FERMENTACIJA Bakterije mlečne kiseline.

Παρουσίαση με θέμα: "FERMENTACIJA Bakterije mlečne kiseline."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 FERMENTACIJA Bakterije mlečne kiseline

2 (Sl. glasnik RS, br.33/2010) ČLAN 72. Pojam
Definicija Starter kultura – mikrobni preparat; sadrži veliki broj ćelija najmanje jedne vrste MO; sa namerom se dodaje materijalu kako bi dobili fermentisani proizvod i to ubrzavanjem i kontrolisanjem procesa fermentacije (metabolička aktivnost) Proizvodnja fermentisanih proizvoda – BIOPROCESIRANJE Spontane fermentacije – aktivnost autohtonih sojeva poreklom iz sirovine i okruženja - početak tradicionalne biotehnologije PRAVILNIK O KVALITETU POIZVODA OD MLEKAI STARTER KULTURA (Sl. glasnik RS, br.33/2010) ČLAN 72. Pojam

3 PODELA SELEKCIONISANE I PRECIZNO DEFINISANE predvidljiva i ponovljiva stopa acidifikacije, i razvijanja specifičnih senzornih karakteristika – KONTROLA PROCESA FERMENTACIJE I DOBIJANJE PROIZVODA STANDARDNOG KVALITETA; mono i mešovite kulture, mezofilne i termofilne, tečne, liofilizovane, smrznute, 2 tipa bakterija – producenti kiseline i producenti aromatičnih materija NEDEFINISANE, TRADICIONALNE KULTURE prirodne, “wild-type” BMK; iniciraju proces u odsustvu komercijalnih startera; neponovljivost ukusa kod tradicionalnih proizvoda – NSBMK – ne predstavljaju deo starter flore, ali se u velikoj biomasi uspostavljaju tokom perioda zrenja, kao sekundarna flora

4 WHY FERMENTED PRODUCTS ?
Nutritivna vrednost – svarljivost, sadržaj esencijalnih nutrijenata Predigestija proteina, UH – bolja tolerancija jogurta kod laktoza intolerantnih osoba Fermentisana mleka – izvor biološki aktivnih komponenti – BMK (probiotici), njihovi metabolički produkti, ili komponente koje nastaju po digestiji proteina mleka aktivnošću indogenih enzima mleka : peptidi sa opoidnom, antikancerogenom, antihipertenzivnom, imunomodulatornom aktivnošću Represija patogena i MO kvara: sniženje pH na osnovu produkcije organskih kiselina, kompeticija za hranjive materije, snižavanje redoks potencijala, produkcija specifičnih inhibitornih jedinjenja - bakteriocini

5 prvi slikovni zapis na steli iz doba Ptolomeja u Starom Egiptu
Historija Zemlja 4,5 biliona godina stara, BMK 3 biliona godina populacija BMK se progresivno širi pojavom sisara pre 65 miliona godina uzgajanje stoke – pre 8000 godina – praksa proizvodnja fermentisane hrane prvi slikovni zapis na steli iz doba Ptolomeja u Starom Egiptu Biblija – patrijarh Avram – pred tri anđela iznosi grušano mleko (Genesis VIII)

6 Historija Homer – Odiseja – prvi proizvođač sira Polyfemus – (Aristotel, Varro, Columella) Rimske legije – instrumental širenja tehnologije izrade sireva CASEALE –zasebne prostorije u rimskim kućama Srednji vek – manastiri, veliki feudalni posjedi Doba Renesanse – sir nije zdrav, popularnost se vraća početkom 19. veka sistematska upotreba starter kultura – sredinom XX stoleća /Christian Hansen fermentacija sa selekcionisanim intestinalnim MO – Shirota Institute for Research on Protective Bacteria industrijska primena probiotskih MO – posle godine

7 Statistika Bulletin No. 35 IDF – 22 kg po glavi stanovnika (prosečna godišnja potrošnja fermentisanih proizvoda u Evropi) 8,5 biliona kg fermentisanog mleka/godini 108 CFU/g – 8,5 x 1020 BMK 4 x g – 3400 tone ćelija BMK godišnje u Evropi (fermentisana mleka)

