17 Ιανουαρίου 2018 Όγδοη σειρά ασκήσεων.

Παρουσίαση με θέμα: "17 Ιανουαρίου 2018 Όγδοη σειρά ασκήσεων."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 17 Ιανουαρίου 2018 Όγδοη σειρά ασκήσεων

2 M – Z – X – W – C W – C – N – A – L A – L – B – R – U
1) Στην E. coli τέσσερα Hfr στελέχη δίνουν τους εξής μάρτυρες κατά σειρά: Στέλεχος 1 M Z X W C Στέλεχος 2 L A N C W Στέλεχος 3 A L B R U Στέλεχος 4 Z M U R B Όλα τα προαναφερόμενα Hfr στελέχη προέρχονται από το ίδιο F+ . Ποια η σειρά των μαρτύρων αυτών στο κυκλικό χρωμόσωμα του γνήσιου F+ στελέχους ; M – Z – X – W – C W – C – N – A – L A – L – B – R – U B – R – U – Μ – Ζ

3 2). Διασταυρώνουμε 2 στελέχη της E
2) Διασταυρώνουμε 2 στελέχη της E. coli: Hfr arg+ bio+ leu+ x F- arg- bio- leu- . Μελέτες διακοπτόμενης σύζευξης δείχνουν πως η arg+ εισέρχεται τελευταία στον δέκτη επομένως τα ανασυνδυασμένα arg+ επιλέγονται σε μέσο που διαθέτει bio και leu. Τα συγκεκριμένα ελέγχονται για την παρουσία bio+ leu+ δίδοντας τα εξής αποτελέσματα: arg+ bio+ leu+ 320 arg+ bio+ leu- 008 arg+ bio- leu+ 000 arg+ bio- leu- 048 α) Ποια η σειρά των γονιδίων; β) Ποιες οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους;

4

5

6 arg+ bio+ leu+ 320 arg+ bio+ leu- 008 arg+ bio- leu+ 000 arg+ bio- leu- 048 arg+ bio- leu+ είναι τα πιο σπάνια (δεν παρατηρήθηκε κανένα) οπότε είναι λογικό να υποθέσουμε πως είναι αυτά για την δημιουργία των οποίων απαιτούνται 4 επιχιασμοί. Για να συμβαίνει αυτό πρέπει η σειρά να είναι arg – bio – leu. RF(arg-bio) = 48 / 376 = RF(bio-leu) = 8 / 376 =

7 3) Συγκεκριμένο Hfr στέλεχος μεταδίδει τον μάρτυρα pro+ τελευταίο σε πειράματα σύζευξης. Διασταυρώνοντας το συγκεκριμένο στέλεχος με κάποιο F- κάποια pro+ ανασυνδυασμένα βακτήρια παρατηρούνται στα αρχικά στάδια της σύζευξης. Όταν αυτά τα τελευταία βακτήρια αναμειχθούν με F- κύτταρα τότε η πλειοψηφία των F- βακτηρίων μετατρέπονται σε pro+ που φέρουν τον παράγοντα F. Να εξηγηθούν τα αποτελέσματα. H καλύτερη εξήγηση είναι πως ο παράγοντας F που ήταν ενσωματωμένος στο στέλεχος Hfr αποκολλήθηκε από το βακτηριακό χρωμόσωμα και πλέον έχει μετατραπεί σε παράγοντα F´ που περιέχει το αλληλόμορφο pro+ του αντίστοιχου τόπου. Αυτός ο F´ παράγοντας μεταφέρεται ταχύτατα σε F– κύτταρα μετατρέποντάς τα σε pro+ (και φυσικά σε F+).

8 4) Ένας φάγος γενικευμένου μετασχηματισμού χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό ενός στελέχους – δέκτη E. coli a- b- c- d- e- από δότη a+ b+ c+ d+ e+ .Τα βακτήρια που προκύπτουν απλώνονται σε διάφορα θρεπτικά μέσα όπως φαίνεται παρακάτω. Τι μπορείτε να συμπεράνετε για την σύνδεση και σειρά των γονιδίων; Ουσίες που προστέθηκαν Παρουσία (+) ή σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο απουσία (-) αποκιών CDE - BDE - BCE + BCD + ADE - ACE - ACD - ABE - ABD + ABC - a+ d+ a+ e+ c+ e+ d – a – e – c

