ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ: Η ΑΝΑΣΤΟΛΗ.

Παρουσίαση με θέμα: "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ: Η ΑΝΑΣΤΟΛΗ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ: Η ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ ΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ποτστάρ Ολγα (Pochtar Olha) Βιολόγος (ΑΡΙΘΜΟΣ ΜΗΤΡΩΟΥ ) ΤΟΠΟΣ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ: Εργαστήριο Αναγεννητικής Ιατρικής & Αναπαραγωγικής Βιολογίας, Τομέας Υγείας Μητέρας- Παιδιού, Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών, ΓΝΑ «Αλεξάνδρα» Εξεταστική επιτροπή: Δημήτριος Λουτράδης, Καθηγητής Ιατρικής Σχολής,Τομέας Υγείας Μητέρας- Παιδιού, Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών, ΓΝΑ «Αλεξάνδρα», (Επιβλέπων) Βασιλική Αλεπόρου, Αναπληρώτρια καθηγήτρια, Τομές Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών Κωνσταντίνος Στεφανίδης, Λέκτορας, Εργαστήριο Αναγεννητικής Ιατρικής & Αναπαραγωγικής Βιολογίας, Τομέας Υγείας Μητέρας- Παιδιού, Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών, ΓΝΑ «Αλεξάνδρα», (Επιστημονικός Υπεύθυνος) ΑΘΗΝΑ 2009

2 Τι είναι τα βλαστικά κύτταρα
Ως βλαστικό κύτταρο ορίζεται κύτταρο το οποίο κατέχει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους Τα βλαστικά κύτταρα ανακαλύφθηκαν κατά τη διάρκεια πειραμάτων στο μυελό των οστών τη δεκαετία του Χάρη στα πειράματα αυτά επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων και η εξαιρετική τους ικανότητα να αναγεννούν μερικούς ιστούς, γεγονός το οποίο έχει ανοίξει νέους ορίζοντες στον τομέα της Ιατροβιολογικής Έρευνας. Έτσι, ως βλαστικό κύτταρο ορίστηκε το κύτταρο το οποίο μπορεί να ανανεώσει τον εαυτό του (ικανότητα αυτο-ανανέωσης) ή να παράγει εξειδικευμένους τύπους κυττάρων (ικανότητα διαφοροποίησης).

3 Τα βλαστικά κύτταρα στην ανάπτυξη των θηλαστικών
Ο ζυγώτης το απώτατο βλαστικό κύτταρο ολοδύναμο με την ικανότητα να παράγει όλους τους κυτταρικούς τύπους του είδους Η βλαστοκύστη αποτελείται από: τα κύτταρα του τροφοβλάστη τα κύτταρα της εσωτερικής στοιβάδας Στάδιο γαστριδίου αποτελείται από τρία βλαστικά δέρματα: εξώδερμα (νευρικός ιστός, δέρμα και όργανα συνδεόμενα με αυτήν, όπως οι τρίχες και τα νύχια) μεσόδερμα (συνδετικός ιστός, μυς, οστά, αίμα) ενδόδερμα (γαστρεντερικό σύστημα) Ξεχωριστή ομάδα αποτελούν τα: στελεχιαία κύτταρα (σπερματοζωάρια, ωάρια). Στον οργανισμό υπάρχουν πάρα πολλά είδη κυττάρων. Όλα αυτά τα κύτταρα, όπως καθετί ζωντανό, ακολουθούν ένα κύκλο ζωής: τη γέννηση, την ανάπτυξη, τη γήρανση και το θάνατο. Στα πρώτα στάδια ανάπτυξης, δηλαδή στη γέννησή τους, τα κύτταρα βρίσκονται υπό μορφή ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ.

4 Χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων
Βρίσκονται στην κορυφή της αναπτυξιακής ιεραρχίας (διαιρούνται προς όλα τα είδη κυττάρων στον αντίστοιχο ιστό) Κατέχουν τη δυνατότητα αυτο-ανανέωσης (παράγουν τελομεράση) Υποβάλλονται σε αυστηρή ρύθμιση του αριθμού τους (υπάρχει ισορροπία μεταξύ γέννησης και απώλειας κυττάρων) Υποβάλλονται σε ένα ευρύ φάσμα διαφοροποίησης (διαφοροποιούνται σε συγκεκριμένα ώριμα είδη κυττάρων ιστού προέλευσης) Διαθέτουν πλαστικότητα (σχηματίζουν εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους άλλων ιστών) Στην κορυφή της αναπτυξιακής ιεραρχίας (με παράδειγμα τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα) βρίσκεται το ολοδύναμο κύτταρο το οποίο αυτο-ανανεώνεται και διαιρείται προς όλα τα είδη αιμοποιητικών κυττάρων, μετατρέποντας με αυτόν τον τρόπο σε πολυδύναμα κύτταρα. Μετά τη διαίρεση παράγονται δύο θυγατρικά κύτταρα. Το ένα παραμένει βλαστικό κύτταρο (αυτο-ανανεωτικό) και το άλλο είναι πρόδρομο, το οποίο διαφοροποιείται σε εξειδικευμένα κύτταρα του αίματος Τελομεράση είναι ένζυμο που επιμηκύνει τα τελομερή και προστατεύει το κύτταρο από γονιδιο-τοξικές βλάβες και συσχετίζεται με κυτταρική αθανασία Τα SCs έχουν την ικανότητα να παραμένουν σε αδιαφοροποίητη κατάσταση κατά τη διάρκεια της ζωής του οργανισμού και να διαιρούνται όταν χρειάζεται. Σε κάθε ιστό τα SCs διαφοροποιούνται σε σχέση με τη φυσική δυνατότητα να αυτο-ανανεώνονται και να διαφοροποιούνται σε συγκεκριμένα ώριμα είδη κυττάρων Για παράδειγμα, μερικά πειράματα έδειξαν ότι τα βλαστικά κύτταρα του αίματος που απομονώθηκαν από ενήλικους ποντικούς, μπόρεσαν να παράξουν ηπατικά και μυϊκά κύτταρα

5 Το μικροπεριβάλλον των SCs
Παρέχει τους εξωτερικούς παράγοντες οι οποίοι ρυθμίζουν: τον αριθμό το πολλαπλασιασμό τη διαφοροποίηση Τα μόρια προσκόλλησης εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των SCs και του εξωκυττάριου χώρου. Τα ενδογενή εξωκυττάρια σήματα διεγείρουν διάφορους μεσοκυττάριους μηχανισμούς μεταγωγής σήματος, αυξάνουν ή μειώνουν τη μεσοκυττάρια επικοινωνία μέσω των χασμοσυνδέσμων. Ανάπτυξη, ανάπλαση πληγής, διαφοροποίηση ιστών, προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος και προσαρμοστικές αντιδράσεις ιστών λαμβάνουν χώρα όταν υπάρχει είτε θετική, είτε αρνητική ρύθμιση της λειτουργίας των χασμοσυνδέσμων. Στη βάση των αλλαγών στα βλαστικά κύτταρα είναι οι μοριακές αλλαγές. Πιθανόν υπάρχουν αλλαγές στην μεταγραφική ενεργητικότητα σημαντικών ενζύμων στα βλαστοκύτταρα, ενεργοποίηση ή αναστολή ειδικών ενζύμων, αλλαγές στην χρωματίνη, τροποποιήσεις ιστονών (ακετυλίωση και μεθυλίωση) ή μεθυλίωση του DNA. Όλες αυτές οι λειτουργίες σίγουρα βασίζονται στη συνδυασμένη λειτουργία συγκεκριμένων γονιδίων. Τα γονίδια αυτά μπορεί να ανήκουν στις εξής κατηγορίες: εκείνα που προσδίδουν στα βλαστικά κύτταρα τις ιδιότητές τους, όπως αυτο-ανανέωση και συγκράτηση πολλαπλασιαστικού δυναμικού και εκείνα τα οποία ορίζουν την κλίμακα διαφοροποίησής τους Πολλά ρυθμιστικά και αναπτυξιακά μόρια όπως τα μόρια hedgehog (hh), γλυκοπρωτεΐνες Wnts, βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας και πρωτεΐνες Notch συμμετέχουν στη μεταγωγή σημάτων σε ανάλογα μονοπάτια και παίζουν ρόλο στον έλεγχο της αυτο-ανανέωσης και στην ρύθμιση γενεαλογικής πορείας σε διάφορα συστήματα. Trosko, 2006