8 BMK Grupa Gram pozitivnih, nesporogenih MO funkcionalno povezanih na osnovu sposobnosti da produkuju mlečnu kiselinu tokom homo- ili heterofermentacije; fakultativno anaerobni sa fermentativnim metabolizmom Katalaza negativni /u retkim slučajevima aktivnost pseudokatalaze Morfološki oblici koka, štapića, kokobacili, hemoorganotrofi Slabo proteolitični i lipolitični, kompleksni nutritivni zahtevi (purinske i pirimidinske baze, AK, vit B grupe)

9 Ključ za diferencijaciju BMK i komparacija sa sadašnjom taksonomijom
Rod Oblik Katalaza Redukcija nitrata Fermentacija Sadašnji rodovi Betabacterium štapić - hetero Lactobacillus Weisella Thermobacterium homo Streptobacterium homo, hetero Carnobacterium Streptococcus koka Enterococcus Lactococcus Vagococcus Betacoccus Leuconostoc Oenococcus Microbacterium + Brochothrix Tetracoccus Pediococcus Tetragenococcus

10 Glavne filogenetske grupe BMK

11 BMK Mezofili (5oC – 45oC); pH 4,0-4,5 (pH 9,6; pH 3,2)
S. thermophilus, by Broadbent Leuconostoc spp. Pediococcus spp. Lb. casei, by Broadbent Enterococcus faecalis Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, by Broadbent

12 Industrijska primena BMK
Starter kulture, pomoćne starter kulture Zaštitne kulture Probiotici-funkcionalna hrana GRAS status (“Generally Recognised As Safe”); FOOD GRADE organisms QPS koncept (“Qualified Presumption of Safety”) (Evropa) 9/21/2018

13 Mehanizmi antagonizma BMK
Antagonizam - inhibicija drugih (MO kvara ili patogenih vrsta) organizama putem kompeticije za hranjive materije, ili produkcijom metabolita sa antimikrobnim delovanjem Mikrobna interferencija - efikasni nespecifični mehanizam kontrole uobičajen za sve populacije i sredine (niše) uključujući i namirnice; inhibicija rasta određenih MO od strane drugih članova habitata i to na osnovu kompeticije za hranjive materije, ostvarivanja nepovoljne sredine te kompeticije za adheziona mesta 9/21/2018

14 Metabolički produkti BMK sa antimikrobnim svojstvima
Glavni target organizmi Organske kiseline Mlečna kiselina Sirćetna kiselina Truležne i Gram negativne bakterije, pojedine plesni Truležne bakterije, klostridije, pojedini kvasci i plesni Hidrogen peroksid Patogeni i MO kvara posebno u namirnicama bogatim na sadržaju belančevina Metaboliti male molekulske mase Reuterin (3-OH-propionaldehid) Diacetil Masne kiseline Široki spektar bakterija, kvasci i plesni Gram negativne bakterije Različite bakterije Bakteriocini nizin Pojedine BMK i Gram pozitivne bakterije, posebno sporogeni MO 9/21/2018

15 STARTERI

16 KOMPONENTE STARTERA Mozzarella sir – S. thermophilus, Lb. delbruecki,
ili Lb. helveticus Švajcarski sirevi – S. thermophilus, Lb. helveticus, Propionibacterium shermani

17 JOGURTNA KULTURA MODEL UDRUŽENOG RASTA - PROTOKOOPERACIJA, METABIOZA
ACIDIFIKACIJA RAZVIJANJE UKUSA RAZVIJANJE TEKSTURE – produkcija egzopolisaharida Egzopolisaharidi,microbes from raw milk, p.100 ADM, page 180

18 “Screening” testovi – pogodnost BMK kao startera

19 GENERALNI KRITERIJUMI ZA STARTER KULTURE
1. BEZBEDNOST 1.1. Starter organizam ne posjeduje aktivnost patogena i/ili toksičnu aktivnost 1.2. Nisu nosioci prenosivih gena koji kodiraju svojstvo rezistencije na ANT 2. TEHNOLOŠKA EFIKASNOST 2.1. Starter MO dominiraju nad popratnom mikroflorom 2.2. Starter MO ispoljavaju potrebnu metaboličku aktivnost 3. EKONOMSKI ASPEKT 3.1. Propagacija kultura mora biti isplativa sa ekonomske tačke gledišta 3.2. Mogućnost konzervisanja postupcima zamrzavanja ili sušenje zamrzavanjem uz mali (zanemarljiv) gubitak aktivnosti 3.3. Važna biotehnološka svojstva su stabilna pod definisanim uslovima skladištenja u periodu od nekoliko meseci 3.4. Upotreba kultura što je moguće jednostavnija