9 5) Σε πειράματα γενικευμένου μετασχηματισμού φάγοι συλλέγονται από στέλεχος – δότη E. coli γονοτύπου cys+ leu+ thr+ και χρησιμοποιούνται για τον μετασχηματισμό δέκτη με γονότυπο cys- leu- thr- . Αρχικά λοιπόν ο πληθυσμός των δεκτών απλώνεται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο εφοδιασμένο με λευκίνη και θρεονίνη. Παρατηρούμε την ύπαρξη αρκετών αποκιών. Α) Ποιοι οι πιθανοί γονότυποι των αποικιών αυτών; Β) Αντίγραφα αυτών των αποικιών μεταφέρονται σε 3 διαφορετικά θρεπτικά μέσα 1) ελάχιστο + μόνο θρεονίνη 2) ελάχιστο + μόνο λευκίνη 3) ελάχιστο Ποιοι γονότυποι θα μπορούσαν να μεγαλώσουν σε καθένα από αυτά; Γ) Παρατηρήθηκε πως 56% των αρχικών αποικιών μεγαλώνουν στο μέσο 1 του ερωτήματος (Β), 5% στο μέσο 2 ενώ καμιά στο μέσο 3. Με αυτό το δεδομένο ποιοι είναι οι γονότυποι των αποικιών στα μέσα 1, 2 και 3 ; Δ) Σχεδιάστε ένα χάρτη των 3 αυτών τόπων

10 A. cys+ leu+/- thr+/- B.1. cys+ leu+ thr+/- 2. cys+ leu+/- thr+ 3. cys+ leu+ thr+ Γ. Εφόσον καμιά δεν μεγαλώνει στο μέσο 3 (ελάχιστο) δεν υπάρχει και ο αντίστοιχος γονότυπος. Άρα οι αποικίες που μεγαλώνουν στα μέσα 1 και 2 είναι αντίστοιχα 1. cys+ leu+ thr- και 2. cys+ leu- thr+ 56% 5% Τι είναι τα υπόλοιπα 100 – 56 – 5 = 39 % cys+ leu- thr- Δ. Η cys μετάγεται μαζί με την leu σε ποσοστό 56% ενώ μαζί με την thr μόνο σε ποσοστό 5%. Αυτό σημαίνει πως η cys είναι πιο κοντά στη leu ενώ η thr είναι πιο απομακρυσμένη. Τέλος επειδή δεν παρατηρείται ταυτόχρονη μεταγωγή και των 3 τόπων υποχρεωτικά η cys βρίσκεται ανάμεσα από τις leu και thr.

11 6) Σε πειράματα λειτουργικής συμπληρωματικότητας τόσο σε προκαρυωτικούς όσο και και ευκαρυωτικούς οργανισμούς η πρωτοτροφία είναι συχνά ο φαινότυπος που επιλέγουμε για να ταυτοποιήσουμε την παρουσία μετασχηματισμένων κυττάρων. Πρωτότροφο κύτταρο χρησιμοποιείται σαν δότης γενετικού υλικού το οποίο εκχυλίζεται και χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό αυξότροφης καλλιέργειας ληπτών. Μετασχηματισμένα στελέχη αποκαλύπονται όταν τα κύτταρα λήπτες απλώνονται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο και αναζητούνται αποικίες ικανές να μεγαλώνουν σε αυτό. Ποιος πειραματικός σχεδιασμός θα σας επέτρεπε να βεβαιωθείτε πως μια τέτοια αποικία λήπτη που μεγαλώνει σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο δεν είναι στην πραγματικότητα α) Ένα πρωτότροφο κύτταρο που «μόλυνε» την αποικία των ληπτών; β) Μια αναστροφή της αυξότροφης μεταλλαγής; α) Για να είμαστε σίγουροι πως δεν πρόκειται να έχουμε μόλυνση από κάποιο πρωτότροφο κύτταρο, η πρωτότροφη σειρά από όπου παίρνουμε τον δότη πρέπει να είναι ευαίσθητη σε κάποιο αντιβιωτικό για το οποίο οι λήπτες εμφανίζονται ανθεκτικοί. Έτσι στο ελάχιστο θρεπτικό μέσο με την βοήθεια του αντίστοιχου αντιβιωτικού θα είναι αδύνατη η ανάπτυξη πρωτότροφων στελεχών. β) Η αυξότροφη μεταλλαγή που θα χρησιμοποιούμε θα φροντίζουμε να μην έχει δυνατότητα αναστροφής πχ να οφείλεται σε κάποια έλλειψη.