6 Αριθμός κυτταρικών τύπων
Ταξινόμηση των βλαστικών κυττάρων με βάση το πολλαπλασιαστικό δυναμικό τους Δυναμικό διαφοροποίησης Αριθμός κυτταρικών τύπων Παράδειγμα των SCs Κυτταρικοί τύποι μετά την διαφοροποίηση Ολοδύναμα (Totipotent ) Όλοι Ζυγώτης (γονιμοποιημένο ωάριο), βλαστομερίδιο Όλοι οι κυτταρικοί τύποι Πλειοδύναμα (Pluripotent) Όλοι εκτός κυττάρων εμβρυικών μεμβρανών Καλλιεργημένα hESc Κύτταρα και από τα τρία βλαστικά δέρματα Πολυδύναμα (Multipotent) Πολλοί Αιμοποιητικά κύτταρα Σκελετικός μυς, καρδιακός μυς, κύτταρα συκωτιού, όλα τα κύτταρα αίματος Ολιγοδύναμα (Oligopotent) Μερικοί Μυελοειδή πρόδρομα κύτταρα 5 τύποι των κυττάρων του αίματος (Μονοκύτταρα, μακροφάγα, ηωσινόφιλα, ουδετερόφιλα, ερυθροκύτταρα) Τετραδύναμα (Quadripotent) 4 Μεσεγχυματικά πρόδρομα κύτταρα Κύτταρα χόνδρου, κύτταρα λίπους, κύτταρα στρώματος, κύτταρα οστού Τριδύναμα (Tripotent) 3 πρόδρομα νευρογλοιακά περιορισμένα 2 τύποι των αστροκυττάρων, ολιγοδενδροκύτταρα Διδύναμα (Bipotent) 2 Δυδύναμα πρόδρομα από εμβρυικό συκώτι τρωκτικού B κύτταρα, μακροφάγα Μονοδύναμα (Unipotent) 1 Πρόδρομα των ιστιοκυττάρων Ιστιοκύτταρα Μηδενοδύναμα (Nullipotent) Κανένας Τελικώς διαφοροποιημένο κύτταρο, π.χ. ερυθροκύτταρο Δεν υπάρχει κυτταρική διαίρεση

7 Ταξινόμηση των βλαστοκυττάρων με βάση την πηγή προέλευσης
Εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (Embryonic Stem Cells), τα οποία αναπτύσσονται από τα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας του εμβρύου Σωματικά βλαστοκύτταρα (Adult Stem Cells), τα οποία προέρχονται από διαφορετικούς ιστούς του ενήλικου οργανισμού. Σ’ αυτή την ομάδα ανήκουν τα αιμοποιητικά, μεσεγχυματικά, νευρικά, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά βλαστοκύτταρα Βλαστικά κύτταρα του αμνιακού υγρού (Amniotic Fluid Stem Cells, AFSCs), τα οποία απομονώνονται από αμνιακό υγρό Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESCs) αναπτύσσονται από τα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας του εμβρύου πριν την εμφύτευση. Τα εμβρυϊκά κύτταρα της γεννητικής σειράς (EGCs) αναπτύσσονται από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα (PGCs) απομονωμένα από εμβρυϊκές γονάδες. Τα κύτταρα εμβρυϊκού καρκινώματος (ECCs) αναπτύσσονται από PGCs στις εμβρυϊκές γονάδες, αλλά συνήθως εντοπίζονται ως συστατικά ορχικών όγκων στον ενήλικα. Η χρήση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων περιορίζεται λόγω θεμάτων βιοηθικής, γι’ αυτό αναδύθηκε ανάγκη εύρεσης νέων πηγών βλαστικών κυττάρων για θεραπευτικές χρήσεις στην αναγεννητική ιατρική χωρίς ανάγκη καταστροφής εμβρύων. Αντίθετα από τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, τα σωματικά βρίσκονται ήδη σε κάποιο βαθμό εξειδικευμένα. Όμως, αυτo-ανανεώνονται και διαφοροποιούνται σε κάθε τύπο κυττάρων του ιστού προέλευσης Τα AFSCs αποτελούν το αντεικείμενο μελέτης αυτής της εργασίας.

8 Βλαστικά κύτταρα του αμνιακού υγρού
Η πρώτη απόδειξη ότι το ανθρώπινο αμνιακό υγρό περιέχει βλαστικά κύτταρα εμφανίστηκε το 2003 (Prusa et al., 2003). Είναι πολυδύναμα καθώς διαφοροποιούνται σε πολλούς τύπους κυττάρων των τριών βλαστικών στοιβάδων Εκφράζουν δείκτες όπως των εμβρυϊκών (Oct-4, SSEA-4 ) καθώς και των σωματικών βλαστικών κυττάρων (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105) Εκφράζουν το ένζυμο τελομεράση Δεν προκαλούν δημιουργία όγκων in vivo Δεν εγείρουν ηθικά διλήμματα όπως τα ESCs Το αμνιακό υγρό είναι γνωστό ότι είναι πλούσιο σε εμβρϊικά κύτταρα και για αυτό εδώ και περίπου 50 χρόνια χρησιμοποιείται για τη διάγνωση των εμβρυϊκών γενετικών ανωμαλιών. Οι νέες έρευνες προτείνουν ότι το αμνιακό υγρό μπορεί να αποτελέσει νέα πηγή των βλαστικών κυττάρων για θεραπευτικές χρήσεις στην αναγεννητική ιατρική χωρίς την ανάγκη καταστροφής των εμβρύων. Η σύγκριση τελομερών μεταξύ των AFSCs και των MSCs του μυελού των οστών απέδειξε ότι τα πρώτα έχουν μεγαλύτερα τελομερή από τα δεύτερα, γεγονός το οποίο πιθανώς αποδεικνύει τo μεγαλύτερo δυναμικό πολλαπλασιασμού τους (Sessarego et al., 2008). Εχει αποδειχθεί ότι τα AFSCs δεν εκφράζουν δείκτες ούτε των αιμοποιητικών κυττάρων όπως CD14, CD45, CD34, ούτε των ενδοθηλιακών όπως το CD31 (Sessarego et al., 2008), αλλά εκφράζουν HLA αντιγόνα τάξης Ι, δείκτες σωματικών βλαστικών κυττάρων όπως τα CD29(1 υποομάδα ιντεγρίνης) , CD44, CD73 (SH-3), CD90 (Thy-1), CD105 (SH-2, ενδογλίνη). Η έκφραση του Oct-4 στο 0,1-0,5% και του c-Kit (CD117) υποδοχέα (παράγοντα των βλαστικών κυττάρων) σε περίπου 1% όλων των κυττάρων του αμνιακού υγρού (de Coppi et al., 2007), υποστηρίζουν παρουσία AFSCs Απομονώνονται από αμνιακό υγρό που προέρχεται από την καθιερωμένη διαδικασία της αμνιοπαρακέντησης

9 Χρήσεις των βλαστικών κυττάρων
Μεταμοσχεύσεις Γονιδιακή θεραπεία Ανάπτυξη φαρμάκων Διερεύνηση μηχανισμών διαφοροποίησης Τα βλαστικά κύτταρα γενικά έχουν αρχίσει να μπαίνουν ενεργά στον αναπτυσσόμενο τομέα της Αναγεννησιακής Ιατρικής. Με τη χρησιμοποίησή τους μπορούμε να αναπαράγουμε ιστούς και να φτιάγνουμε νέα όργανα! Δεν είναι ακόμα τόσο εύκολο, αλλά πάρα πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο δουλεύουν προς αυτή την κατεύθυνση. Μεταμοσχεύσεις (για ανάπλάση ιστών και οργάνων) Γονιδιακή θεραπεία (θεραπεία γενετικών ασθενειών) Ανάπτυξη φαρμάκων (αναγνώριση δυνητικών εμβρυοτοξικών τερατογόνων) Διερεύνηση μηχανισμών διαφοροποίησης (μελέτη γεννητικών ανωμαλιών, βιολογίας του καρκίνου) Ανάπτυξη ανθρώπινων μοντέλων καλλιέργειας (για εξατομικευμένες θεραπείες καθώς και για ταίριασμα ασθενών με ιστοσυμβατούς δότες) Καταπολέμηση του καρκίνου (τροπισμός και ογκοκαταστολή) Ανάπτυξη ανθρώπινων μοντέλων καλλιέργειας Καταπολέμηση του καρκίνου

10 Χρήσεις των βλαστικών κυττάρων στη θεραπεία του καρκίνου
Η μεταμόσχευση των βλαστικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα: την ογκοκατασταλτική δράση στους ασθενείς με συμπαγείς όγκους τη μείωση των πολλαπλών μεταστάσεων. Τα τροποποιημένα MSCs παίζουν το ρόλο του οχήματος μεταφοράς (delivery vehicles) των αντικαρκινικών πρωτεϊνών (Studeny et al. 2002). Τα MSCs από ομφαλοπλακουντιακό αίμα παρουσιάζουν κυτταροτοξική δράση εναντίον καρκινικών κυττάρων του ανθρώπινου γλοιώματος (Kang et al. 2008). Η επίδραση του απομονωμένου μέσου από hMSCs αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Qiao et al., 2008).

