1 NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού.

Παρουσίαση με θέμα: "1 NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 1 NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού

2 2 NMR Μέθοδος προσδιορισμού δομής μορίων και βιολογικών μακρομορίων Ιδιοστροφορμή (spin) πυρήνων συγκεκριμένων ισοτόπων των στοιχείων Περιττος ατομικός αριθμός Υδρογόνο 1 Η Άνθρακας 13 C Άζωτο 15 N Φώσφορος 31 Ρ Μαγνητικό πεδίο  μαγνητικό δίπολο

3 3 NMR Προσανατολισμός πυρήνων με δύο τρόπους: παράλληλα (υψηλή ενέργεια) ή αντιπαράλληλα (χαμηλή ενέργεια) με τη διεύθυνση του πεδίου Ενεργειακή διαφορά μεταξύ των δύο προσανατολισμών Αριθμός πυρήνων που υιοθετούν τον ≠ που υιοθετούν τον ένα προσανατολισμό άλλο προσανατολισμό Η διαφορά των πληθυσμών κυμαίνεται σε κλίμακα «μέρη στο εκατομμύριο» ppm για τους πυρήνες υδρογόνου (1Η)

4 4 NMR Η διαφορά των ενεργειακών καταστάσεων είναι πολύ μικρή Δυνατότητα μετάπτωσης από τη μια ενεργειακή κατάσταση στην άλλη Κατάλληλη ακτινοβολία Ραδιοσυχνότητα Συντονισμός (resonance) συχνότητας ιδιοστροφορμής με εξωτερική ραδιοσυχνότητα Διέγερση πυρήνων Αποδιέγερση πυρήνων και επαναφορά τους στην αρχική κατάσταση Εκπομπή ακτινοβολίας σε συγκεκριμένη συχνότητα Ανίχνευση, μετασχηματισμός και μέτρηση της ακτινοβολίας

5 5 Μετασχηματισμός Fourier Μαθηματικός τύπος για μετασχηματισμό συνάρτησης χρόνου σε συνάρτηση συχνότητας

6 6 Μετασχηματισμός Fourier

7 7 FID – Free induction decay

8 8 NMR Η συχνότητα εκπομπής εξαρτάται από το είδος του πυρήνα Διαφορετική συχνότητα για το 1 Η και διαφορετικό για τον 13 C από τους πυρήνες με τους οποίους είναι συνδεδεμένο Διαφορετική συχνότητα για το Η του CH 2 από ότι το Η του CH 3 ή ΟΗ από το μικροπεριβάλλον του πυρήνα Διαφορετική συχνότητα για το CH 3 μιας Ala από το CH 3 μιας Leu

9 9 Μονοδιάστατο NMR φάσμα Σύγκριση συχνότητας συντονισμού με πρότυπο μόριο τετραμεθυλοσιλάνιο Si(CH 3 ) 4 ή ΤΜS) Chemical shift – ppm – άξονας χχ’ – μονοδιάστατα φάσματα Ένας πυρήνας - Έστω πρωτόνιο ( 1 Η) Ίδιο περιβάλλον μεταξύ των πρωτονίων κάθε ένωσης Μια κορυφή στο φάσμα

10 10 Μονοδιάστατο NMR φάσμα Διαφορετικός πυρήνας 13 C Αριθμός κορυφών αντίστοιχος με τον αριθμό μικροπεριβαλλόντων Διαφορετικά περιβάλλοντα για τα πρωτόνια CH 3, CH 2, OH Τρεις διαφορετικές συχνότητες

11 11 Μονοδιάστατο NMR φάσμα

12 12 NMR

13 13 NMR πρωτεϊνών

14 14 CFP ESAT complex NMR πρωτεϊνών Μονοδιάστατο φασμα Στοιχεία για την αναδίπλωση της πρωτεΐνης Πολύπλοκο φάσμα Μεγάλη αλληλοεπικάλυψη Αδυναμία ερμηνείας φάσματος Επέκταση πειραμάτων σε περισσότερες διαστάσεις (2, 3, 4) Συσχετισμοί μεταξύ διαφορετικών ατόμων (του ίδιου ή διαφορετικού πυρήνα)