12 8) Υποθέστε πως έχετε στην διάθεσή σας ένα στέλεχος δροσόφιλας από το οποίο μπορείτε να πάρετε αρσενικά ή (παρθένα) θηλυκά οποιαδήποτε στιγμή. Το στέλεχος είναι ομόζυγο για το δεύτερο χρωμόσωμα το οποίο φέρει μια περικεντρική αναστροφή που λειτουργεί ως καταστολέας του επιχιασμού. Μέσα στην αναστροφή υπάρχουν ο γενετικός τόπος Curly(Cy,+) ο οποίος ευθύνεται για άτομα με φτερά ανεστραμμένα προς τα πάνω και ο τόπος purple(pr,+) που δίνει μύγες με σκούρο χρώμα ματιών. (Οι δυο τόποι βρίσκονται εκατέρωθεν του κεντρομεριδίου). Το στέλεχός μας έχει τόσο ανεστραμμένα προς τα πάνω φτερά όσο και σκούρο χρώμα ματιών. Θέλετε να απομονώσετε θνησιγόνες μεταλλαγές που να αφορούν γενετικούς τόπους του δεύτερου χρωμοσώματος και για τον σκοπό αυτό ακτινοβολείτε αρσενικά αγρίου τύπου. Πώς θα προχωρούσατε στην συνέχεια;

13 Διασταυρώνω κάθε ένα ακτινοβολημένο αρσενικό ΧΩΡΙΣΤΑ με μερικά θηλυκά του στελέχους.
Cy pr / Cy pr X *1 / + + *2 Κάθε αρσενικό έχει υποστεί διαφορετικές μεταλλαγές από την ακτινοβολία. Έτσι μπορώ να αποκτήσω σειρές που φέρουν συγκεκριμένες μεταλλαγές η καθεμία εκμεταλλευόμενος και το γεγονός πως τα υβρίδια θα είναι ετερόζυγα για την αναστροφή άρα δεν θα δίνουν ανασυνδυασμένους απογόνους. 2) Διασταυρώνω τα ετερόζυγα θηλυκά που προκύπτουν με αρσενικά [Cy pr]. Cy pr / + + * X Cy pr / Cy pr 3) Από την διασταύρωση επιλέγω [Cy] αρσενικά και θηλυκά που σημαίνει πως είναι ετερόζυγα για την μεταλλαγή και τα διασταυρώνω μεταξύ τους. Αν παίρνω αγρίου τύπου απογόνους σημαίνει πως η μεταλλαγή δεν είναι θνησιγόνος διαφορετικά είναι. Cy pr / + + *1 X Cy pr / + + *1 Cy pr / Cy pr [Cy pr] ¼ Cy pr / + + *1 [Cy] ½ + + *1 / + + *1 [+ +] ¼ (αν επιζούν)

14 H rW μπορεί να είναι μια διπλή μεταλλαγή στους τόπους Α και Β.
H rW μπορεί να είναι μια έλλειψη που καλύπτει μέρος ή ολόκληρα τα rZ και rD. Μεταλλαγές που χαρτογραφούνται ανάμεσα στα rZ και rD θα δίνουν ανασυνδυαμένους απογόνους αγρίου τύπου όντας ετερόζυγες με την rW αν ισχύει το πρώτο. Κάτι τέτοιο όμως είναι αδύνατο αν ισχύει το δεύτερο.

15 10) α) Με δεδομένο πως σε ένα γενετικό τόπο μπορούν να συμβούν πολλές μεταλλαγές, πως θα μπορούσατε να ταυτοποιήσετε αυτές που οφείλονται σε ελλείψεις; β) Ένας γενετικός χάρτης με ελλείψεις του γενετικού τόπου nadB φαίνεται στο σχήμα. Οι μαύρες έντονες γραμμές αναπαραστούν την περιοχή που λείπει σε κάθε έλλειψη.

16 Για να εντοπιστεί η ακριβής θέση αρκετών μεταλλαγών του συγκεκριμένου τόπου, οι τελευταίες χαρτογραφούνται σε σχέση με τις ελλείψεις με τα αποτελέσματα που φαίνονται στον πίνακα ( + σημαίνει ύπαρξη ανασυνδυασμένων απογόνων αγρίου τύπου, ενώ με – σημειώνεται η απουσία τους). Με βάση αυτά τα δεδομένα να φτιάξετε τον χάρτη της περιοχής. nad+ nad-171 nad-172 nad-173 nad-174 nad-118 Δnad-103 + - Δnad-105 Δnad-107 Δnad-108 Δnad-109 Δnad-110 Δnad-111 Δnad-112 Δnad-126