11 Καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSCs): η ρίζα του καρκίνου
Τα καρκινικά βλαστικά δημιουργούν καρκινικά κύτταρα και σχηματίζουν τεράστιους κακοήθεις όγκους. Κάποια μικροσυναθρίσματα κυττάρων που περιέχουν CSCs μεταφέρονται διαμέσου αιματοαγγείων, εισβάλλουν σε άλλους ιστούς και δημιουργούν μεταστατικούς όγκους. Τα αντικαρκινικά φάρμακα και η ακτινοβολία προκαλούν το θάνατο των καρκινικών κυττάρων, αλλά τα CSCs μπορεί να επιβιώσουν κα να αναπαράγουν καρκίνο (Setoguchi et al., 2004). Setoguchi et al., 2004 Η θεωρία των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (cancer stem cell theory) υποστηρίζει ότι τα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα των ιστών του ενηλίκου. Μία πρώτη επαλήθευση αυτής της θεωρίας έγινε το 1997 (Bonett and Dick, 1997), όταν αποδείχθηκε ότι η μετάδοση την ΟΜΛ αποδείδεται σε ένα μικρό σύνολο κυττάρων - στα CSCs.

12 Καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSCs): η ρίζα του καρκίνου
Υπάρχουν σε πολύ μικρές ποσότητες Δυνατότητα για αυτο-ανανέωση Απεριόριστος πολλαπλασιασμός Διαφοροποίηση σε φαινοτυπικά ποικίλα ογκογόνα και μη καρκινικά κύτταρα Προκαλούν δημιουργία όγκων σε περίπτωση αλλομεταμόσχευσης Εκφράζουν δείκτες βλαστικών κυττάρων (CD133, ATP-binding cassette transporters, c-kit, Sca-1,Oct-4,Dazl) Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι εξαιρετικά σημαντικά επειδή φαίνεται ότι είναι υπεύθυνα για την επανεμφάνιση του όγκου μετά τη θεραπεία. Με βάση τη θεωρία των καρκινικών βλαστικών τα CSCs προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα των ιστών του ενηλίκου που σημαίνει ότι τα καρκινικά και τα βλαστικά κύτταρα μοιράζονται τους ίδιους μηχανισμούς μεταγωγής σημάτων. Ο σημερινός στόχος των επιστημόνων είναι να αποκωδικοποιηθούν αυτοί οι κοινοί μοριακοί μηχανισμοί, να ταυτοποιηθούν τα γονίδια που εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση των καρκινικών και των βλαστικών κυττάρων όπως επίσης και να αποκαλυφθούν οι διαφορές στην έκφραση αυτών των γονιδίων. Στόχος όλων αυτών είναι η ανακάλυψη νέων θεραπειών που θα στοχεύουν στη ρίζα του προβλήματος, που δεν είναι άλλη από τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα.

13 Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας
Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο δεύτερος συνηθέστερος τύπος καρκίνου στις γυναίκες μετά το καρκίνο του μαστού. Κάθε χρόνο υπολογίζεται ότι περίπου γυναίκες διαγιγνώσκονται παγκοσμίως με την πάθηση και περίπου αποβιώνουν, κυρίως στον αναπτυσσόμενο κόσμο. Στην Ελλάδα περίπου 1000 γυναίκες κάθε χρόνο εμφανίζουν καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στη συγκεκριμένη εργασία ασχοληθήκαμε με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, χρησιμοποιώντας την κυττραρική σειρά HeLa.

14 HPV ογκογόνος μετασχηματισμός
Σύμφωνα με μελέτες που έχουν γίνει, στο 90-99% των καρκινωμάτων του τραχήλου της μήτρας ανιχνεύεται το DNA των ιών HPV υψηλού κινδύνου. Έτσι, η προϋπόθεση του κυτταρικού μετασχηματισμού είναι η παρατεταμένη παραμονή όλου ή μέρους του ιϊκού γενώματος στο κύτταρο ξενιστή και η συνεχής έκφραση των πρώιμων ιϊκών γονιδίων. Η έκφραση αυτών των γονιδίων μεταβάλλει τη φυσιολογική λειτουργία των κυτταρικών γονιδίων και τις βιοχημικές οδούς μεταγωγής σημάτων που οδηγούν σε ανεξέλεγκτο και απεριόριστο πολλαπλασιασμό. Έτσι, η αλληλεπίδραση των Ε6 και Ε7 πρωτεϊνών με τις πρωτεΐνες κυτταρικής ρύθμισης p53 και pRB οδηγεί στην διάσπαση των φυσιολογικών ρυθμιστικών μηχανισμών με αποτέλεσμα τα σχετικά ογκοκατασταλτικά μονοπάτια να είναι δυσλειτουργικά και προάγουν την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρ’όλο που η μόλυνση με τον ιό HPV είναι απαραίτητη για δημιουργία καρκίνου, όμως πρέπει να υπάρχουν και άλλοι παράγοντες, ανάμεσα στους οποίους είναι το κάπνισμα, η διαφυγή από την ανοσολογική επιτήρηση, η ανοσοκαταστολή (λευχαιμίες, λεμφώματα, ανοσοκατασταλτικά φάρμακα), οι ορμονικές επιδράσεις, η πρώιμη έναρξη σεξουαλικών επαφών και η πολλαπλότητα σεξουαλικών συντρόφων.

15 Πρώιμη διάγνωση και καταπολέμηση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας
Πρώιμη διάγνωση και καταπολέμηση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας τεστ Παπανικολάου τεστ ΗPV τεστ για την ιϊκή πρωτεΐνη P16NK4A εμβόλια (Gardasil και Cervarix) χρήση των SCs

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

17 Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν:
να εκμεταλλευθούμε το τεράστιο δυναμικό των βλαστικών κυττάρων, χρησιμοποιώντας το απομονωμένο μέσο από AFSCs να αποδείξουμε την ανασταλτική επίδραση των ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από αμνιακό υγρό στα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας να προτείνουμε το μοριακό μηχανισμό της ανασταλτικής επίδρασης αυτής με προοπτική μελλοντική χρήση για τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Το απομονωμένο μέσο από AFSCs-δηλαδή το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονται τα SCs και το οποίο με βάση τη βιβλιογραφία περιέχει δραστικές ενεργητικές ουσίες

18 Βιολογικό υλικό Εβδομάδα κύησης: 17-20 Ηλικία γυναικών: 26-45 ετών
Ως βιολογικό υλικό χρησιμοποιήθηκε αμνιακό υγρό που ελήφθη από γυναίκες οι οποίες συμμετείχαν σε πρόγραμμα προγεννητικής διάγνωσης (Γ.Ν.Α “Αλεξάνδρα”, Α’ Μαιευτική – γυναικολογική κλινική πανεπιστημίου Αθηνών). Η λήψη έγινε με τη διαδικασία της αμνιοπαρακέντησης. Εβδομάδα κύησης: 17-20 Ηλικία γυναικών: ετών Όγκος δειγμάτων: 9-16 ml Αριθμός δειγμάτων: 21 Αμνιοπαρακέντηση