15 15 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα COSY και TOCSY Συμμετρικά φάσματα (διαγώνια συμμετρία) Η διαγώνιος είναι το μονοδιάστατο φάσμα Συσχετισμοί μεταξύ των ατόμων της διαγωνίου Στο COSY φάσμα μιας πρωτεΐνης υπάρχουν πολλές κορυφές που υποδηλώνουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτονίων που χωρίζονται από 1-3 δεσμούς Κάθε αμινοξύ εμφανίζει διαφορετικό φάσμα λόγω διαφορετικών ομοιοπολικών συνδέσεων Ομοίως στο TOCSY, με τη διαφορά ότι φαίνονται συσχετισμοί μεταξύ όλων των πρωτονίων Ταυτοποίηση ειδών αμινοξέων στις διάφορες κορυφές

16 16 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα COSY Συσχετισμοί μεταξύ ομοιοπολικά συνδεδεμένων πρωτονίων (2-3 δεσμοί) (Through-bond) Συσχετισμοί μεταξύ υδρογόνων OH και CH 2 Συσχετισμοί μεταξύ υδρογόνων CH 3 και CH 2 Απουσία συσχετισμών μεταξύ υδρογόνων CH 3 και OH (παρουσία στο TOCSY) CH 3 CH 2 OH CH 3 CH 2 OH

17 17 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα www.bp.uni-bayreuth.de/NMR/

18 18 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα www.bp.uni-bayreuth.de/NMR/

19 19 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα www.bp.uni-bayreuth.de/NMR/

20 20 NOESY – Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy Συσχετισμοί μεταξύ πρωτονίων που βρίσκονται κοντά στο χώρο (Through-space) Τα αμινοξέα δεν είναι απαραίτητο να βρίσκονται κοντά σε επίπεδο αλληλουχίας Ένδειξη (πολύ προκαταρκτική) της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης Συσχετισμός μεταξύ πρωτονίων που απέχουν μέχρι 5Å NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα

21 21 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα

22 22 NMR πρωτεϊνών – δισδιάστατα φάσματα

23 23 NMR σε τρεις διαστάσεις Επέκταση του πειράματος και σε τρίτη διάσταση Μείωση αλληλεπικάλυψης Αύξηση ακρίβειας στην τεχνική Ευκολότερη (...) διαδικασία

24 24 Συνδυασμός COSY και NOESY Τα δύο αυτά φάσματα αλληλοσυμπληρώνονται Πληροφορίες για το συσχετισμό σήματος-αμινοξέος Πληροφορίες για δίεδρες γωνίες (φ) Πληροφορίες για αμινοξέα που βρίσκονται κοντά στο χωρο Πληροφορίες για αποστάσεις μεταξύ των αμινοξέων Προσδιορισμός δευτεροταγούς δομής Περιορισμοί στον αριθμό των τριτοταγών δομών που θα μπορούσαν να ικανοποιούν όλες τις παραπάνω συνθήκες ταυτόχρονα ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΟΜΗΣ

25 25 Προσδιορισμός δομής Υπολογισμός δομής από προγράμματα Μεγαλύτερος αριθμός των παραμέτρων που έχουν προσδιοριστεί (κυρίως αποστάσεων μέσω NOEs)  Μεγαλύτερος περιορισμός στις πιθανές δομές  Ακριβέστερος προσδιορισμός της τελικής δομής

26 26 Πολύ δύσκολος ο προσδιορισμός δομής για πρωτεΐνες >10kD Πολύπλοκα φάσματα Αδυναμία εντοπισμού αλληλεπιδράσεων Επέκταση σε δεύτερη διάσταση χρησιμοποιώντας διαφορετικό ισότοπο Ενσωμάτωση 15 N ή 13 C (πρωτεΐνες) ή άλλου ισοτόπου Συντονισμός Ν-Η ή C-Η Πειράματα διπλού συντονισμού 15 Ν ή 13 C 1Η1Η Περιορισμοί στις δυνατότητες των πειραμάτων που χρησιμοποιούν ένα είδος πυρήνα (homonuclear) (1H)

