Πρωτεομική: Ολιστική ανάλυση πρωτεϊνών των οποίων τα ολικά επίπεδα και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που φέρουν μεταβάλλονται.

Παρουσίαση με θέμα: "Πρωτεομική: Ολιστική ανάλυση πρωτεϊνών των οποίων τα ολικά επίπεδα και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που φέρουν μεταβάλλονται."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Πρωτεομική: Ολιστική ανάλυση πρωτεϊνών των οποίων τα ολικά επίπεδα και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που φέρουν μεταβάλλονται

2 ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΣΤΗΝ ΠΛΕΙΟΨΗΦΙΑ ΤΟΥΣ ΟΛΕΣ ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΔΕΔΟΜΕΝΗ ΣΤΙΓΜΗ ΥΦΙΣΤΑΝΤΑΙ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΑΛΛΑ ΜΟΡΙΑ ΑΛΛΑΓΗ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥΣ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ : ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΕΞΩΓΕΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ (ΤΟΞΙΚΟΙ) ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΣΤΟΧΟΙ: ΜΕΛΕΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΝΕΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΣΤΟΧΩΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ! ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΕ ΜΕΓΑΛΗ ΚΛΙΜΑΚΑ-ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗ Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

3 Detection of protein changes Protein Identification
Protein Sample preparation (cell disruption, protein extraction, fractionation) 2-D Electrophoresis Isoelectric focusing on IPG strips, SDS-PAGE Detection of protein changes (comparison of protein levels) Protein Identification (analysis of post translational modifications) Coomasie-stained gel Electrotransfer to PVDF membrane In-gel digestion Hydrolysis N-terminal sequencing Mass spectrometry (MALDI-MS electrospray) Amino acid analysis SEARCH IN DATA BASES

4

5

6

7

8 Προετοιμασία πρωτεϊνικού δείγματος
ΔΙΑΛΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΟΥΡΙΑ Ή CHAPS (ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ) ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ  ???? ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΥΔΡΟΦΟΒΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ < 10kDa ή > 80kDa pI < 4 ή >10 ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Η’ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

9 ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ

10 Isoelectric focusing on IPG strips, SDS-PAGE
2-D Electrophoresis Isoelectric focusing on IPG strips, SDS-PAGE 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΒΑΣΕΙ ΦΟΡΤΙΟΥ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΒΑΣΕΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

11 ΚΛΙΣΗ pH : ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΦΟΡΕΩΝ ΑΜΦΟΛΥΤΩΝ – ΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΜΙΚΡΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΕΔΙΟΥ ΜΕΤΑΚΙΝΟΥΝΤΑΙ ΚΑΙ ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΔΙΩΝ {ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΦΟΡΕΩΝ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ} ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΚΛΙΣΕΩΝ [immobilized pH gradientIPG]. ΑΠΟ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ : immobilines. ΑΣΘΕΝΗ ΟΞΕΑ ‘Η ΒΑΣΕΙΣ ΠΟΛΥΜΕΡΙΣΜΕΝΑ ΜΕ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗ ΚΑΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΣΕ ΦΥΛΛΑ ΠΛΑΣΤΙΚΟΥ. {ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΜΟΝΟ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΒΑΣΕΙ ΤΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΠΟΥ ΦΕΡΟΥΝ} Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

12 ‘Ετσι καθίσταται δυνατή και η ταυτοποίηση πρωτεϊνών
IPG strips: ΔΙΑΘΕΣΙΜΕΣ ΣΤΟ ΕΜΠΟΡΙΟ ΣΕ ΜΕΓΑΛΑ Η’ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΑ ΕΥΡΗ pH. Φυλάσσονται στην κατάψυξη για μεγάλα χρονικά διαστήματα και μπορεί να φορτωθεί σε αυτές σχετικά μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνικού δείγματος. ‘Ετσι καθίσταται δυνατή και η ταυτοποίηση πρωτεϊνών Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

13 Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry:
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Mass spectrometry matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) N-terminal ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΑΣ-ΣΥΣΤΑΣΗΣ Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