19 Καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού (AFSCs)
Αρχική καλλιέργεια Τα κύτταρα του αμνιακού υγρού καλλιεργούνται στο καλλιεργητικό υλικό «Stefanidis medium» (SM) (US Provisional Patent No60/853420): 1) 80% Α΄ stock: 83,5% Knockout D-MEM 12,5% Knockout Serum Replacement 2% Glutamax 1% MEM 1% Penicillin-Streptomycin 2) 20% Αμνιακό υγρό 3) 10μl b-FGF (basic-Fibroblast Growth Factor) ανά 15 ml καλλιεργητικού υλικού Τα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα από αμνιακό υγρό απαιτούν ένα στρώμα τροφοδοσίας από ινοβλάστες για να διαιρούνται συνεχώς χωρίς να διαφοροποιούνται, για αυτό το λόγο καλλιεργούνται σε ειδικά καλλιεργητικά μέσα με βάση το υποκατάστατο ορού εμπλουτισμένο με βασικό ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα (bFGF). Το βασικό συστατικό είναι το Knockout D-MEM το οποίο είναι σημαντικό για την καλλιέργεια των μη διαφοροποιημένων SCs και δρα αποτελεσματικότερα παρουσία Knockout Serum Replacement το οποίο βελτιστοποιεί την ανάπτυξη, διεγείρει την αυτο-ανανέωση και διατηρεί αδιαφοροποίητα τα SCs στην καλλιέργεια. Επίσης, είναι γνωστό ότι το σπουδαιότερο και βασικότερο από τα βιολογικά υγρά που χρησιμοποιούνται στη καλλιέργεια είναι ο ορός. Η χρήση του ορού παρουσιάζει ορισμένα προβλήματα με βασικότερο της πιθανής μόλυνσης των κυττάρων με μικροοργανισμούς ή ιούς που μπορεί να υπάρχουν στον ορό. Στη δικιά μας περίπτωση η παρουσία στο «Stefanidis medium» 20% ανθρώπινου αμνιακού υγρού ελαχιστοποιεί αυτούς τους κινδύνους και επιπλέον παρέχει όλες τις υπόλοιπες δραστικές ουσίες απαραίτητες για την ανάπτυξη ανθρώπινης προέλευσης κυττάρων in vitro εφόσον προέρχεται από τον ίδιο οργανισμό. Κύτταρα αμνιακού υγρού την 2η ημέρα καλλιέργειας. (Μεγέθυνση 10x)

20 Καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού (AFSCs)
Step up Είναι η διαδικασία αλλαγής θρεπτικού υλικού που πραγματοποιείται έπειτα από 6-8 ημέρες καλλιέργειας, όταν είναι εμφανής η παρουσία αποικιών ινοβλαστών Σκοπός: να γίνει μια μικρή αναζωογόνηση στα κύτταρα να αφαιρεθούν πιθανές τοξικές ουσίες από την καλλιέργεια Καλλιέργεια κυττάρων αμνιακού υγρού την 6η ημέρα καλλιέργειας. (Μεγέθυνση 10x)

21 Καλλιέργεια κυττάρων αμνιακού υγρού (AFSCs)
Ανακαλλιέργεια (χωρισμός, split) Η 1η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται την 10η -11η ημέρα όταν παρατηρείται η δημιουργία πιο πυκνών αποικιών ινοβλαστών και πάνω σ’ αυτά εμφανίζονται βλαστικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή επιτρέπει να κρατήσουμε τα SCs σε απενεργοποίημένη κατάσταση. Επαναλαμβάνεται κάθε 2-3 ημέρες καθώς τα κύτταρα διατηρούν την ίδια μορφολογία και αναπτύσσονται πολλά βλαστικά κύτταρα. Ο αριθμός των βλαστικών κυττάρων κυμαινόταν από 1-2 σε ένα τρυβλίο διαμέτρου 60 mm τις ημέρες 6-8 (στην αρχή τις καλλιέργειας) έως και τις ημέρες Καλλιέργεια κυττάρων αμνιακού υγρού τη 10η ημέρα καλλιέργειας. (Μεγέθυνση 10x) Τυπική εικόνα ενός AFSC το οποίο βρίσκεται πάνω σε αποικία ινοβλαστών μετά την ανακαλλιέργεια. (Μεγέθυνση 10x)

22 Απομόνωση του υπερκειμένου των βλαστικών κυττάρων (ΥSCs) ή απομονωμένου μέσου
Τα ΥSCs συλλέχτηκαν από καλλιέργειες των AFSCs που βρίσκονταν σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης Προτεραιότητα είχαν οι καλλιέργειες όπου υπήρχαν πολλά και υγιή βλαστικά κύτταρα (κύτταρα ανοιχτού χρώματος και όχι μαυρισμένα που πιθανόν ξεκίνησαν τη διαδικασία διαφοροποίησης) Η συλλογή του ΥSCs συνήθως συνέπιπται με τα στάδια ανακαλλιέργειας και κατάψυξης. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονται τα βλαστικά κύτταρα περιέχει δραστικές ουσίες οι οποίες αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Qiao et al., 2008). Τυπική εικόνα μιάς αποικίας AFSC που βρίσκεται πάνω σε στρώμα ινοβλαστών

23 Καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας
Χρησιμοποιήθηκε η ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά HeLa. Τα κύτταρα αυτά έχουν μορφολογία επιθηλίου και προέρχονται από την ασθενή Henrietta Lacks με αδενοκαρκίνωμα μήτρας. Τα κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε σταθερές συνθήκες του περιβάλλοντος στα εξής θρεπτικά μέσα: ♦ στο καλλιεργητικό υλικό Stock B (D-MEM εμπλουτισμένο με 10% FBS). ♦ σε υπερκείμενο των AFSCs: 100%, 50% και 20% ♦ στο SM (θρεπτικό υλικό για τις καλλιέργειες των AFSCs και το οποίο αποτελεί την βάση του ΥSCs) Το D-MEM (Dulbecco's modified Eagle medium) το οποίο με σύγκριση με το ΜΕΜ περιέχει 4 φορές μεγαλύτερες ποσότητες βιταμινών και αμυνοξέων, 2-4 φορές μεγαλύτερες ποσότητες γλυκόζης και επιπλέον περιέχει σίδερο, 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, fetal bovain serum) καθώς και αντιβιοτικά πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη.

24 Μέτρηση του αριθμού των κυττάρων HeLa
Η μέτρησητου αριθμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια: της χρωστικής κυανού του τρυπανίου 0,4% (Trypan Blue) που χρωματίζει κυανό το κυτταρόπλασμα των νεκρών κυττάρων της πλάκας Neubauer στην οποία τοποθετείται 1 σταγόνα εναιωρήματος κυττάρων και χρωστικής στη ειδική εσοχή κάτω από την καλυπτρίδα του φωτονικού μικροσκοπίου Olympus BX4. Πλάκα Neubauer (πάνω) και η μεγέθυνση του κεντρικού της τμήματος (κάτω)

25 Μέτρηση του αριθμού των κυττάρων HeLa
Ο αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε με βάση τον τύπο: αριθμός κυττάρων x x = αριθμός κυττάρων / ml σε μεγάλο τετράγωνο Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε με βάση τον τύπο: Ν ζωντ. / (Ν ζωντ. + Ν νεκ.) * 100%, όπου: Ν ζωντ. -είναι ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων, Ν νεκ. - είναι ο αριθμός των νεκρών κυττάρων.

26 Παρακολούθηση ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων
1ο στάδιο: Χρήση του ΥSCs από καλλιέργειες των AFSCs που βρίσκονταν στην 25η ημέρα ανάπτυξης (πολλά βλαστικά κύτταρα) Οι μετρήσεις συνοδεύονταν με ανακαλλιέργειες και αλλαγές θρεπτικών υλικών Συμπέρασμα: Το απομονωμένο μέσο από τα AFSCs (ΥSCs 100 %), αναστέλλει την ανάπτυξη και την επιβίωση της καρκινικής σειράς HeLa την πρώτη εβδομάδα καλλιέργειας in vitro Aνακαλλιέργεια συνοδευόταν με αλλαγή του θρεπτικού μέσου που εξασφάλιζε την προσθήκη των απαραίτητων θρεπτικών ουσιών και ταυτόχρονα την αφαίρεση των βλαβερών προϊόντων μεταβολισμού και των νεκρών κυττάρων. Συμπέρασμα: Το απομονωμένο μέσο 100% που συλλέχτηκε την 25η ημέρα καλλιέργειας των AFSCs, αναστέλλει την ανάπτυξη της καρκινικής σειράς HeLa την πρώτη εβδομάδα καλλιέργειας in vitro, γεγονός το οποίο επιβεβαίωσε το δημοσίευμα του Qiao για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων με την επίδραση του απομονωμένου μέσου από hMSCs (Qiao et. al., 2008). Υποθέτοντας ότι η ανασταλτική επίδραση του απομονωμένου μέσου από τα AFSCs οφείλεται σε κάποιες δραστικές ουσίες που προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα, στη συνέχεια θελήσαμε να δούμε αν θα υπάρχει αυτή η αναστολή στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων αν χρησιμοποιούσαμε διαφορετικές συγκεντρώσεις του υπερκειμένου των AFSCs Δείγμα Αριθμός κυττάρων / ml, M±m (x104) 1η μέρα 3η μέρα 5η μέρα 7η μέρα St.B (M) 110,67±35,3 233,33±18,90 393,33±39,67 212,67±53,54 ΥSCs 100% 80,67±7,57 102,00±9,17 142,67±9,24 153,33±12,55 Ποσοστό επιβίωσης,% Δείγμα 3η μέρα 5η μέρα 7η μέρα St.B (M) 79,04 86,06 90,87 94,81 ΥSCs 100% 97,19 91,38 86,75