27 27 HSQC Heteronuclear signle-quantum correlation Δισδιάστατο φάσμα με 1 H στον ένα άξονα και 13 C ή 15 N στον άλλο 15 N- 1 Η-HSQC είναι ίσως το πιο συχνό φάσμα που λαμβάνεται στο NMR Αλληλεπίδραση Η και Ν ΝΗ πεπτιδικού δεσμού για όλα τα αμινοξέα της πρωτεΐνης (εκτός προλίνης) Δακτυλικό αποτύπωμα της πρωτεΐνης (σήμα=αμινοξύ) Λήψη ενός καλού HSQC σηματοδοτεί συνήθως την έναρξη της περαιτέρω ανάλυσης του φάσματος Προσδιορισμός της δομής

28 28 HSQC

29 29 Πειράματα διπλού συντονισμού Αναδίπλωση πρωτεΐνης

30 30 Αντιστοίχιση σήματος στο αμινοξύ από το οποίο προήλθε Περισσότερα πειράματα Μεταφορά ενέργειας από το ένα αμινοξύ (spin system) στο άλλο Επέκταση σε τρίτη διάσταση με τρίτο ισότοπο ( 13 C) 15 Ν- 1 Η-HSQC

31 31 Πειράματα τριπλού συντονισμού Προσθήκη τρίτης διάστασης με τρίτο ισότοπο ( 13 C) Κάθε κορυφή (αλληλεπίδραση) χαρακτηρίζεται από τρεις συντεταγμενες Χ-Υ-Ζ  Η-C-N

32 32 Πειράματα τριπλού συντονισμού Ζεύγη πειραμάτων Συσχετισμός ατόμων μεταξύ του ιδίου αμινοξέος (intra-residue) ή μεταξύ διαδοχικών αμινοξέων (inter-residue ή sequential) HNCA και HNCOCA CBCANH και CBCACONH Συσχετισμός αλυσίδας …NH-CH-CONH-CH-CO… της πρωτεΐνης Οι πλευρικές αλυσίδες βρίσκονται με τρισδιάστατες μεθόδους που βασίζονται σε NOESY και TOCSY πειράματα

33 33 HNCA Δύο κορυφές 1 H (i), 13 Cα (i), 15 N (i), 1 H (i), 13 Cα (i-1), 15 N (i) HN(CO)CA Μια κορυφή 1 H (i), 13 Cα (i-1), 15 N (i) HNCA και HNCOCA

34 34 CBCANH 4 κορυφές 1 H (i), 13 Cα (i), 15 N (i), 1 H (i), 13 Cα (i-1), 15 N (i) 1 H (i), 13 Cβ (i), 15 N (i), 1 H (i), 13 Cβ (i-1), 15 N (i) CBCA(CO)NH 2 κορυφές 1 H (i), 13 Cα (i), 15 N (i), 1 H (i), 13 Cα (i-1), 15 N (i) CBCANH και CBCA(CO)NH

35 35 N C C H H O H C H R1R1 R2R2 N C C H H O H C H R3R3 R4R4 Figure 5.4: Sequential assignment of proteins using CBCANH and CBCA(CO)NH experiments. Shown as spectra is only the CBCANH experiment. The CBCA(CO)NH is used to deduce which peaks are sequential and which are intraresidue. 1H1H 15 N 13 C CBCANH και CBCA(CO)NH

36 36 Αντιστοίχιση σήματος/αλληλουχίας (Sequential assignment)

37 37 X  X  A  S/T  G Αντιστοίχιση σήματος/αλληλουχίας

38 38 Αντιστοίχιση σήματος/αλληλουχίας

39 39 Αντιστοίχιση κάθε σήματος στο αμινοξύ και στο άτομο από το οποίο προέρχεται Το πρώτο βήμα στον προσδιορισμό της δομής Περισσότερα πειράματα (NOESY) Περιορισμοί απόστασης (1,8-6 Å) ανάλογα με την ένταση της κορυφής Περιορισμοί στις γωνίες φ, ψ των αμινοξέων Προσδιορισμός δομής

40 40 Αλληλεπίδραση με μόρια προσδέτες (υπόστρωμα, υποδοχέας) Μετακίνηση κορυφών στο HSQC Σύγκριση φασμάτων πρίν και μετά την προσθήκη του μορίου-προσδέτη

41 41