგულარულად შეამოწმოთ თქვენი პარატურის გამართული მუშაობა. 2011

26 სინჯების მომზადება ზოგადი მითითებანი: დაქუცმაცება და ჰომოგენიზაცია
წყლით ან სხვა რამით ექსტრაქცია განზავება (შეიძლება გამორიცხოს სხვა საფეხურები) ფილტრაცია ან ცენტრიფუგირება დეპროტეინიზაცია (მაგ. HClO4) Carrez რეაქცია (რძე) ცხიმების მოცილება ნეიტრალიზაცია გაუფერულება (ინტენსიური შეფერვისთვის E1>0.5) არსებობს სხვა მეთოდებიც, მაგრამ გამოიყენეთ მხოლოდ შესაფერი ! რაც შეიძლება ნაკლები საფეხურები! 2011

27 გადატვირთვა და შიდა კონტროლი
რეაქციის დამთავრებისას სინჯარაში ემატება კონტროლი და რეაქცია ხელახლა გაიშვება იზომება A3 და A2, ხოლო კონტროლი უნდა აღდგეს (g/l±5%). შიდა კონტროლი საკონტროლი სინჯი ტესტირდება იგივე სინჯარაში, რომელშიც საკვლევი. გამოიყვანება და გადამოწმდება OD-ს აღდგენა. ეს ორი მეთოდი განსხვავდება არსებული ტრადიციული კონტროლის მეთოდისგან კონტროლი ერევა იმ ცალკეულ სინჯებს, რომელიც საეჭვოა ან სადაც არსებობს ჯვარედინი რეაქცია. ეს იძლევა ინჰიბიტორების არსებობის დადგენის საშუალებას ცალკეულ სინჯებში. 2011

28 მოცულობის ნახევარში შიდა კონტროლი აღდგენა
მოცულობის ნახევარში შიდა კონტროლი აღდგენა უჯრაში ბლანკი სტანდარტი სინჯი სინჯი +IC ბუფერი, მარილები 1.000ml 1,000ml - 0,100ml 0.050ml 0.100ml წყალი 2.000ml 1.900ml არევა, A1-ის განსაზღვრა, შემდეგ იწყება რეაქცია სასტარტო ფერმენტი 0.020ml რეაქცია სრულდება, A2-ის განსაზღვრა გაანგარიშება ვარგისიანია g/l-ის შემთხვევაშიც! 2011

29 ლიმონ მჟავა 2011

30 დატანის სქემა 2011 უჯრაში ბლანკი სტანდარტი სინჯი სინჯი (მგრძნობიარე)
სინჯი (მგრძნობიარე) ხსნარი 1 (ბუფერი) 1.000ml 1,000ml - 0,200ml 2.000ml კონტროლი 0.200ml წყალი 1.800ml არევა, A1-ის განსაზღვრა 5წთ-ის შემდეგ, იწყება რეაქცია ხსნარი 2, (ფერმენტი) 0.020ml არევა, A2-ის განსაზღვრა 5წთ-ის შემდეგ 2011

31 განზავების სქემა < 0.4g/l - 1 0.4-4.0g/l 1+9 10 4.0-40g/l 1+99 100
მაგ. ლიმონ მჟავას კონც. განზავება წყლით განზავების ფაქტორი F < 0.4g/l - 1 g/l 1+9 10 4.0-40g/l 1+99 100 > 40g/l 1+999 1000 გაზომვის დიაპაზონი 0.1– 1.0 შორის = Factor 10 განზავების ბიჯი 10 2011

32 გლუკოზა/ფრუქტოზა 2011

33 დატანის სქემა 2011 უჯრაში ბლანკი სინჯი ხსნარი 1 ბიდისტ. წყალი 1.000ml
- 2.000ml 1,000ml 0.100ml 1.900ml აურიეთ, 3წთ-ში გაზომეთ A1, დაიწყეთ რეაქცია სუსპენზია 2 0.020ml აურიეთ, 10-15წთ-ში გაზომეთ A2, თუ რეაქცია ამ დროში არ შეწყდა, მონაცემების აღება გააგრძელეთ 2-2წთ-იანი ინტერვალებით მანამ, სანამ მაჩვენებლები არ გაიზრდება. სუსპენზია 3 აურიეთ, 10-15წთ-ში გაზომეთ A3. 2011