27 Παρακολούθηση ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων
2ο στάδιο: Χρήση του ΥSCs 20% και 50% από καλλιέργειες του αμνιακού υγρού που βρίσκονταν στη 10η και 11η ημέρα ανάπτυξης (τα βλαστικά κύτταρα μόλις ξεκινάνε να εμφανίζονται) Οι μετρήσεις συνοδεύονταν με ανακαλλιέργειες και αλλαγές θρεπτικών υλικών Συμπέρασμα: Το απομονωμένο μέσο από τα AFSCs σε συγκεντρώσεις 20% και 50% παρουσίασε έλλειψη της αναστολής ανάπτυξης και επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων,γεγονός το οποίο οφείλεται στις ιδιότητές του Δεν υπάρχει μεγάλη διαφορά στην ανάπτυξη κυττάρων των διαφορετικών ομάδων, αλλά αυτό που είναι εμφανές είναι ότι η ομάδα-μάρτυρας είχε μικρότερο αριθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με τα μελετημένα δείγματα 50% και 20% ΥSCs Στη συγκεκριμένη περίπτωση έπαιξε ρόλο η έλλειψη των βλαστικών κυττάρων στις καλλιέργειες των AFSCs και επομένως και η έλλειψη των δραστικών παραγόντων που εκκρίνονται από αυτά. Το ιστόγραμμα επιβίωσης αναδεικνύει διεγερτική επίδραση του ΥSCs στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων HeLa έως και την 7η ημέρα καλλιέργειας Συμπέρασμα: Η χρήση του απομονωμένου μέσου που συλλέχτηκε από καλλιέργειες AFSCs την 10η και 11η ημέρα όταν τα βλαστικά κύτταρα μόλις ξεκινάνε να εμφανίζονται, που σημαίνει ότι δεν υπήρχαν και οι ανασταλτικές δραστικές ουσίες σε συγκεντρώσεις 20% και 50% είχαν ως αποτέλεσμα όχι μόνο την έλλειψη αναστολής ανάπτυξης αλλά αντίθετα τη μικρή διέγερση ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων HeLa από την 4η ημέρα και μετά. Η ανασταλτική επίδραση του ΥSCs από τα AFSCs στα HeLa κύτταρα εξαρτάται από την παρουσία και ποσότητα των SCs στην καλλιέργεια κυττάρων αμνιακού υγρού και ακολούθως από την παρουσία και ποσότητα των δραστικών ουσιών που πιθανώς ευθύνονται για την αναστολή αυτή. Η έλλειψη της αναστολής ανάπτυξης των κυττάρων HeLa οφείλεται όχι τόσο στις αραιώσεις όσο στις ιδιότητες του απομονωμένου μέσου, δηλαδή στην έλλειψη των βλαστικών κυττάρων στις κυτταροκαλλιέργειες αμνιακού υγρού και επομένως και στην έλλειψη των δραστικών παραγόντων που εκκρίνονται από αυτές. Μέχρι αυτό το σημείο μετρούσαμε τα ίδια κύτταρα τα οποία συλλέγαμε με τη διαδικασία τρυψινοποίησης, μέθοδος η οποία έχει δύο μειονεκτήματα: πρώτον, με κάθε συλλογή των κυττάρων μπορεί να χάνεται κάποιος αριθμός τους και δεύτερον, η τρυψίνη δρα αρνητικά στα κύτταρα εφόσον πέπτει την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στη μείωση της επιβίωσής τους. Δείγμα Αριθμός κυττάρων / ml, M±m (x104) 1η μέρα 4η μέρα 7η μέρα 9η μέρα St.Β (M) 20,00±0,00 68,67±10,26 326,00±8,72 566,00±62,86 ΥSCs 50% 105,33±24,03 409,33±46,06 772,00±64,37 ΥSCs 20% 120,00±14,42 409,33±16,65 702,00±64,28 Δείγμα Ποσοστό επιβίωσης,% 1η μέρα 4η μέρα 7η μέρα 9η μέρα St.Β (M) 87,00 76,87 86,24 93,40 ΥSCs 50% 94,05 94,61 94,07 ΥSCs 20% 89,11 92,19 91,72

28 Παρακολούθηση ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων
3ο στάδιο: Χρήση του ΥSCs 100% από καλλιέργειες με πολλά βλαστικά κύτταρα. Συνθήκες χωρίς υποβολή των κυττάρων σε επαναλαμβανόμενη τριψυνοποίηση Συμπέρασμα: Το απομονωμένο μέσο 100% από τα AFSCs είχε την ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μόνο την 7η και 10η ημέρα καλλιέργειάς τους, ενώ μέχρι την 3η ημέρα η επίδραση ήταν, αντιθέτως, διεγερτική Έχοντας αυτά υπόψη, στο επόμενο στάδιο προκειμένου να αποφύγουμε την τρυψινοποίηση, χρησιμοποιήσαμε τα 6-well για να έχουμε για κάθε μέτρηση άλλα κύτταρα, ενώ το απομονωμένο μέσο που μελετήσαμε, το συλλέξαμε από προχωρημένες καλλιέργειες των AFSCs με πολλά βλαστικά κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων HeLa καλλιεργημένων στο ΥSCs 100% την 3η ημέρα ήταν περίπου 2 φορές πιο υψηλός σε σύγκριση με το μάρτυρα. Αριθμός κυττάρων / ml Δείγμα M±m (x104) 1η μέρα 3η μέρα 7η μέρα 10η μέρα St.Β (M) 2,50±0,00 3,33±1,15 12,33±2,89 164,67±33,00 196,67±18,58 ΥSCs 100% 2,67±5,77 23,00±1,73 106,67±11,72 50,67±9,02

29 Μορφολογία των κυττάρων HeLa Είναι γνωστό ότι οι συνθήκες καλλιέργειας επηρεάζουν τον φαινότυπο κάθε είδους κυττάρων 1: τα κύτταρα HeLa στο Stock B στην αρχή της καλλιέργειας. 2: τα κύτταρα HeLa στο ΥSCs στην αρχή της καλλιέργειας. 3: τα κύτταρα HeLa στο Stock B την 6η μέρα καλλιέργειας. 4: τα κύτταρα HeLa στο 100% ΥSCs την 6η μέρα καλλιέργειας. 5: τα κύτταρα HeLa σε SM 6η μέρα καλλιέργειας 6: τα κύτταρα HeLa στο 50% ΥSCs την 6η μέρα καλλιέργειας 2 1 4 3 Επειδή σε κάθε σειρά πειραμάτων οι συνθήκες καλλιέργειας ήταν ίδιες, το μόνο που άλλαζε ήταν τα μέσα καλλιέργειας. Γι’ αυτό, η διαφορά στη μορφολογία θα μπορούσε να οφείλεται είτε σε κάποιους διαλυτούς παράγοντες που προέρχονται από τα AFSCs, είτε στο θρεπτικό υλικό. Η βάση του απομονωμένου μέσου από τα AFSCs ήταν το SM . Έτσι καλλιεργήσαμε τα HeLa κύτταρα στο SM και παρατηρήσαμε ότι η μορφολογία των κυττάρων ήταν παρόμοια με αυτή των κυττάρων HeLa καλλιεργημένων στο ΥSCs. Συμπεράναμε λοιπόν ότι η διαφορά στη μορφολογία των κυττάρων HeLa αποδίδεται στο SM και όχι σε κάποιους διαλυτούς παράγοντες που προέρχονται από τα AFSCs. 6 5