17 Οι μεταλλαγές που οφείλονται σε ελλείψεις συνήθως δεν αναστρέφονται.
Αδυναμία να υπάρξουν απόγονοι αγρίου τύπου από ανασυνδυασμό με άλλες μεταλλαγές οι οποίες μεταξύ τους μπορούν να δώσουν ανασυνδυασμένους απογόνους αγρίου τύπου είναι ακόμα ισχυρότερη ένδειξη μιας μεταλλαγής που οφείλεται σε κάποια έλλειψη. 171 173 174 172

18 Cloning and sequencing

19 Injection of foreign DNA into an animal cell
Chapter 20 Opener

20 Formation of a recombinant DNA molecule
Figure 20-2

21 Inserting a gene into a recombinant DNA plasmid
Figure 20-3

22 How amplification works
Figure 20-4

23 A plasmid vector, pUC18 Figure 20-5

24 Cloning in phage  Figure 20-6

25 Structure of a BAC vector
Figure 20-7

26 Modes of delivering recombinant DNA into bacterial cells
Figure 20-8

27 Finding the clone of interest by using DNA or RNA probes
Figure 20-9

28 Finding the clone of interest by using antibody
Figure 20-10

29 Finding the clone of interest by using antibody
Figure part 1

30 Finding the clone of interest by using antibody
Figure part 2

31 Gel electrophoresis Figure 20-11

32 Finding specific nucleic acids by using gel electrophoresis and blotting
Figure 20-12

33 Finding specific nucleic acids by using gel electrophoresis and blotting
Figure part 1

34 Finding specific nucleic acids by using gel electrophoresis and blotting
Figure part 2

35 Chromosome walking Figure 20-13

36 Polymerase chain reaction
Figure 20-14

37 The structure of 2’,3’-dideoxynucleotides
Figure 20-15

38 The dideoxy sequencing method
Figure 20-16a

39 The dideoxy sequencing method
Figure 20-16b

40 The dideoxy sequencing method
Figure 20-16c

41 Reading the DNA sequence from an automatic sequencer
Figure 20-17

42 Next-gen sequencing: shotgun library preparation

43 emPCR Emulsion PCR is a method of clonal amplification which allows for millions of unique PCRs to be performed at once through the generation of micro-reactors.

44 Pyrosequencing

45 Massively Parallel Sequencing

46 454: Data Processing Raw Image Files SFF File T Base Flow A Base Flow
C Base Flow G Base Flow Raw Image Files Image Processing Base- calling Quality Filtering SFF File

47 454 Platform Updates GS20 GS-FLX GS-FLX Titanium GS-FLX Titanium Plus
GS Junior 100bp reads, ~20Mbp / run 250bp reads ~100 Mbp / run (7.5 hrs) 400bp reads ~400 Mbp / run (10 hrs) 700 bp reads ~700 Mbp/run (18 hrs) 400 bp reads ~ 35Mbp/run (10 hrs)

48 Ion Torrent - PGM/Proton
The Ion Torrent System 6 instruments available in Uppsala, early access users Two instruments: PGM and Proton For small scale (PGM) and large scale sequencing (Proton) Rapid sequencing (run time ~ 2-4 hours) Measures changes in pH Sequencing on a chip Personal Genome Machine (PGM) Ion Proton 48

49 Ion Torrent output Ion Torrent throughput
~ from 10Mb to >10Gb, depending on the chip Read lengths: 400bp (PGM), 200bp (Proton) Output file format: FASTQ What can we use Ion Torrent for? Anything, except perhaps very large genomes 314 (PGM) 316 (PGM) 318 (PGM) PI (Proton) 2 human exomes (PI chip) 2 human transcriptomes 1 human genome = 6 PI chips NEW! P2 (Proton) 49

50 Ion Torrent Ion Semiconductor Sequencing
Detection of hydrogen ions during the polymerization DNA Sequencing occurs in microwells with ion sensors No modified nucleotides No optics

51 Ion Torrent dNTP H+ Sensing Layer Sensor Plate Silicon Substrate
DNA  Ions  Sequence Nucleotides flow sequentially over Ion semiconductor chip One sensor per well per sequencing reaction Direct detection of natural DNA extension Millions of sequencing reactions per chip Fast cycle time, real time detection H+ ∆ pH ∆ Q Sensing Layer Sensor Plate ∆ V Bulk Drain Silicon Substrate Source To column receiver