20 GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK - homofermentacija

21 GENERALIZOVANA SCHEMA FERMENTACIJE HEKSOZA KOD BMK - heterofermentacija

22 PEP / zavisni PTS sistem

23 LAKTOZA PERMEAZA/β GALAKTOZIDAZA SISTEM

24 PROTEOLITIČKi SISTEM LAKTOKOKA

25 PEPTIDAZE BMK

26 METABOLIZAM CITRATA BMK

27 BAKTERIOCINI Heterogena grupa antimikrobnih proteina i peptida koji deluju antagonistički primarno prema blisko srodnim vrstama MO Klasifikacija (Klaenhammer, 1988) Klasa I (lantibiotici; mali, termostabilni, sadrže neuobičajene AK) Klasa II: IIa-pediocinu-slični bakteriocini sa antilisterija efektom; IIb-dvokomponentni bakteriocini; IIc-ostali bakteriocini Klasa III-veliki (>30kDa) termolabilni proteini Klasa IV-kompleksni bakteriocini koji sadrže ugljenohidratnu i/ili lipidnu komponentu Microbes from raw milk for fermented dairy products, str.96 Primer sa slike, liza startera i otpuštanje intracelularno lokalizovanih peptida Nedostaci iz plave sveske Bakteriocini su niske molekularne mase peptidi ili proteini sa antimikrobnim delovanjem na srodne Gram pozitivne bakterije, te se bakteriocin produkujući sojevi mogu koristiti u svrhu biološkog konzervisanja namirnica In situ produkcija bakteriocina može povećati kompetitivnost producent soja u matriksu namirnice i time sprečiti kvar namirnice, odnosno po principu kompetivnog isključenja onemogućiti rast patogena, bakteriocin produkujući sojevi BMK mogu se koristiti kao alternativa kalijum nitratu u sprečavanju kasnog namimanja sira usled kontaminacije klostrijama Drugi primer je ste supresija sojeva mikroorganizama koji su odgovorni za pojavu mana ukusa ui fermentisanim proizvodima, npr. Određeni sojevi L. lactis

28 9/21/2018

29 In vitro ispitivanje produkcije bakteriocina
9/21/2018

30 MEHANIZMI BORBE PROTIV BAKTERIOFAGA
TEHNOLOŠKE MERE Primena startera sa sojevima neosetljivim na fage, odnosno koji nisu homologni Aseptični sistemi propagacije Primena fag-inhibitornih medija Rotacija startera Kondicioniranje vazduha Izbegavanje generisanja aerosola Čišćenje/hlorisanje CIP sistem Segragacija starter soba od proizvodne opreme Odgovarajući dizajn postrojenja SELEKCIJA izlaganje koktelu bakteriofaga GENETSKI INŽENJERING ADM, Ubikvitarnost bakteriofaga u postrojenjima za proizvodnju sira, njihova brza sopa replikacije i njihova sposobnost konstantne mutacije diktira proizvođačima sira da neprestano budu na oprezu u kontroli njihove proliferacije Biotehnologija je učinila mogućim identifikaciju i lokalizaciju genetskih faktora odgovornih za rezistenciju na fage i eksploatisanje tih faktora transferom putem konjugacije u veliki broj komercijalno primenjivih kultura Identifikovani ADM, strana 193 Bacteriophage resistance, the impact of biotechnology on the dairy industry, strana 630

31 INDUSTRIJSKA APLIKACIJA BMK
Lactococcus spp. (mleko) Lactobacillus spp. (mleko, meso, povrće, žitarice) Leuconostoc spp. (povrće, mleko) Pediococcus spp. (povrće, meso) Oenococcus oeni (vino) Streptococcus thermophilus (mleko) Probiotski efekat, proizvodnja industrijskih hemikalija i bioloških produkata – biopolimeri, enzimi, etanol i mlečna kiselina; oralni nosači za digestivne enzime i antigene u sastavu vakcina Determinacija sekvenci genoma reprezentativne kolekcije BMK Prvi kompletni genom – L. lactis subsp. lactis IL403

32 Lactococcus spp. Prethodna Lancefield grupa N streptokoka
Lc. garviae, Lc. piscium, Lc. plantarum, Lc. raffinolactis i Lc. lactis Lc. lactis – 2 subvrste i 1 biovar – Lc. lactis subsp. lactis; Lc. lactis subsp. cremoris; Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Habitat – zelene biljke; prirodni izvor za Lc. lactis subsp. cremoris nije potvrđen Fosfoenolpiruvat- fosfotransferaza sistem (PEP-PTS) – omogućava uspešno preuzimanje i fermentaciju La – prepoznatljiv habitat danas za većinu laktokoka čine proizvodi od mleka