30 Παρακολούθηση ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων
4ο στάδιο: Χρήση του ΥSCs 100% και 50% από καλλιέργειες με πολλά βλαστικά κύτταρα. Συνθήκες χωρίς υποβολή των κυττάρων σε επαναλαμβανόμενη τριψυνοποίηση Συμπέρασμα: Το απομονωμένο μέσο 100% και 50% από τα AFSCs είχε την ανασταλτική επίδραση στην 1) ανάπτυξη και στην 2) επιβίωση των καρκινικών κυττάρων από την 6η ημέρα καλλιέργειάς τους και μετά Χρησιμοποιώντας την ίδια λογική με το προηγούμενο πείραμα, πραγματοποιήσαμε το επόμενο πείραμα όπου θέλαμε να μελετήσουμε την ανάπτυξη της καρκινικής σειράς HeLa, καλλιεργώντας την σε απομονωμένο μέσο από τις πρoχωρημένες καλλιέργειες των AFSCs με πολλά βλαστικά κύτταρα σε συγκεντρώσεις 100 και 50%. Όμως αυτή τη φορά χρησιμοποιήσαμε ως μάρτυρα HeLa κύτταρα καλλιεργημένα σε Stefanidis Medium. Το απομονωμένο μέσο είχε εντυπωσιακή ανασταλτική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα από την 6η ημέρα καλλιέργειας και μετά. Το ιστόγραμμα επιβίωσης παρουσιάζει υψηλά επίπεδα επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων HeLa καλλιεργημένων σε ΥSCs έως και την 6η ημέρα καλλιέργειας. Η πτώση της επιβίωσης κυττάρων παρατηρείτε μετά την 6η ημέρα καλλιέργειας των μελετημένων δειγμάτων Συμπέρασμα: Σε συνθήκες χωρίς υποβολή των κυττάρων σε επαναλαμβανόμενη τρυψινοποίηση, η χρήση του απομονωμένου μέσου 100% και 50% από τις προχωρημένες καλλιέργειες των AFSCs με πολλά βλαστικά κύτταρα, σε σύγκριση με δύο μάρτυρες Stock B και SM, είχε ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μετά την 6η-7η ημέρα καλλιέργειάς τους, ενώ την 1η-3η ημέρα η επίδραση ήταν αντιθέτως διεγερτική. Αριθμός κυττάρων / ml, Δείγμα M±m (x104) 1η μέρα 3η μέρα 6η μέρα 8η μέρα 10η μέρα SM (M) 5,00±0,00 8,67±1,53 38,66±9,02 91,33±12,01 259,00±34,77 410,67±53,27 ΥSCs 50% 14,33±5,69 30,67±11,55 90,33±11,15 74,67±12,09 72,00±5,29 ΥSCs 100% 11,33±5,13 43,33±15,53 77,67±8,50 88,00±5,29 129,33±11,55 Ποσοστό επιβίωσης,% Δείγμα 1η μέρα 3η μέρα 6η μέρα 8η μέρα SM (M) 84,91 86,67 95,08 92,56 92,50 ΥSCs 50% 95,55 95,83 94,75 71,11 ΥSCs 100% 94,44 97,01 95,49 76,30

31 Χαρακτηριστικά πειραμάτων Ανακαλλιέργειες και αλλαγή θρεπτικού υλικού
Συγκεντρωτικός πίνακας των αποτελεσμάτων ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων HeLa καλλιεργημένων σε ΥSCs Στάδια πειραμάτων Χαρακτηριστικά πειραμάτων 1 2 3 4 Αριθμός των κυττάρων 150000 200000 25000 50000 Συχνότητα μετρήσεων κάθε 2-3 ημ. κάθε 3 ημ. Ανακαλλιέργειες και αλλαγή θρεπτικού υλικού ναι όχι Μάρτυρας St.B SM ΥSCs 100% 20 %, 50% 100%, 50% Χαρακτηριστικά του ΥSCs πολλά SCs ελάχιστα SCs Αναστολή ανάπτυξης την 1η ημ. και μετά δεν υπάρχει την 7η ημ. και μετά την 6η ημ. και μετά Διέγερση ανάπτυξης την 4η ημ. και μετά 3η ημ 1η ημ. Πτώση επιβίωσης την 3η ημ. και μετά 1η ημ., 10η ημ Αύξηση επιβίωσης 3η ημ. 1η έως 6η

32 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
Δράση του ΥSCs Oct-4+ Dazl+ CSCs Διαφοροποίηση προς μη ογκογόνα καρκινικά κύτταρα Oct-4- Dazl- Καλλιέργεια των κυττάρων HeLa για 6 ημέρες σε YSCs 100% και το Stock B Απομόνωση ολικού RNA των κυττάρων HeLa (Qiaamp RNA Mini Kit) RT-PCR Στάδιο cDNA RT-PCR (Retroscript kit) Έτσι, έχοντας στα χέρια μας τα αποτελέσματα που αποδεικνύουν την ανασταλτική επίδραση του ΥSCs στα καρκινικά κύτταρα HeLa, προχωρήσαμε στο επόμενο στάδιο της μελέτης του μοριακού μηχανισμού της επίδρασης αυτής. Το ΥSCs από καλλιέργειες των AFSCs, με βάση τις προηγούμενες μελέτες μας, παρέχει σήματα αναστολής ανάπτυξης στα καρκινικά κύτταρα HeLa. Ό πιθανός τους στόχος θα μπορούσε να είναι τα CSCs που έχουν πολλές ομοιότητες με τα φυσιολογικά SCs. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα CSCs έχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και δίνουν αρχή σε άλλο κακοήθες βλαστικό καρκινικό κύτταρο ή μπορούν να υποστούν διαφοροποίηση εφόσον λάβουν το απαραίτητο βιολογικό σήμα από το περιβάλλον (στη δική μας περίπτωση το σήμα αυτό θα μπορούσε να προέρχεται από τις δραστικές ουσίες που βρίσκονται σε ΥSCs) και να δώσουν αρχή στα φαινοτυπικά ποικίλα μη ογκογόνα καρκινικά κύτταρα (Al-Hajj et al., 2004). Αυτό είναι πολύ σημαντικό επειδή εάν η αναστολή ανάπτυξης στα πειράματά μας οφείλεται στη διαφοροποίηση, γεγονός το οποίο θα μπορούσε να έχει μελλοντική χρήση ως «διαφοροποιητική θεραπεία» (Li και Neaves, 2006), τότε δεν θα είχαμε έκφραση των δεικτών βλαστικότητας, που θα σήμαινε ότι τα CSCs δεν αυτο-ανανεώνονται αλλά διαφοροποιούνται, ενώ παραμένει μία άλλη ομάδα πρόδρομων κυττάρων που γρήγορα πολλαπλασιάζονται για κάποιο χρονικό διάστημα μέχρι να εξαντλήσουν το δυναμικό του πολλαπλασιασμού τους (Reya et al., 2001).

33 Το αποτέλεσμα της RT-PCR
St.B YSCs Oct-4 Dazl Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2% δεικτών Oct-4 και Dazl στα κύτταρα HeLa καλλιεργημένα σε YSCs και St.B μετά από αντίδραση RT-PCR   Η ανακάλυψη των CSCs έχει μεγάλη σημασία στην Ιατρική επιστήμη, επειδή είναι υπευθυνα για τη δημιουργία του καρκίνου. Για το λόγο αυτό, τα CSCs πρέπει να αποτελέσουν τον στόχο μελέτης, ταυτοποίησης και έπειτα και ανάπτυξης θεραπειών που να τα στοχεύουν. Επειδή οι δείκτες Oct-4 και Dazl είναι χαρακτηριστικοί για τα πλειοδύναμα φυσιολογικά και καρκινικά βλαστικά κύτταρα, η έκφρασή τους υποδεικνύει την παρουσία στην καλλιέργεια των HeLa κυττάρων μιας ξεχωριστής ομάδας κυττάρων των CSCs με ικανότητα αυτο-ανανέωσης, γεγονός το οποίο ταυτόχρονα αποκλείει την υπόθεση διαφοροποίησης.