52 Ion Torrent: System Updates
314 Chip 316 Chip 318 Chip P1 Chip 100bp reads ~10 Mb/run (1.5 hrs) 100 bp reads ~100 Mbp / run (2 hrs) 200 bp reads ~200 Mbp/run (3 hrs) 200 bp reads ~1 Gbp / run (4.5 hrs) 100 bp reads ~8 Gbp/run

53 Ion Torrent Reads *.sff (standard flowgram format)
*.fastq (sequence and corresponding quality score encoded with an ASCII character, phred- like quality score + 33)

54 Illumina Sequencing Technology
Robust Reversible Terminator Chemistry Foundation 3’ 5’ DNA ( ug) A G T G C T A C G A T A C C C G A T C A T C G A T C G Sample preparation T C G Cluster growth A 5’ Sequencing T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T G C T A C G A T … Base calling Image acquisition

55

56 Platform Updates Maximum yield / day 50,Gbp ~16x the human genome
Solexa 1G Illumina GA Illumina GAII Illumina GAIIx Illumina HiSeq Illumina HiSeq, v3 SBS Illumina HiSeq (Rapid) MiSeq 18bp reads, ~1Gbp / run 36bp reads ~3Gbp / run 75bp paired ends ~10Gbp / run (8 days) 75bp paired end reads ~40Gbp / run (8 days) 100 bp paired end reads ~200 Gbp/ run (10 days) 100bp paired end reads ~600Gbp / run (12 days) 150 bp paired end reads ~ 180 Gbp/ run (2 days) 250 bp paired end reads ~8 Gb/run (2 days) Maximum yield / day 50,Gbp ~16x the human genome

57 Illumina Sequencing Output
*.fastq (sequence and corresponding quality score encoded with an ASCII character, phred- like quality score + 33)

58 Oxford Nanopore – new view on sequencing
Hemolysin – pore - inner diameter of 1nm, about 100,000 times smaller than that of a human hair.

59 Oxford Nanopore DNA sequencing
Error rate 4%, prediction for end of the year 0.1 – 2%.

60 Nanopore array

61 Oxford Nanopore – new concepts
MinION - 150Mb per run - Tested 48kb read length $900 per instrument 500 pores per device GridION - XXXMb per run - Tested 48kb read length $XXX per instrument 2000 pores per device, soon 8000 pores Cost per human genome $1500.

62 PacBio sequencing

63 2nd vs. 3rd Gen Approach Short reads Long reads
Amplification errors and bias No required amplification Several enzymatic steps Simple sample prep Single molecule raw accuracy Multi-molecule raw accuracy Errors tend to be random (vs. systematic) Errors tend to be systematic More coverage • Less coverage required required Single molecule raw accuracy vs. multi-molecule raw accuracy True goal is achieving finished accuracy with less coverage 22

64 High Performance Single-Molecule Microscopy
Movie PacBio® RS II four-camera detection system Light Source Trace file Primary Analysis Pipeline AACGTAA….TTAGGCCAT Fasta files

65 Genome editing

66 A. Viral gene therapy B. RNAi therapy

67 Despite promise and recent success, gene therapy and RNAi have limitations that preclude their utility for a large number of diseases. Viral gene therapy may cause mutagenesis at the insertion site and result in dysregulated transgene expression. Meanwhile, the use of RNAi is limited to targets for which gene knockdown is beneficial. Also, RNAi often cannot fully repress gene expression and is therefore unlikely to provide a benefit for diseases in which complete ablation of gene function is necessary for therapy. RNAi may also have poor specificity, posing potential safety concerns and sometimes decreasing the effectiveness of treatment.

68 Genome Editing Technologies
Programmable nucleases enable precise genome editing by introducing DNA double- strand breaks (DSBs) at specific genomic loci. DSBs subsequently recruit endogenous repair machinery for either non-homologous end-joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) to the DSB site to mediate genome editing. Four major classes of nucleases - meganucleases and their derivatives, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator–like effector nucleases (TALENs) and CRISPR-associated nuclease Cas9 . These nuclease systems can be broadly classified into two categories based on their mode of DNA recognition: ZFNs, TALENs and meganucleases achieve specific DNA binding via protein- DNA interactions, whereas Cas9 is targeted to specific DNA sequences by a short RNA guide molecule that base-pairs directly with the target DNA and by protein-DNA interactions.

69

70 1. 2. Meganucleases are endoeoxyribinucleases that have a large recognition site, which occurs rarely in entire genome. Consequently, they can be used as highly specific tools in genome engineering to either modify or eliminate a particular gene. Eg. I-Sce-I 3. 4.

71

72

73