33 Lactococcus spp. cont.‘ Homofermentativni, mikroaerofilni, Gram pozitivni, rast pri 10oC, ali ne i pri 45oC, produkuju L (+) mlečnu kiselinu Morfologija: ovoidne ćelije, pojedinačno, u parovima ili lancima – nemoguće razlikovati od Leuconostoc, Streptococcus i Enterococcus spp. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis – posjeduje citrat permeazu – mogućnost iskorištavanja citrata i produkcije diacetila – svojstvo kodirano genima lociranim na plazmidu – nestabilna karakteristika – varijetet Lc. lactis subsp. lactis

34 Lactococcus spp. cont.‘

35 Lactococcus spp. cont.‘

36 Lactococcus spp. cont.‘

37 Lactococcus spp. cont.‘ Važna biotehnološka svojstva – katabolizam La, produkcija proteinaza i rezistencija na bakteriofage, ali i druge karakteristike – metabolizam saharoze, galaktoze, manoze, glukoze, utilizacija citrata, DNA restrikcija i modifikacija, produkcija bakteriocina, rezistencija na anorganske ione – kodirana genima lokalizovanim na plazmidima Spontani gubitak plazmida – učestale kultivacije u mleku ili promene uslova kultivacije - genetski nestabilne karakteristike Veoma zahtevni po pitanju hranjivih materija – proteini, peptidi, specifične AK, derivati nukleinskih kiselina, vit

38 Lactococcus spp. cont.‘ [proteolitička aktivnost]
Koncentracija izoleucina, leucina, valina, histidina, metionina <1mg/L – 2% konačne gustine ćelija – zavisne od vlastititog proteolitičkog sistema Proteinaze ćelijskog zida, ekstracelularne peptidaze, Opp transportni sistem, transportni sistem za peptide (di- i tripeptide) i AK i intracelularne peptidaze Ključni enzim – proteinaze (PI ili PIII tip proteinaza – PrtP) raskidanje više od 40% peptidnih veza u više od 100 različitih oligopeptida Divlji sojevi laktokoka →1-4 AK za rast; veća aktivnost konvertaza AK

39 Lactococcus spp. cont.‘ [glikolitička aktivnost]
Lac plazmid – geni koji kodiraju katabolizam La – simultani katabolizam GLU i GAL LA se preuzima putem fosfoenol piruvat (PEP) zavisnog fosfotransferaza sistema (PEP-PTS) GAL se katabolizuje putem TAGATOZA puta simultano tokom katabolizma GLU u okviru Embden-Mayerhof-ovog ciklusa

40 Lactococcus spp. cont.‘ [metabolizam citrata]
Ključni enzim CitP – metaboliziranje citrata do aromogenih komponenti: diacetil, acetoin, 2,3 butandiol, octena kiselina i CO2 Bakteriocini laktokoka – mali termostabilni proteini sa inhibitornom aktivnošću ka blisko srodnim bakterijama NIZIN – komercijalna upotreba, širi antimikrobni spektar, uključujući i L. monocytogenes; lantibiotik 1988. US FDA – odobrena upotreba nizina u prevenciji kasnog nadimanja sira uzrokovanog klostridijama

41 Lactobacillus spp. Gram pozitivni, nesporogeni štapići ili kokobacili
Striktno fermentativni, aerotolerantni ili anaerobni, acidofilni, kompleksni hranidbeni zahtevi (UH, AK, peptidi, esteri MK, soli, derivati nukleinskih kiselina, vitamini) Homofermentativni (>85% mlečna kiselina) ili heterofermentativni (mlečna kiselina, ugljen dioksid, etanol, i/ili octena kiselina u ekvimolarnim količinama)

42 Lactobacillus spp. Beijerinck, 1901.
Orla-Jensen, – Thermobacterium, Streptobacterium, Betabacterium Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology (Kandler and Weiss, 1986) (phenotype- based nomenclatura) Obligatno homofermentativni Fakultativno heterofermentativni Obligatno heterofermentativni (phylogeny-based nomenclatura) Lactobacillus delbrueckii grupa Lactobacillus casei/Pediococcus grupa Leuconostoc grupa