34 Προσδιορισμός φάσης του κυτταρικού κύκλου με FACS
Στη συνέχεια σκεφτήκαμε να ερευνήσουμε σε ποιές φάσεις του κύκλου των κυττάρων συνέβαιναν οι αλλαγές. Είναι γνωστό ότι στις καλλιέργειες κυττάρων το κάθε κύτταρο ακολουθεί το δικό του ρυθμό ανάπτυξης και ακολούθως βρίσκεται και σε διαφορετική φάση του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση FACS μας βοήθησε να συγκρίνουμε την κατανομή του κυτταρικού πληθυσμού στα κύτταρα HeLa καλλιεργημένα σε YSCs 100% σε σχέση με τα κύτταρα HeLa που καλλιεργήθηκαν σε Stock B (μάρτυρας) και να εντοπίσουμε τις μεταβολές. Καλλιέργεια των κυττάρων HeLa για 7 ημέρες σε YSCs 100% και το Stock B Aπομονώση των κυττάρων και χρώση του γενετικού τους υλικού με προσθήκη ιωδιούχου προπινιδίου με βάση το πρωτόκολλο. Πραγματοποιήση μελέτης των φάσεων του κυτταρικού κύκλου στο μηχάνημα Beckman Coulter CXP500 Flow cytometer

35 Αποτέλεσμα προσδιορισμού φάσης του κυτταρικού κύκλου με FACS
St.B (Μ) ΥSCs 100% Δείγμα Φάση του κυτταρικού κύκλου G0/G1,% S,% G2/M,% Μάρτυρας 51,3 25,5 18,4 ΥSCs 100% 57,3 18,8 19,6 Στο ιστόγραμμα η πρώτη μεγαλύτερη κορυφή αντιστοιχεί στα G0/G1 κύτταρα που έχουν μικρό μέγεθος και το γενετικό τους υλικό είναι 2n, η δεύτερη στα G2/M κύτταρα που έχουν μεγάλο μέγεθος και το γενετικό τους υλικό έχει διπλασιαστεί (4n) και η μεταξύ τους περιοχή αντιστοιχεί στα κύτταρα που βρίσκονται στην S φάση. Πρόσθετες κορυφές δείχνουν την ύπαρξη ανευπλοειδών πληθυσμών. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης FACS για προσδιορισμό φάσης του κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa καλλιεργημένα για 7 ημέρες σε YSCS 100% παρουσίασαν εμφανή αύξηση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, το οποίο υποδεικνύει ότι υπάρχουν κάποιες ουσίες που πιθανώς προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα οι οποίες δεν επιτρέπουν την διέγερση των κυττάρων για είσοδο σε φάση S. Τα αποτελέσματα της FACS ανάλυσης φάσης του κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa καλλιεργημένα σε YSCs των AFSCs παρουσίασαν μείωση της φάσης S κατά 6,7% και και αύξηση της φάσης G0/ G1 κατά 6% σε σύγκριση με το μάρτυρα (HeLa σε Stock B) , γεγονός το οποίο υποδεικνύει την αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/ G1 .

36 Προτεινόμενο μοντέλο αρνητικής ρύθμισης ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων HeLa σε συνθήκες καλλιέργειάς τους στο ΥSCs Απομονωμένο μέσο από τα AFSCs Δραστικές ανασταλτικές ουσίες Καλλιέργεια κυττάρων HeLa Αναστολή ανάπτυξης Αύξηση αριθμού των νεκρών κυττάρων Πτώση επιβίωσης Η αλληλεπίδραση με το μικροπεριβάλλον παίζει καθοριστικό ρόλο στην εξισορρόπηση μεταξύ αυτο-ανανέωσης, διαφοροποίησης και, παρέχοντας σήματα αναστολής πολλαπλασιασμού, παίζει σημαντικό ρόλο στην καταστολή του κακοήθους φαινοτύπου και ακολούθως στην πρόληψη της καρκινογένεσης και θεραπεία του καρκίνου (Qiao et al., 2008 και Postovit et al., 2008). Κατανοώντας το κύκλωμα της σηματοδότησης στα κύτταρα αυτά θα μπορούσαμε να αποκτήσουμε μία λεπτομερή γνώση για τους μοριακούς μηχανισμούς της καρκινογένεσης. Το ΥSC από καλλιέργεια των AFSCs το οποίο με βάση τις προηγούμενες μελέτες μας, παρέχει σήματα αναστολής ανάπτυξης στα καρκινικά κύτταρα HeLa. Ό πιθανός τους στόχος θα μπορούσε να είναι τα CSCs που έχουν ίδια χαρακτηριστικά με τα φυσιολογικά SCs. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα CSCs έχουν την δυνατότητα για αυτο-ανανέωση και δίνουν αρχή σε άλλο κακοήθες βλαστικό καρκινικό κύτταρο ή μπορούν να υποστούν διαφοροποίηση, εφόσον λάβουν το απαραίτητο βιολογικό σήμα από το περιβάλλον (στη δικιά μας περίπτωση το σήμα αυτό θα μπορούσε να προέρχεται από τις δραστικές ουσίες από το ΥSCs) και να δώσουν αρχή στα φαινοτυπικά ποικίλα μη ογκογόνα καρκινικά κύτταρα (Al-Hajj et al., 2004). Αυτό είναι πολύ σημαντικό επειδή εάν η αναστολή ανάπτυξης στα πειράματά μας οφείλεται στην διαφοροποίηση (γεγονός το οποίο θα μπορούσε να έχει μελλοντική χρήση ως «διαφοροποιητική θεραπεία» Αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1 Διαφοροποίηση των CSCs

37 Γενικά συμπεράσματα Το ΥSCs 100% που συλλέχτηκε την 25η ημέρα καλλιέργειας από τα AFSCs , αναστέλλει την ανάπτυξη της καρκινικής σειράς HeLa την πρώτη εβδομάδα καλλιέργειας in vitro, γεγονός το οποίο επιβεβαίωσε το δημοσίευμα του Qiao για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων με την επίδραση του απομονωμένου μέσου από hMSCs (Qiao et. al., 2008). Η χρήση του ΥSCs που συλλέχτηκε από καλλιέργειες AFSCs την 10η και 11η ημέρα όταν τα βλαστικά κύτταρα μόλις ξεκινάνε να εμφανίζονται, που σημαίνει ότι δεν υπήρχαν και οι ανασταλτικές δραστικές ουσίες σε συγκεντρώσεις 20% και 50% είχαν ως αποτέλεσμα όχι μόνο την έλλειψη αναστολής ανάπτυξης αλλά αντίθετα τη μικρή διέγερση ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων HeLa από την 4η ημέρα και μετά. Η ανασταλτική επίδραση του ΥSCs από τα AFSCs στα HeLa κύτταρα εξαρτάται από την παρουσία και ποσότητα των SCs στην καλλιέργεια των κυττάρων αμνιακού υγρού και ακολούθως από την παρουσία και ποσότητα των δραστικών ουσιών που πιθανώς ευθύνονται για την αναστολή αυτή.

38 Γενικά συμπεράσματα Η έλλειψη της αναστολής ανάπτυξης των κυττάρων HeLa οφείλεται όχι τόσο στις αραιώσεις όσο στις ιδιότητες του απομονωμένου μέσου, δηλαδή στην έλλειψη των βλαστικών κυττάρων στις κυτταροκαλλιέργειες αμνιακού υγρού και επομένως και στην έλλειψη των δραστικών παραγόντων που εκκρίνονται από αυτές. Σε συνθήκες χωρίς υποβολή των κυττάρων σε επαναλαμβανόμενη τρυψινοποίηση, η χρήση του απομονωμένου μέσου 100% και 50% από τις προχωρημένες καλλιέργειες των AFSCs με πολλά βλαστικά κύτταρα, σε σύγκριση με δύο μάρτυρες Stock B και SM, είχε ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μετά την 6η -7η ημέρα καλλιέργειάς τους, ενώ την 1η-3η ημέρα η επίδραση ήταν αντιθέτως διεγερτική. Η μορφολογία των κυττάρων HeLa (εμφάνιση προσεκβολών) καλλιεργημένων στο ΥSCs από αμνιακό υγρό αποδίδεται στο SM και όχι σε διαλυτούς παράγοντες προερχόμενους από τα AFSCs.

39 Γενικά συμπεράσματα H ανάλυση της RT-PCR των κυττάρων HeLa καλλιεργημένων για 6 ημέρες σε YSCs 100% και σε Stock B (μάρτυρας) φανέρωσε την έκφραση τόσο του Oct-4 όσο και του Dazl. Αυτό αποδεικνύει την παρουσία στην καλλιέργεια των CSCs με ικανότητα αυτο-ανανέωσης, γεγονός το οποίο ταυτόχρονα αποκλείει την υπόθεση διαφοροποίησης και τη χρήση του YSCs ως «διαφοροποιητική θεραπεία» του καρκίνου. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης FACS για προσδιορισμό φάσης του κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι τα κύτταρα HeLa καλλιεργημένα για 7 ημέρες σε YSCs 100% παρουσίασαν εμφανή αύξηση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, το οποίο υποδεικνύει ότι υπάρχουν κάποιες ουσίες που πιθανώς προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα οι οποίες δεν επιτρέπουν την είσοδο των κυττάρων στη φάση S.