14

15

16 ΤΑ ΣΤΙΓΜΑΤΑ (protein spots) ΑΦΑΙΡΟΥΝΤΑΙ ΑΥΤΟΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΑ ΠΗΚΤΩΜΑΤΑ ΔΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΚΟΛΟΥΘΕΙ ΠΕΨΗ ΜΕ ΤΡΥΨΙΝΗ. Η ΜΑΖΑ ΤΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΥΠΟΛΟΓΙΖΕΤΑΙ ΑΥΤΟΜΑΤΑ ΣΕ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟ ΟΡΓΑΝΟ (MALDI-TOF-MS) ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΝΕΤΑΙ ΜΕ ΤΙΣ ΘΕΩΡΗΤΙΚΕΣ ΤΙΜΕΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΚΑΙ ΚΑΤΑΓΕΓΡΑΜΜΕΝΩΝ ΣΕ ΒΑΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΟΙ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΕΚΤΕΛΟΥΝΤΑΙ ΜΕΣΩ ΕΙΔΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ ΟΠΟΤΕ ΤΕΛΙΚΑ ΑΠΕΙΚΟΝΙΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΠΙΝΑΚΑ ΤΑ ΣΤΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΑΝΑΛΥΘΕΙ, ΟΣΑ ΕΧΟΥΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΘΕΙ ΕΠΙTΥΧΩΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΜΠΙΣΤΟΣΥΝΗΣ / ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΗΤΑΣ. ΣΥΝΗΘΩΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΠΟΣΟΣΤΟ 60–80% ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΛΥΟΝΤΑΙ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ MALDI-TOF-MS Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

17 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΙΝΑΙ Η ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΧΙΛΙΑΔΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΗΜΕΡΗΣΙΩΣ ΜΕ ΕΛΑΧΙΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΤΗ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΟΥ ΧΕΙΡΙΣΤΗ. ΥΠΑΡΧΕΙ ΒΕΒΑΙΑ ΚΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΠΟΣΟΣΤΟ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΔΕΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΚΑΙ ΕΠΙΣΗΣ ΔΕΝ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗ ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ. Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

18 ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
genomics & proteomics : νέες μέθοδοι στην προσπάθεια ανακάλυψης νέων φαρμάκων και διαλεύκανσης βιοχημικών διεργασιών. genomics >>>proteomics : μεγαλύτερη ευαισθησία, συντομότερο χρονικό διάστημα ανάλυσης δειγμάτων, μεγαλύτερος όγκος πληροφοριών (π.χ. high density oligonucleotide arrays). proteomics : εντοπίζονται μεταβολές ολικών επιπέδων έκφρασης, μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, υπο-κυτταρική κατανομή υπό εξέταση μορίων. ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

19

20 ΔΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΔΙΑΛΥΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ, ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ, 1mg ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟΥ (ΚΥΤ/ΚΟ ΚΛΑΣΜΑ) 2-D gel analysis. pH 3–10 IPG strip & 9–16% (w/v) linear gradient polyacrylamide gel. Χρώση με Coomassie blue. Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

21 D: α1-antitrypsin many spots [διαφορετικές γλυκοζυλιωμένες μορφές]
2D-gel A, B: γ–enolase from rat brain is represented by one spot IEF pH range 3–10 vs. five spots  IEF pH 4–7 strip C: Dihydro-pyrimidinase-related protein 2  five spots [μικρότερες μορφές ίσως αποτέλεσμα αποικοδόμησης] D: α1-antitrypsin many spots [διαφορετικές γλυκοζυλιωμένες μορφές] E: glial fibrillary acidic protein  ~ 50 spots (MM : kDa)

22 2D-gel proteins from a control (A), and a patient with Alzheimer’s disease (B). Διαχωρισμός σε pH 3–10 IPG λωρίδες με επακόλουθη ηλεκτροφόρηση σε 9–16%(w/v) SDS-PAGE. Χρώση Coomassie blue. (GFAP) Fountoulakis M., Amino Acids (2001) 21: 363–381

23