43 Lactobacillus spp. 16S rRNA sekvenca gena – diverzitet roda
2005. godine→12 novih vrsta ( Taksonomske promene kontinuirano traju 44 vrste i 11 subvrsta u 1986. 88 vrsta i 15 subvrsta u 2003. 125 vrsta i 27 subvrsta u decembru 2005. 152 vrste u oktobru 2012. Primena molekularnih metoda – genus- i species specifični prajmeri – genomi nekoliko laktobacila u potpunosti sekvencionisani: Lactobacillus acidophilus NCFM; Lactobacillus brevis ATCC367; Lactobacillus gasseri ATCC3323; Lactobacillus johnsonii NCC533; Lb. plantarum WCFS1

44 Lactobacillus spp. - fenotipska karakterizacija

45 Filogenetske analize – 16s rRNK

46 Streptococcus thermophilus, Leuconostoc spp.
Genetički sličan Streptococcus salivarius Razlikovanje od ostalih streptokoka i laktokoka – rezistencija na visoke temperature, sposobnost rasta pri 52oC, fermentacija ograničenog broja UH; proteolitički malo aktivan, iako poseduje brojne proteolitičke enzime Leuc. mesenteroides subsp. cremoris i Leuc. lactis Mezofilne heterofermentativne koke Zahtevaju vit B grupe za rast Metabolizuju citrat; u kombinaciji sa laktokokama u procesima kada je poželjna produkcija diacetila i CO2

47 Enterococcus spp. Lancefield-ova grupa D (fekalne) streptokoke
Revizija roda Schleifer i Killper-Balz; gram pozitivne koke, u parovima, katalaza negativne, homofermentativni metabolizam; L+ izomer mlečne kiseline Pro et Contra: indikatori fekalne kontaminacije; sirevi mediteranskog područja – prisutni u značajnom broju; probiotici kod ljudi i životinja – E. faecium SF68, E. faecium PR88; “rasejavači “ gena rezistencije

48 Zastupljenost enterokoka u sirevima
CFU/g

49 Bifidobacterium spp. Familija Actinomycetaceae; enzim fruktoza 6-fosfat fosfoketolaza; visok G+C sadržaj u DNA (55-57 mol%) – filogenetski pripadaju actinomyces subdiviziji Gram pozitivnih MO Taksonomija i nomenklatura u razvoju- polifazni pristup u diferenciranju vrsta Prirodni habitat – intestinalni trakt ljudi i životinja B. bifidum, B. longum i B. animalis Probiotici Bifidobacterium BB-12® (BB-12®)

50 GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA
TRADICIONALNE STRATEGIJE GENETIČKOG POBOLJŠANJA MUTACIJA I SELEKCIJA METODE PRIRODNOG TRANSFERA GENA TRANSDUKCIJA, KONJUGACIJA, TRANSFORMACIJA, ELEKTROPORACIJA GENETSKI INŽENJERING TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK

51 GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA
ELIMINACIJA NEPOŽELJNIH SVOJSTAVA “GENE DISRUPTION”

52 GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA - PRIMERI

53 GENETIČKO POBOLJŠANJE STARTERA - PRIMERI
NA FAGE REZISTENTNI TRANSKONJUGATI – VISOKO EFIKASNI U SITUACIJAMA “PHAGE CRISIS” 60 kb konjugativni plazmid pMRC01 – kodira genetičke determinante za lacticin 3147 (BMK, Staphylococcus, Clostridium, Listeria) Ekspresija Bacillus subtilis proteaze – Lactococcus spp. Cheddar sir mutant soj laktokokoka – termoinducibilni profag – indukcija faga sa lizom startera i oslobađanje intracelularnih enzima Metabolički inžinjering – Lac- derivati Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus; ekspresija gena odgovornih za produkciju egzopolisaharida u sojeve laktokoka; izmenjeni metabolički fluks u cilju povećane produkcije diacetila Genetičke delecije u cilju poboljšanja probiotskih svojstava – delecija D-laktat dehidrogenaze (ldhL) gena kod L. johnsoni

54 KEFIR IRINA SAKHAROVA i BEK-MIRZA BACHOROV NIKOLAJ BALANDOV
109 laktokoka, Leuconostoc spp., termofilnih laktobacila, kvasaca, bakterija sirćetne kiseline; od filame ntoznih plesni Geotrichum candidum IRINA SAKHAROVA i BEK-MIRZA BACHOROV NIKOLAJ BALANDOV