40 Μελλοντικές προοπτικές
Διερεύνηση των μηχανισμών και εύρεση των μορίων που εμπλέκονται στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1 (αναστολείς του κυτταρικού κύκλου) και που επηρεάζονται από την επίδραση του απομονωμένου μέσου από τα AFSCs Έλεγχος εμπλοκής των εξής παραγόντων E6 E7 Rb p53

41 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερμά όλους όσους συνέβαλαν στη διεκπεραίωση αυτής της διπλωματικής εργασίας: τον Λ. Μαργαρίτη, Καθηγητή Τομέα Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών, Υπεύθυνος του ΜΔΕ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» τον Δ. Λουτράδη, Καθηγητή Ιατρικής Σχολής, Τομέας Υγείας Μητέρας-Παιδιού, Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική «Αλεξάνδρα» Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Αθηνών (Επιβλέπων) την Β. Αλεπόρου, Αναπληρώτρια καθηγήτρια, Τομές Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών (μέλος της Τριμελούς Εξεταστικής επιτροπής) τον Κ. Στεφανίδη, Λέκτορα, Εργαστήριο Αναγεννητικής Ιατρικής & Αναπαραγωγικής Βιολογίας, Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική Παν/μίου Αθηνών (Επιστημονικός υπεύθυνος)

42 Ευχαριστίες Όλη την ερευνητική ομάδα του εργαστηρίου:
την Β. Ντινοπούλου, βιολόγο, την Β. Αναστασιάδου, μαιευτήρα-γυναικολόγο, την Β. Μαίστρου, βιολόγο, την Π. Λέκκα και την Β. Ελένη, απόφοιτες της Ιατρικής σχολής, την Α. Μπλέτσα, μαία-εμβρυολόγο, τον Γ. Παρτσινέβελο και την Ε. Αραμπατζή, ειδικευόμενους ιατρούς Το προσωπικό της Α΄ Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική «Αλεξάνδρα» : την Β. Μπάκα, την Δ. Μαλτέζου, την Α. Σοφού και την Χ. Μάρα Τους συνεργάτες του φορέα κυτταρομετρίας ροής την Ε. Αναστασιάδου, μοριακό βιολόγο, την Α. Θανασοπούλου, βιολόγο και τον Π. Μπερέτσο, βιολόγο Όλους τους συμφοιτητές μου όλη την ερευνητική ομάδα του εργαστηρίου για το φιλικό περιβάλλον που δημιούργησε και το οποίο επέδρασε πολύ θετικά στην διεκπεραίωση αυτής της εργασίαςς και όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωσή της. Συγκεκριμένα:

43 Βιβλιογραφία Alison M.R., Murphy G. and Leedham S. (2008) Stem cells and cancer: a deadly mix. Cell Tissue Res 331:109–124 . Al-Hajj M., Becker M. W., Wicha M., Weissman I. and Clarke M. F. (2004) Therapeutic implications of cancer stem cells. Curr Opin Genet Dev. Feb;14(1):43-7. Baum C.M., Weissman I.L., Tsukamoto A.S., Buckle A.M. and Peault (1992) Isolation of a candidate human hematopoietic stem cell population. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89, Bongso A, Fong C.Y., Ng S.C., Ratnam S. (1994) Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum Reprod. Nov; 9(11): Behbod F. and Rosen J.M. (2004) Will cancer stem cells provide new therapeutic targets? Carcinogenesis vol.26 no.4: 703—711. Bonnet D. and Dick J.E. (1997) Human myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Med. 3, Chen L, Shen R, Ye Y., Pu XA, Liu X, Duan W. et al. (2007) Precancerous stem cells have the potential for both benign and malignant differentiation. PLoS ONE. Mar 14;2(3):e293. Cogle C.R., Guthrie S.M., Sanders R.C., Allen W.L., Scott E.W. and Petersen B.E. (2003) An overview of stem cell research and regulatory issues. Mayo Clin Proc.; 78: De Coppi P., Bartsch G., Siddiqui M., Xu T., Santos C.,perin L., Mostoslavsky G., Serre A., Snyder E., Yoo J., Furth M., Soker S. And Atala A. (2007) Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nature Biotecnology v25, Jan 1: Fletcher J.M., Ferrier P.M., Gardner J.O., Harkness L., Dhanjal S., Serhal P., Harper J., Delhanty J., Brownstein DG., Prasad YR., Lebkowski J., Mandalam R., Wilmut I. and De Sousa PA. (2006) Variations in humanized and defined culture conditions supporting derivation of new human embryonic stem cell lines. Cloning Stem Cells,8 (4): Gey G.O., Coffman W.D., Kubicek M.T. (1952) Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium. Cancer Res., 12: Gosden CM. (1983) Amniotic fluid cell types and culture. British Medical Bulletin, 39:

44 Βιβλιογραφία Hengstschlàger M. and Prusa R., (2002) Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit., 8: Kondo T. (2007) Stem cell-like cancer cells in cancer cell lines. Cancer Biomark;3(4-5): Kondo T., Setoguchi T., Taga T. (2004) Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. PNAS, January 20, vol. 101, no. 3, 781–786. Masters J.R. (2002) HeLa cells 50 years on: the good, the bad and the ugly. Nature Reviews Cancer 2: Mosquer A., Fernandez J.L., Campos A., Goyanes V.J., Ramiro-Diaz J.R. and Gosalvez J. (1999) Simultaneous decrease of telomere length and telomerase activity with ageing of human amniotic fuid cells. J. Med Genet., 36, Prétet J.L., Charlot J.F., Mougin C.. (2007) Virological and carcinogenic aspects of HPV. Bull Acad Natl Med. Mar;191(3): Prusa A.-R., Marton E., Rosner M., Bernaschek G. and Hengstschlager M. (2003) Oct-4-expressing cells in human amniotic fuid: a new source for stem cell research? Human Reproduction Vol.18, No.7 pp Popescu N.C., DiPaolo J.A., Amsbaugh S.C. (1987) Integration sites of human papillomavirus 18 DNA sequences on HeLa cell chromosomes. Cytogenet. Cell Genet., 44: Qiao L., Zhao T., Wang F., Shan C., Ye L., and ZHANG X. (2008) NF -κB downregulation may be involved the depression of tumor cell proliferation mediated by human mesenchymal stem cells. Acta Pharmacol Sin, Mar; 29 (3): 333–340. Reich O., Pickel H., Regauer S. (2008) Why do human papillomavirus infections induce sharply demarcated lesions of the cervix? J Low Genit Tract Dis. Jan;12(1):8-10 Roubelakis MG, Pappa KI, Bitsika V, Zagoura D, Vlahou A, Papadaki HA, Antsaklis A, Anagnou NP. (2007) Molecular and proteomic characterization of human mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid: comparison to bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. Dec;16(6):

45 Βιβλιογραφία Sell S. (2004) Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. Crit.Rev. Oncol. Hematol., 51, 1-28. Siegel N., Rosner M., Hanneder M., Valli A., Hengstschläger M. (2007) Stem cells in amniotic fluid as new tools to study human genetic diseases. Stem Cell Rev, 3:256–264. Stefanidis K. A novel stem cell culture medium capable of supporting growth of human amniotic fluid stem cells and germ stem cells. U.S. Provisional Patent Application No60/ Stefanidis K., Loutradis D., Anastasiadou V., Bletsa R., Kiapekou E., Drakakis P., Beretsos P., Elenis E., Mesogitis S., Antsaklis A. (2008) Oxytocin receptor- and Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid. Gynecol Endocrinol. May;24(5):280-4. Stefanidis K., Loutradis D., Anastasiadou V., Dinipoulou V., Eleni E., Arampatzi E., Lekka K., Mesogitis S., Antsaklis A. (2009) Bidirectional Communication between Neural and Cardiac Cells in Human Amniotic Fluid. Fetal Diagn. Ther, Feb 6;25(1):62-66. Stefanidis K., Loutradis D., Koumbi L., Anastasiadou V., Dinopoulou V., Kiapekou E., Lavdas A.A., Mesogitis S., Antsaklis A. (2008) Deleted in Azoospermia-Like (DAZL) gene-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for germ cells research? Fertil Steril., Sep;90(3): Stefanidis K., Loutradis D., Vassiliou L.V., Anastasiadou V., Kiapekou E., Nikas V., Patris G., Vlachos G., Rodolakis A., Antsaklis A. (2008) Nevirapine induces growth arrest and premature senescence in human cervical carcinoma cells. Gynecol Oncol., Nov;111(2): Epub Sep 26. Setoguchi T., Taga T., Kondo T. (2004) Cancer Stem Cells Persist in Many Cancer Cell Lines. Cell Cycle, April, 3:4, Trosko J.E. (2006) From adult stem cells to cancer stem cells. Oct-4 gene, cell–cell communication, and hormones during tumor promotion. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1089: 36–58.