34 გლუკოზა/ფრუქტოზას რეაქციის გრაფიკი
2011

35 განზავების სქემა წინა ნიმუშის მსგავსია პირველი სუსპენზიის ხსნარის დამატება განაპირობებს სინჯში არსებული გლუკოზისა და ფრუქტოზის ფოსფორილირებას (აიღება A1 მაჩვენებელი) მეორე სუსპენზიის ხსნარის (ჰექსოკინაზა) დამატების შემდეგ ისაზღვრება გლუკოზის რაოდენობა - (აიღება A2 მაჩვენებელი) მესამე სუსპენზიის ხსნარის (ფოსფოგლუკოზ იზომერაზა) დამატების შემდეგ Fructose-6-P გარდაიქმნება Glucose-6-P-ად და ამ სახით ისაზღვრება ფრუქტოზის რაოდენობა სინჯში (აიღება A3 მაჩვენებელი) 2011

36 ზოგადი პროცედურა რეაქტივების წარმოება R-Biopharm წარმოადგენს Roche-ს ფერმენტული ტესტების დისტრიობუტორს უკვე 10 წელია. მთელი ამ ხნის განმავლობაში არ ყოფილა შემთხვევა, რომ ხარისხის გამო ტესტების პარტია მოხსნილიყო გაყიდვიდან. ამის მიზეზი შესაძლებელია იყოს ბოთლის მექანიკური დაზიანება, რაც ადვილი შესამჩნევია თვალით, ან იშვიათად როცა რეაქტივი მაგ. დაიჟანგა. 2. ტრანსპორტირება და შენახვა ტესტები შესაძლებელია გზაში იყოს 3 კვირა ოთახის ტემპერატურაზე. (თითოეული პარტია გადის ავარიულ შემოწმებას) ინახება 2-80C. განზავებული ბიდისტ. წყლით ინახება 2-80C. 3. ხარისხის კონტროლი კონტროლის აღდგენა უნდა მოხდეს ±5%. წინააღმდეგ შემთხვევაში შეამოწმეთ აპარატურა და ცდის მსვლელობა. 4. სინჯის ტიპი, ცდის მომზადება და სამუშაო 2011

37 სინჯის მომზადება ტესტების უმრავლესობისთვის ტესტირების პროცედურა ძალიან მარტივია, მაგრამ გარკვეულ სირთულეს წარმოადგენს სინჯების სწორი მომზადება. სინჯთა მომზადების მეთოდები ძალიან სპეციფიურია ინდუსტრიული სექტორისთვის (რძე, ღვინო, ხილის წვენები, ხორცი, კვერცხი და ა.შ.). აღნიშნული მეთოდიკები მუშავდება და გროვდება თვით მწარმოებლებისა და ლაბორატორიების მიერ და შემდეგ პოულობს საერთაშორისო აღიარებას. 2011

38 ტესტირების პროცედურა 1. ინახება 2-80C 2. მნიშვნელოვანი ფაქტორია წყლის ხარისხი 3. ტესტირების წინ რეაგენტები დააყოვნეთ ოთახის ტემპარეტურაზე. 4. სინჯთა განზავებისას ზუსტად მისდიეთ ინსტრუქციებს. 5. დაიცავით დატანის პრინციპი (ზევიდან ქვევით) 5. გამოიყენეთ საკონტროლო რეაგენტები (სტანდარტები) 6. ზუსტად დაიცავით იnკუბაციის დროითი ინტერვალები. 7. თუ შესაძლებელია გადატვირთეთ ანალიზი. 2011

39 OD-ს შემოწმება, თუ NAD+ NAD H
ნორმალური სინჯი <0.3 >0.1 OK (<2.0) შეფერილი სინჯი >0.3 <1.0 <2.0 2011

40 OD-ს შემოწმება, თუ NADH NAD+
A11.6, რადგან NADH კონცენტრაცია სტაბილურია კომპლექტისა და სერიის მიუხედავად. A1 ΔA A2 ნორმალური სინჯი 1.6 >0.1 >0.6 <1.6 შეფერილი სინჯი >1.6 <2.2 <1.0 <2.0 2011

41 ყველაზე ხშირად დაშვებადი შეცდომები:
ტესტ კომპლექტთან და მის შენახვასთან დაკავშირებული მანიპულაციები (მაგ. განზავების შეცდომა, წყლის ხარისხი და ა.შ.) საკონტროლო ხსნარის დამზადება (მაგ. თუ ხელით მზადდება ხსნარები მag.- pH, სისუფთავე და ა.შ.) გაანგარიშების შეცდომები სპექტროფოტომეტრის გაუმართაობა პიპეტების სიზუსტე საკონტროლო ხსნარების აღდგენა = 100±5% 2011

42 გმადლობთ ყურადღებისთვის!
2011